Biochemische Charakterisierung der Zyklin-abhängigen Kinase 2,Aktivator-Komplexe des Parasiten Eimeria tenella sowie deren Nutzung in der Wirkstoffforschung

Der Stamm der Apicomplexa ist eine artenreiche Gruppe, der einzellige, meist obligat intrazelluläre Parasiten angehören, darunter auch erstzunehmende Krankheitserreger wie Plasmodium sp. sowie tierpathogene Vertreter wie Eimeria sp. und Theileria sp. Eimeria sp. verursacht die Kokzidiose beim Huhn. Diese Krankheit bedingt weltweite Verluste in der Geflügelindustrie von etwa 3 Milliarden US$ pro Jahr [DALLOUL & LILLEHOJ, 2006; SHIRLEY et al., 2007; LUCIUS & LOOS-FRANK, 2008]. Die Parasiten weisen eine hohe Resistenzbildungsrate gegen vorhandene Wirkstoffe auf. Zudem ist der Einsatz von Vakzinen mit Nebenwirkungen verbunden und für hohe Produktionskosten verantwortlich. Daher ist die Entwicklung von neuen, kostengünstigen und effektiven Kokzidiostatika eine dringend notwendige Herausforderung [KINNAIRD et al., 2004]. rnAuf Grund ihrer essentiellen, regulatorischen Funktion im eukaryotischen Zellzyklus sind Zyklin-abhängige Kinasen (CDKs) validierte Zielproteine [LEHNINGER et al., 2005]. Auch Eimeria tenella CDC2-related kinase 2 (EtCRK2) wurde bereits mittels des bekannten CDK-Inhibitors Flavopiridol als Zielprotein chemisch validiert [ENGELS et al., 2010]. Wie bei allen CDKs ist die Aktivität von EtCRK2 abhängig von der Bindung eines Aktivators, der zur Zyklin-Proteinfamilie gehört. Dieser natürliche EtCRK2-Aktivator war jedoch bislang nicht bekannt. Deshalb war ein Teil dieser Arbeit die Identifizierung des natürlichen EtCRK2-Aktivators. Bioinformatische Analysen identifizierten vier E. tenella Zyklin-ähnliche Proteine (EtCYC1, EtCYC3a, EtCYC3b und EtCYC4), die nah verwandt zu den Plasmodium falciparum-Zyklinen sind [ENGELS et al., 2010; SUÁREZ FERNÁNDEZ et al., bislang unveröffentlichte Daten]. Im Rahmen dieser Arbeit konnten zwei neue Aktivatoren identifiziert und biochemisch charakterisiert werden: der bekannte CDK-Aktivator XlRINGO und das neue E. tenella-Zyklin EtCYC3a. Nachdem der nicht-radioaktive TR-FRET-Assay für die EtCRK2 etabliert und optimiert wurde, konnte die EtCRK2-Aktivität im Komplex mit beiden Aktivatoren und weitere wichtige kinetische Parameter bestimmt werden.rnZusätzlich wurde dieser Assay zum in vitro Screening einer kommerziellen Chemikalienbibliothek auf die EtCRK2 eingesetzt, um potentielle Inhibitoren für EtCRK2 zu identifizieren. Dieses in vitro Screening gefolgt von einer in silico Hit-Anreicherung identifizierte 19 aktive Verbindungen für die durch EtCYC3a und XlRINGO aktivierte EtCRK2. Zudem wurden drei Struktur-Cluster definiert: Naphthoquinone, 8-Hydroxyquinoline und 2-Pyrimidinyl-aminopiperidin-propan-2-ole. rnDie aktivsten Vertreter von jedem Cluster wurden als Leitstrukturen ausgewählt und auf EtCRK2 und HsCDK2 getestet. Aufgrund ihrer inhibierenden Wirkung auf EtCRK2 stellen diese Verbindungen viel versprechende Leitstrukturen für die Entwicklung eines neuen Antikokzidiums dar. Hiermit konnte auch gezeigt werden, dass BES124764, der Vertreter des 2-Pyrimidinyl-aminopiperidin-propan-2-ol-Clusters, in der Lage ist, die EtCRK2 selektiv zu inhibieren. rnDaher wird BES124764 sowie einige Derivate in den Leitstruktur-Optimierungsprozess für die Auffindung eines neuen Arzneimittelkandidaten gegen Kokzidiose eingehen.rn

Untersuchungen zu der Rolle der extrazellulären Matrix bei Fibrose und bei Tumoren

Diese Arbeit befasst sich mit der Rolle der extrazellulären Matrix und insbesondere des Proteins Fibronektin bei der Leberfibrose und bei der Einnistung von Tumorzellen in die Stammzellnische im Knochenmark.rnrnHierfür wurde in einem Fibrosemodell das Peptid pUR4b verwendet, welches die Assemblierung einer Fibronektinmatrix verhindert. Bei der Verwendung dieses Peptids während und nach der Induktion einer Leberfibrose durch die Chemikalie Dimethylnitrosamin konnte eine Verminderung der Kollagenmenge (und damit des fibrotischen Narbengewebes) in der Leber im Vergleich zu fibrotischen Kontrolltieren beobachtet werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass dieser Effekt unabhängig von der Aktivierung der hepatischen Stellatezellen ist, jedoch zum Teil von einer verminderten Anzahl entzündlicher Zellen abhängig sein könnte. Eine verminderte Bildung von Gesamt- und aktivem TGF-β, welche zum Teil auf Effekte der verringerten Zahl der inflammatorischen Zellen zurückzuführen sein könnte, unterstützt den Effekt des verminderten Aufbaus von Narbengewebe. In vitro Untersuchungen zeigten, dass hepatische Stellatezellen bei einer Behandlung mit pUR4b weniger Fibronektin in die extrazelluläre Matrix einbauten als unbehandelte hepatische Stellatezellen. Insgesamt sprechen die Daten dafür, dass das Peptid pUR4b den Aufbau einer Fibronektinmatrix verhinderte bzw. verminderte, wodurch die Ablagerung anderer Komponenten der extrazellulären Matrix wie z.B. Kollagen gestört war und es daher zu einem Rückgang des fibrotischen Narbengewebes kam.rnrnFür die Untersuchung des Einflusses der extrazellulären Matrix und des Fibronektins bei der Einnistung von Tumorzellen wurde zunächst das Fibronektin mit Hilfe konditioneller Knockout-Mäuse in verschiedenen Zellen bzw. Organen der Tiere ausgeschaltet. Weder die Ausschaltung des zirkulierenden, noch des durch Osteoblasten und Osteozyten gebildeten, noch des zirkulierenden und von Zellen des Knochenmarks gebildeten Fibronektins beeinträchtigte die Einnistung von Tumorzellen. Auch die Bildung eines Hämatoms im Knochen hatte weder einen Einfluss auf die Einnistung von Tumorzellen noch auf die spätere Tumorentwicklung. Die Ausschaltung des tumorzellendogenen Fibronektins führte hingegen zu einer signifikant verminderten Einnistung von Tumorzellen. Diese ist wahrscheinlich auf die verstärkte Affinität dieser Tumorzellen zu Zellen des Immunsystems zurückzuführen. Diese Beobachtung konnte zum Teil durch eine verstärkte eCadherin Expression erklärt werden, welche die Bindung an verschiedene Zellen des Immunsystems vermittelt. Eine Untersuchung der osteoblastischen Stammzellnische durch die kombinierte Gabe von Parathormon und Zoledronsäure führte zu keiner Veränderung der Fibronektinkonzentration innerhalb des Knochenmarks der behandelten Tiere. Dennoch nisteten sich in dem Knochenmark der mit Parathormon und Zoledronsäure behandelten Tiere signifikant mehr Tumorzellen ein als in dem von Kontrolltieren. Dieser Effekt konnte auf einen synergetischen Effekt von Parathormon und Zoledronsäure zurückgeführt werden, der zu einer gesteigerten Osteoblastenaktivität und Änderungen der Zytokinkonzentrationen im Knochenmark führte.rnZusammenfassend zeigte sich, dass eine Veränderung der extrazelluläre Matrix und insbesondere des Proteins Fibronektin bei Leberfibrose zu einem veränderten Krankheitsbild führt und die Einnistung von Tumorzellen in das Knochenmark beeinflusst.rn

Einstellungen zur Demokratie in Kambodscha : Niveau und Determinanten der Demokratieunterstützung

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, wie stark die Unterstützung eines demokratischen politischen Systems in der kambodschanischen Bevölkerung ist und welche Faktoren auf der Mikroebene die Demokratieunterstützung in Kambodscha beeinflussen. Hierfür werden das Unterstützungsmodell von Dieter Fuchs und die Modernisierungstheorie von Seymour Lipset für die Analyse von Einstellungen in einem autoritären politischen System modifiziert und entsprechend angepasste Hypothesen [zum Einfluss der Modernisierungsfaktoren auf die Demokratieunterstützung] formuliert. Nachdem die im Datensatz vorhandenen Einzelindikatoren zu Faktoren verdichtet und Probleme des Demokratieverständnisses und der Item-Nonresponse diskutiert wurden, werden Daten der zweiten Welle der Asian Barometer Survey 2008 analysiert. Die empirischen Ergebnisse zeigen zwar, dass eine substantielle Minderheit das autoritäre Regime des Landes und seine Entscheidungsträger kritisch betrachtet, die Bindung an liberal-demokratische Werte aber eher schwach ausgeprägt ist. Bi- und multivariate Analysen deuten auf einen Einfluss von Faktoren wie Bildung, Einkommen und Wohnort hin und bestätigen somit weitgehend die Modernisierungstheorie, allerdings mit einer bedeutsamen Abweichung: Größere Zufriedenheit mit der eigenen wirtschaftlichen Lage führt zwar zu einer stärkeren Bindung an demokratische Werte, gleichzeitig aber auch zu einer größeren Unterstützung des autoritären Regimes und seiner Entscheidungsträger.

Funktionsaufklärung von Atmungsproteinen in Insekten

Globine sind kleine globuläre Proteine mit nahezu ubiquitärem Vorkommen in allen Tiergruppen. Sie weisen eine typische Sandwichstruktur auf, die in der Regel aus acht α-Helices mit einer zentralen prosthetischen Häm-Gruppe besteht und die Proteine zur Bindung gasförmiger Liganden befähigt. Die Funktionen der Globine reichen von O2-Transport und – Speicherung, über eine Beteiligung bei der Entgiftung reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffspezies bis hin zu sensorischen physiologischen Aufgaben. Innerhalb der Klasse der Insekten schien das Vorhandensein von Globinen zunächst auf Insekten mit offensichtlich hypoxischen Habitaten beschränkt zu sein. Die Entdeckung des Globins glob1 in Drosophila melanogaster deutete jedoch eine sehr viel weitere Verbreitung der Globine in Insekten an, die sich durch die Identifizierung von Globingenen in einer Vielzahl von normoxisch lebenden Insekten, wie z.B. Apis mellifera oder Aedes aegypti bestätigte. D. melanogaster besitzt drei Globine, glob1, glob2 und glob3. Glob1 ist eng mit anderen intrazellulären Insektenglobinen verwandt, was zu der Annahme führte, dass es sich bei glob1 um das ursprüngliche und bei glob2 und glob3 um abgeleitete D. melanogaster Globine handelt. Glob1 wird in allen Entwicklungsstadien exprimiert, wobei die Hauptexpressionsorte der Fettkörper und das Tracheensystem sind. Die Transkription des glob1 startet von zwei alternativen Promotoren (Promotor I und II), wodurch in Kombination mit alternativem Splicing vier Transkriptvarianten (Isoform A-D) entstehen, deren Translation jedoch in einer Proteinvariante (glob1) resultiert. Hypoxische Bedingungen führen zu einer vermutlich HIF (=‚hypoxia-inducible factor‘) -vermittelten Abnahme der glob1 Genexpression, wohingegen Hyperoxie eine leichte Zunahme der glob1 mRNA Menge bewirkt. Der mithilfe des UAS/Gal4- Systems erzeugte, RNAi-vermittelte glob1 Knockdown führt zu einer schlechteren Überlebensrate adulter Fliegen unter hypoxischen Bedingungen, einer verkürzten Erholungszeit nach hypoxischem Stupor in Weibchen sowie zu einer erhöhten Resistenz gegenüber dem ROS (=‘reactive oxygen species‘) -generierenden Herbizid Paraquat in Larven und adulten Weibchen. Diese Beobachtungen sprechen für eine Funktion des Drosophila glob1 innerhalb der O2-Versorgung. Unter hyperoxischen Bedingungen hingegen wurde kein Unterschied zwischen Fliegen mit wildtypischer und manipulierter glob1-Expression festgestellt, wodurch eine Beteiligung des glob1 bei der Entgiftung reaktiver Sauerstoffspezies als mögliche Funktion vorerst ausscheidet. Bei glob2 und glob3 handelt es sich um duplizierte Gene. Auf phylogenetischen Rekonstruktionen basierend konnte die Entstehung der Globin-Duplikate auf ein Duplikationsereignis vor der Radiation des Subgenus Sophophora vor mindestens 40 Millionen Jahren zurückgeführt werden. Die durchgeführten Analysen zur molekularen Sequenzevolution der Globin-Duplikate deuten darauf hin, dass glob2 und glob3 nach der Duplikation eine Kombination aus Sub- und Neo-Funktionalisierungsprozessen durchlaufen haben. Glob2 und glob3 zeigen eine deckungsgleiche mRNA Expression, die auf die männliche Keimbahn beschränkt ist. Aufgrund des hohen Konservierungsgrads der für die Häm- und O2-Bindung essentiellen Aminosäuren kann von der Funktionalität beider Proteine ausgegangen werden. Die streng auf die männliche Keimbahn begrenzte Expression von glob2 und glob3 deutet auf eine Rolle der Globin-Duplikate innerhalb der Spermatogenese hin, die möglicherweise in einem Schutz der Spermatogenese vor oxidativem Stress besteht. Auch eine Beteiligung beim korrekten Ablauf der Spermien-Individualisierung, beispielsweise durch Regulation von Apoptoseprozessen wäre denkbar.

In-vitro-Studien zur Generierung bi-spezifischer T-Zellen durch T-Zell-Antigenrezeptor-Gentransfer

In der Dissertation konnte gezeigt werden, dass von einem pp65(495-503)-spezifischen Doppelketten-TZR (2-Plasmide-retrovirales Vektorsystem) ein Potential der Fremdinteraktion mit spezifitätsfremden humanen gp100(280-288)- und AML(14-22)- sowie murinen MDM2(81-88)- und p53(264-272)-Tumorantigen-spezifischen TZRa und -b Ketten besteht. Folglich zeichneten sich essentielle Optimierungsverfahren ab. Für die Generierung von bi-spezifischen T-Zellenrnwurden zwei Strategien etabliert. Das erste Verfahren hatte zur Voraussetzung, dass der Donor und Rezipient einen HCMV-seropositiven Status aufweisen würden. Es ließen sich pp65(495-503)-spezifische T-Zellen aus HCMV-seropositiven Blutproben expandieren, die eine effiziente pp65(495-503)-Spezifität charakterisierte. In der zweiten Strategie wurde die Situation behandelt, dass der Donor HCMV-seronegativ und der Rezipient HCMV-seropositiv wären.rnHierbei wurde das Verfahren der simultanen Kotransfektion mit einem pp65(495-503)- und p53(264-272)-spezifischen TZR etabliert. Bei der Verwendung beider Strategien konnten effizient p53(264-272)-Tumorantigen und pp65(495-503)-bi-spezifische T-Zellen generiert werden.rnHinzukommend konnte der Einfluss einer möglichen Kompetition um CD3 undrnFehlinteraktion mit den endogenen TZRa und -b Ketten dargelegt werden. Des Weiteren erfolgten Interaktionsanalysen mit einem p53(264-272)-Tumorantigen-spezifischen Einzelketten-TZR. Die Analysen erfolgten sowohl unter nicht-kompetitiven Bedingungen in der humanen Jurkat-76 Zelllinie, welche den genomischen Verlust von endogenen TZRa und -b Ketten kennzeichnete, als auch unter kompetitiven Bedingungen in den humanen T-Zellen, die endogene TZRa und -b Ketten besitzen. In dem 2-Plasmide-retroviralen Vektorsystem konnte gezeigt werden, dass unter nicht-kompetitiven Bedingungen der p53(264-272)- Tumorantigen-spezifische Einzelketten-TZR in erhöhtem Maße mit der murinen MDM2(81-88)-sowie homologen p53(264-272)- als auch mit den humanen TZRa Ketten der Spezifitäten AML(14-22), gp100(280-288) und pp65(495-503) (Vb3-Analyse) interagieren konnte. Interessanterweise zeigte sich im 1-Plasmid-retroviralen Vektorsystem ein geringeres Interaktionsverhalten mit murinen und vor allem humanen TZRa Ketten. Das Interaktionspotential schien TZR Subfamilien-abhängig zu sein. Essentiell war es, dass der p53(264-272)-Tumorantigenspezifische Einzelketten-TZR eines 1-Plasmid-retroviralen Vektorsystems, trotz minimaler Beeinflussungen, stets an der Zelloberfläche exprimiert werden konnte und sich kein vollständiger Verlust der p53(264-272)-Spezifität verzeichnen ließ. Aufgrund der Verdrängung der Va-Domäne des p53(264-272)-Tumorantigen-spezifischen Einzelketten-TZR durch eine Volllängen-TZRa-Kette, erfolgte die Optimierung der Va/Vb-Interaktion des Einzelketten-TZR (1-Plasmid-retrovirales Vektorsystem). Es konnte ein neuartiger p53(264-272)-Tumorantigenspezifischer Einzelketten-TZR mit einer zusätzlichen künstlichen Disulfidbrücke zwischen Va(Q51C) und dem C-terminalen Ende des SL7-Linkers (G16C) generiert werden. Dieser Einzelketten-TZR zeigte im Vergleich zum Ausgangskonstrukt eine stärkere Va/Vb-Bindung, ausgelesen an einer effizienten Reduktion der residuellen Kettenfehlinteraktion, sowie eine effiziente TZR-Expression und Funktionalität, als auch eine vergleichbare TZR-MHC:Peptid-Affinität. Zusammenfassend konnten pp65(465-503)- und p53(264-272)-Tumorantigen-bi-spezifische T-Zellen generiert werden, die eine effiziente duale Spezifität aufwiesen. Auch konnte detailliert das Interaktionsverhalten eines p53(264-272)-Tumorantigen-spezifischen Einzelketten-TZR mit spezifitätsfremden TZRa Ketten dargelegt sowie eine Optimierung eines p53(264-272)-Tumorantigen-spezifischen Einzelketten-TZR (1-Plasmid-retrovirales Vektorsystem) erzielt werden.

Synthese von polymergebundenen Sialyl-Lewis x-Strukturen und deren Mimetika als Zelladhäsionsinhibitoren für E-, L- und P-Selektin

Kohlenhydrate dienen nicht nur der Ernährung oder der Stabilisierung von Zellwänden, sondern sie sind auch von essentieller Bedeutung für Zell-Zell-Wechselwirkungen im Organismus. Damit sind sie von besonderem Interesse für die Behandlung von Entzündungen sowie tumorösen Erkrankungen, die auf Wechselwirkungen zwischen bestimmten Kohlenhydraten und Rezeptoren, Selektine genannt, basieren. Die vorliegende Dissertation mit dem Titel „Synthese von polymergebundenen Sialyl-Lewis x-Strukturen und deren Mimetika als Zelladhäsionsinhibitoren für E-, L- und P-Selektin“ befasst sich mit der Synthese und der Modifizierung des natürlich vorkommenden Selektin-Liganden Sialyl-Lewisx und seinen potentiell mimetischen Strukturen auf Basis von Gemischen der an der Bindung beteiligten Kohlenhydrate sowie von sulfatierten Einheiten. Um im Organismus eine verstärkte Bindung an die zu adressierenden Rezeptoren und eine erhöhte Zirkulationsdauer zu erreichen, wurden die geeignet funktionalisierten Liganden mittels reaktiver Polymere auf Basis von Pentafluorphenyl-Reaktivestern im Rahmen einer polymeranalogen Umsetzung an ein definiertes Methacrylamid-Polymer gebunden.Um die biologische Wirksamkeit der synthetisierten Polymere zu überprüfen, wurden Oberflächenplasmonenresonanz-Messungen (SPR-Messungen) durchgeführt. Dabei zeigte sich bei den verschiedenen Selektinen eine unterschiedlich hohe Affinität der Sialyl-Lewis x sowie der mimetischen Polymere. Es konnten bei E-Selektin die geringsten, bei L-Selektin mittlere und bei P-Selektin die höchsten Affinitäten im unteren nanomolaren Bereich festgestellt werden.

On-surface chemical reactions on an insulating substrate

Diese Arbeit beschreibt zum ersten Mal die kovalente Verknüpfung organischer Moleküle auf einer Isolatoroberfläche, motiviert im Hinblick auf die Nutzung der Synthesemethode für die molekulare Elektronik und verwandte Anwendungen. Durch die Verwendung der Nichtkontakt-Rasterkraftmikroskopie und der Kelvinprobe-Mikroskopie bei Raumtemperatur wurden grundlegende molekulare Prozesse der Wechselwirkungen zwischen Molekülen und der Calcit(10.4) Oberfläche sowie die chemische Reaktivität der Moleküle auf der Oberfläche analysiert. Das Zusammenspiel zwischen intermolekularen und Molekül-Oberfläche Wechselwirkungen zeigt sich für Biphenyl-4,4'-dicarbonsäure (BPDCA) durch die Koexistenz zweier unterschiedlicher molekularer Strukturen, die einen Einblick in die treibenden Kräfte der molekularen Selbstorganisation bieten. Die sehr ausgeprägte Reihenstruktur basiert auf der optimalen geometrischen Struktur der BPDCA Moleküle zu den Abmessungen des Substrats, während die zweite Struktur durch Wasserstoffbrücken zwischen den Molekülen gekennzeichnet ist. Der Deprotonierungsvorgang von 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHBA)-Molekülen auf Calcit wird bei Zimmertemperatur gezeigt. Zwei Phasen werden beobachtet, die nach Aufbringen der Moleküle koexistieren. Mit der Zeit geht eine bulk-ähnliche Phase in eine stabile, dicht gepackte Phase über. Der Übergang wird durch Betrachtung des Protonierungszustands der Moleküle erklärt. Die bulk-ähnliche Phase benötigt Wasserstoffbrückbindungen zur Strukturbildung. Werden die Moleküle deprotoniert, so wird die resultierende dicht gepackte Phase durch die elektrostatische Wechselwirkung der deprotonierten Carboxylatgruppen mit den Oberflächen-Calciumkationen stabilisiert. 4-Iodbenzoesäure (IBA)-Moleküle bilden auf Calcit nur Inseln an Stufenkanten, was auf die schwache Molekül-Oberflächen-Wechselwirkung zurückzuführen ist. Für einen stärkeren Einfluss des Substrats durchlaufen die Moleküle einen kontrollierten Übergangsschritt vom protonierten zum deprotonierten Zustand. Im deprotonierten Zustand nehmen die Moleküle eine wohldefinierte Adsorptionsposition auf dem Substrat ein. Die deprotonierte Säuregruppe wird ausgenutzt, um die Desorption der halogensubstituierten Benzoesäure-Moleküle bei der thermischer Aktivierung für die Vernetzungsreaktion zu vermeiden. Darüber hinaus wird die Carboxylatgruppe als starker Elektronendonor verwendet um die Phenyl-Halogen-Bindung zu schwächen und somit die homolytische Spaltung dieser Bindung auch bei moderaten Temperaturen zu ermöglichen. Diesem Konzept folgend ist die erste erfolgreiche kovalente Verknüpfung von 2,5-Diiod-benzoesäure, 2,5-Dichlorbenzoesäure, 3,5-Diiod Salicylsäure und 4-Iod-benzoesäure zu durchkonjugierten molekularen Drähten, Zick-Zack-Strukturen sowie Dimere gezeigt durch Ausnutzen von unterschiedlichen Substitutionsposition sowie Ändern der Anzahl der substituierten Halogenatome. Aufbauend auf diesem Erfolg, wird eine zweistufige Vernetzungsreaktion vorgestellt. Zum Induzieren der ortsspezifischen und sequentiellen kovalenten Verknüpfung wird ein Ausgangsmolekül gewählt, das sowohl eine Bromphenyl als auch eine Chlorphenyl Gruppe mit unterschiedlichen Dissoziationsenergien für die homolytische Spaltung besitzt. Die Reaktionsstellen und sequentielle Reihenfolge für die Reaktion sind somit in der molekularen Struktur einkodiert und bisher unerreichte Reaktionspfade können mithilfe der kovalente Verknüpfung organischer Moleküle auf einer Isolatoroberfläche beschritten werden.

Biologischer Lichtsammler (LHCII) für Halbleiternanokristalle (Quantum Dots)

Der light harvesting complex II (LHCII) ist ein pflanzliches Membranprotein, das in seiner trimeren Form über 40 Chlorophylle bindet. In der Pflanze kann er besonders effizient Licht sammeln und die Anregungsenergie anschließend fast verlustfrei über andere chlorophyll-bindende Proteine an die Reaktionszentren weiterleiten. Aufgrund dieser besonderen Eigenschaften war es ein Ziel dieser Arbeit, rekombinanten LHCII mit synthetischen Komponenten zu kombinieren, die zur Ladungstrennung befähigt sind. Zu diesem Zweck wurden unter anderem Halbleiternanokristalle (Quantum Dots, QDs) ausgewählt, die je nach Zusammensetzung sowohl als Energieakzeptoren als auch als Energiedonoren in Frage kamen. Durch Optimierung des Puffers gelang es, die Fluoreszenzquantenausbeute der QDs in wässriger Lösung zu erhöhen und zu stabilisieren, so dass die Grundvoraussetzungen für die spektroskopische Untersuchung verschiedener LHCII-QD-Hybridkomplexe erfüllt waren.rnUnter Verwendung bereits etablierter Affinitätssequenzen zur Bindung des LHCII an die QDs konnte gezeigt werden, dass die in dieser Arbeit verwendeten Typ-I QDs aus CdSe und ZnS sich kaum als Energie-Donoren für den LHCII eignen. Ein Hauptgrund lag im vergleichsweise kleinen Försterradius R0 von 4,1 nm. Im Gegensatz dazu wurde ein R0 von 6,4 nm für den LHCII als Donor und Typ-II QDs aus CdTe, CdSe und ZnS als Akzeptor errechnet, wodurch in diesem System eine höhere Effizienz des Energietransfers zu erwarten war. Fluoreszenzspektroskopische Untersuchungen von Hybridkomplexen aus LHCII und Typ-II QDs ergaben eine hohe Plausibilität für einen Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) vom Lichtsammler auf die QDs. Weitere QD-Affinitätssequenzen für den LHCII wurden identifiziert und deren Bindekonstanten ermittelt. Versuche mit dem Elektronenakzeptor Methylviologen lieferten gute Hinweise auf eine LHCII-sensibilisierte Ladungstrennung der Typ-II QDs, auch wenn dies noch anhand alternativer Messmethoden wie z.B. durch transiente Absorptionsspektroskopie bestätigt werden muss. rnEin weiteres Ziel war die Verwendung von LHCII als Lichtsammler in dye-sensitized solar cells (DSSC). Geeignete dotierte TiO2-Platten wurden ermittelt, das Verfahren zur Belegung der Platten optimiert und daher mit wenig Aufwand eine hohe LHCII-Belegungsdichte erzielt. Erste Messungen von Aktionsspektren mit LHCII und einem zur Ladungstrennung fähigen Rylenfarbstoff zeigen eine, wenn auch geringe, LHCII sensibilisierte Ladungstrennung. rnDie Verwendung von Lanthanide-Binding-Tags (LBTs) ist ein potentielles Verfahren zur in vivo-Markierung von Proteinen mit Lanthanoiden wie Europium und Terbium. Diese Metalle besitzen eine überdurchschnittlich lange Lumineszenzlebensdauer, so dass sie leicht von anderen fluoreszierenden Molekülen unterschieden werden können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit gelang es, eine LBT in rekombinanten LHCII einzubauen und einen Lumineszenz Resonanz Energietransfer (LRET) vom Europium auf den LHCII nachzuweisen.rn

Functionalization and characterization of magnetic nanoparticles for biomedical applications

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Oberflächenfunktionalisierung von MnO Nanopartikeln (NP). Durch die Verwendung und Verbesserung verschiedener Polymere durch die Einbindung von Poly (Ethylen Glycol) (PEG), gelang es, die Löslichkeit dieser Nanopartikel in wässrigen Lösungen sowie in Körperflüssigkeiten zu erhöhen. Zusätzlich konnten diese Nanopartikel deutlich besser steril filtriert werden und zeigten eine erhöhte Aktivität alsrnKontrastmittel im MRT. Vorläufige Ergebnisse für die Verwendung von Silika als Schutzhülle für MnO NP werden ebenfalls kurz erläutert. Die verwendeten Polymere besaßen dabei zugängliche Aminogruppen, die eine weitere Funktionalisierung durch Bio-aktiver Gruppen ermöglichte. Der Nachweis einer erfolgreichen Bindung durch verschiedene Methoden wie SDS-PAGE, Western- und Northern Blot sowie die Verwendung unterschiedlicher FluoreszenzMessungen wird ebenfalls diskutiert. MnO NP und anderer magnetischer NP werden weiterhin auf ihr toxisches Verhalten gegenüber Caki1 und HeLa Zellen getestet. Dabei zeigte sich, dass MnO NP, im Gegensatz zu einigen Kupferoxiden, quasi nicht toxisch waren und das Proliferationsverhalten dieser Zellen quasi nicht beeinflussten. Weiterhin wurde ein Fluoreszenzfarbstoff, konkret Protoporphyrin IX, an die Oberfläche von MnO NP angebracht.Diese konnten dann erfolgreich als Kontrastmittel in der MRT verwendet werden und zeigten vielversprechende Ergebnisse für die Photodynamische Therapie. Desweiteren wird die Synthese des Antikörpers gegen p53 ausführlich erläutert. Dabei wurde genau darauf geachtet,dass dieser Antikörper dann an MnO NP gebunden werden kann.

Molekulardynamik-Simulationen supramolekularer Komplexe unter Einfluss einer externen Kraft

Supramolekulare Komplexe werden durch nichtkovalente Bindungen stabilisiert. Legt man eine externe Kraft an einen solchen Komplex an, ist es möglich, diese Bindungen zu öffnen. Anhand der dafür benötigten Kraft läßt sich die Stabilität des Komplexes bestimmen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei supramolekulare Komplexe, die unterschiedliche Arten von nichtkovalenten Bindungen enthalten, mit Hilfe von Molekulardynamik (MD) Simulationen untersucht. In beiden Fällen wurden die relevanten Bindungsstrukturen und deren Stabilität ermittelt.rnZum einen wurden zwei synthetische Calix[4]aren-Catenan-Dimersysteme betrachtet, in denen die beiden Monomere über Wasserstoffbrückenbindungen aneinander gebunden sind. Die Besonderheit dieser Komplexe ist, dass die Monomere aufgrund von verschlauften Alkylketten (Catenan-Struktur) nicht vollständig voneinander getrennt werden können. In Abhängigkeit der Länge derrnAlkylketten findet man für die beiden Komplexe eine unterschiedliche Zahl von relevanten Bindungsstrukturen (Zustände). Für ein System mit relativ kurzen Alkylketten findet man zwei Zustände, eine kompakte Struktur, die auch im Gleichgewicht beobachtet wird und eine gestreckte Struktur, die nur unter dem Einfluss der externen Kraft stabil ist. Verlängert man die Alkylketten,rnbeobachtet man einen weiteren Zustand, in dem das Dimer vollständig gestreckt ist und die Monomere eine größere Separation aufweisen.rnBei dem zweiten System, das untersucht wurde, handelte es sich um einen Carbohydrat-Kation-Carbohydrat Komplex, der für die Selbstadhäsion von Meeresschwämmen eine wichtige Rolle spielt. Experimentell ist bekannt, dass sich dieser Komplex zwar mit Calciumionen, nicht aber mit Magnesiumionen bildet. Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die wesentlichen Unterschiede der beiden Kationarten in Bezug auf die Komplexbildung auf den kleineren Ionenradius des Magnesiumions zurückzuführen sind. Aufgrund des kleineren Radius bindet ein solvatisiertes Magnesiumion die Hydrathülle stärker und die Komplexbindung wird kinetisch gehemmt. Zum anderen bindet im Magnesiumkomplex nur eines der beiden Carbohydrate direkt an das Kation.rnDas andere Carbohydrat bindet nur indirekt über ein Wassermolekül an das Kation. Da diese indirekte Bindung gegenüber einer direkten Bindung schwächer ist, weist der Magensiumkomplex eine geringere Stabilität auf als ein vergleichbarer Calciumkomplex.rnDes Weiteren wurde untersucht, inwieweit die Ergebnisse von MD Simulationen vom verwendeten Modell (Kraftfeld) abhängen. Allgemein ist bekannt, dass die Ergebnisse von Gleichgewichtssimulationen kraftfeldabhängig sind. Im Rahmen diese Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich für Zugsimulationen, in denen eine externe Kraft an das System angelegt wird, eine ähnliche Kraftfeldabhängigkeit ergibt. Da sich die Unterschiede der Ergebnisse auf Unterschiede in den Gleichgewichtssimulationen zurückführen lassen, kann man annehmen, dass die externe Kraft keine zusätzliche Einschränkung in Bezug auf die Zuverlässigkeit der Kraftfelder darstellt.rnAbgesehen von den MD Simulationen wurde eine in der Literatur beschriebene Methode zur Analyse von Zweizustandssystemen unter dem Einfluss einer konstanten externen Kraft erweitert. Ein Komplex läßt sich als Zweizustandssystem beschreiben, wenn dieser zwei relevante Bindungsstrukturen aufweist. Wird an solch einen Komplex eine konstante Kraft angelegt, lassen sich Übergänge zwischen den beiden Zuständen beobachten. Ist das System weit entfernt vom Gleichgewicht, kann es problematisch sein, einen der beiden Übergänge vollständig aufzulösen. In diesen Fällen wird nun vorgeschlagen, die beiden Übergänge zu einem sogenannten Kreisübergang zusammen zu fassen und diese zu zählen. Bestimmt man die Zahl der Übergänge pro Zeit in Abhängigkeit der angelegten Kraft, können die Übergangsraten bestimmt werden. Um die Methode zu validieren wurden kinetische Monte-Carlo Simulationen durchgeführt. Es zeigt sich, dass schon mit relativ kleinen Datensätzen gute Ergebnisse erzielt werden können.

Reaktion von Übergangsmetallhydrid-Komplexen mit Tetrylenen und Ein-Elektronen-Reduktion von Halogentetranen

Das Stannylen SnHyp2 (Hyp = Si(SiMe3)3) reagiert mit den Übergangsmetallhydrid-Komplexen Cp2MH2 (Cp = C5H5, M = Mo, W) in einer alpha-Additionsreaktion zu Cp2MSn(H)Hyp2. Ferner bilden sich unter Abspaltung von HSi(SiMe3)3 auch vierkernige Verbindungen der Form [Cp2MSn(H)Hyp]2, welche für M = Mo röntgendiffraktometrisch nachgewiesen wurden. Erhöht man den sterischen Anspruch der Silylreste des Stannylens, so nimmt die Tendenz der Adduktbildung ab, so dass nur die vierkernigen Komplexe nachweisbar sind. Im Fall für SnSit2 (Sit = Si(SiMe3)2SiMe2tBu) konnten sogar Stereoisomere der vierkernigen Verbindungen [Cp2MoSn(H)Sit]2 nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu reagiert das Plumbylen PbHyp2 mit Cp2MoH2 in einer Substitutionsreaktion zu dem nachgewiesenen Cp2Mo(H)Hyp. Bei größer werdendem Silylrest werden andere Reaktionsabläufe bevorzugt. Auf dem Forschungsgebiet der Ein-Elektronen-Reduktion von Halogenstannanen und -plumbanen XER2R´ (X = Halogen; E = Sn, Pb; R = Silylrest; R = Aryl- / Alkylrest) mit dem 19-Elektronen-Komplex Decamethylcobaltocen CoCp*2 (Cp* = C5Me5) konnten Unterschiede zwischen den Verbindungen des Zinns und des Bleis festgestellt werden: Bei der Reduktion von Halogenstannanen fallen die erwarteten Decamethylcobaltocenium-Halogenide [CoCp*2]X aus und ESR-Messungen bestätigen die Anwesenheit von Stannylradikalen, während bei der Reduktion von hypersilylierten Halogenplumbanen unterschiedliche Folgeprodukte entstehen und Plumbylradikale via ESR-Spektroskopie nicht feststellbar sind. Bei alkylhaltigen Halogenplumbanen XPbHyp2R (R = Alkyl) findet eine Spaltung der Pb-C-Bindung statt und es bilden sich Plumbate der Form [CoCp*2][PbHyp2X], während die Reduktion von einem arylhaltigen Halogenplumban IPbHyp2Ph (Ph = Phenyl) das erwartete Decamethylcobaltocenium-Salze ergibt.

Die Rolle von LRP1 in der Funktion des NMDA-Rezeptors

Ein funktionelles Zusammenspiel von LRP1, einem Mitglied der LDL-Rezeptorfamilie, mit dem NMDA-Rezeptor, einem Glutamat Rezeptor, wurde durch die Interaktion beider Proteine sowie eine tPa-vermittelte, LRP1-abhängige Signalübertragung durch den NMDA-Rezeptor belegt. Darüber hinaus zeigen Mäuse mit einem konditionellen neuronalen knock-out des Lrp1 Gens Verhaltensänderungen, die mit einer beeinträchtigten Signalübertragung durch NMDA-Rezeptoren assoziiert werden könnten. Die genaue Rolle von LRP1 in der NMDA-Rezeptor-Funktion bleibt allerdings noch unklar. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von LRP1 bei der Expression der NR2B-Untereinheit des NMDA-Rezeptors an der Zelloberfläche primärer kortikaler Neurone untersucht. Zu diesem Zweck wurde die knock-in Mauslinie LRP1ΔNPxY2, die sich durch eine Alanin Substitution im NPxY2 Motiv des LRP1 auszeichnet, eingesetzt. rnEs konnte gezeigt werden, dass diese knock-in Mutation in einer erhöhten Expression von LRP1 und der NMDA-Rezeptoruntereinheiten NR1 und NR2B an der Zelloberfläche primärer kortikaler Neurone resultiert. Der Effekt konnte durch eine reduzierte Endozytoserate von LRP1 und der NR1-und NR2B-Untereinheiten in primären LRP1ΔNPxY2 Neuronen erklärt werden. Darüber hinaus wurde ein verändertes Phosphorylierungsmuster der Internalisierungssignale der NR2B-Rezeptoruntereinheit Serin S1480 und Tyrosin Y1472 an der Zelloberfläche primärer LRP1ΔNPxY2 Neurone detektiert. Die verantwortlichen Kinasen Fyn und Kasein-Kinase II sind allerdings in LRP1ΔNPxY2 Neuronen im Vergleich zu den Wildtyp-Kontrollen nicht abweichend reguliert. In den Co-Immunopräzipitationsexperimenten wurde gezeigt, dass die Bindung von LRP1 mit NR2B durch die Phosphorylierung reguliert wird und dieser Regulationsmechanismus in LRP1ΔNPxY2 Neuronen beeinträchtigt ist. Dies resultiert in einer stärkeren Bindung von NR2B-Rezeptoruntereinheit an LRP1. Aufgrund reduzierter Internalisierungsraten von LRP1 in LRP1ΔNPxY2 Neuronen führt dieser Umstand zu einer Akkumulation beider Rezeptorproteine an der Zelloberfläche. Schließlich wurden die NMDA-Rezeptor-assoziierten Verhaltensänderungen wie die Hyperaktivität und die Defizite im direkten und umgekehrten räumlichen Lernvermögen in den LRP1ΔNPxY2 Tieren nachgewiesen. Zusammengefasst, demonstrieren diese Ergebnisse, dass LRP1 eine kritische Rolle in der Regulierung der NR2B-Expression an der Zelloberfläche spielt.

Regulation of Nox4 expression by histone deacetylases in human endothelial cells : involvement of epigenetic mechanisms

Nox4 is a member of the NADPH oxidase family, which represents a major source of reactive oxygen species (ROS) in the vascular wall. Nox4-mediated ROS production mainly depends on the expression levels of the enzyme. The aim of my study was to investigate the mechanisms of Nox4 transcription regulation by histone deacetylases (HDAC). Treatment of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and HUVEC-derived EA.hy926 cells with the pan-HDAC inhibitor scriptaid led to a marked decrease in Nox4 mRNA expression. A similar down-regulation of Nox4 mRNA expression was observed by siRNA-mediated knockdown of HDAC3. HDAC inhibition in endothelial cells was associated with enhanced histone acetylation, increased chromatin accessibility in the human Nox4 promoter region, with no significant changes in DNA methylation. In addition, the present study provided evidence that c-Jun played an important role in controlling Nox4 transcription. Knockdown of c-Jun with siRNA led to a down-regulation of Nox4 mRNA expression. In response to scriptaid treatment, the binding of c-Jun to the Nox4 promoter region was reduced despite the open chromatin structure. In parallel, the binding of RNA polymerase IIa to the Nox4 promoter was significantly inhibited as well, which may explain the reduction in Nox4 transcription. In conclusion, HDAC inhibition decreases Nox4 transcription in human endothelial cells by preventing the binding of transcription factor(s) and polymerase(s) to the Nox4 promoter, most likely because of a hyperacetylation-mediated steric inhibition. In addition, HDAC inhibition-induced Nox4 downregulation may also involves microRNA-mediated mRNA destabilization, because the effect of the scriptaid could be partially blocked by DICER1 knockdown or by transcription inhibition.

Die Einheit des Bewusstseins und das Phänomen der Synästhesie

Synästhetiker schmecken Berührungen, sehen Farben und Formen, wenn sie Musik hören oder einen Duft riechen. Es wurden auch so außergewöhnliche Formen wie Wochentage-Farben-, Berührung-Geruch- oder Schmerz-Farben-Synästhesien gefunden. Die von Neuro- wissenschaftlern und Philosophen als „Bindung“ genannte Fähigkeit mehrere Reize, die in verschiedenen Hirnarealen verarbeitet werden, miteinander zu koppeln und zu einer einheitlichen Repräsentation bzw. erfahrenen Einheit des Bewusstseins zusammenzufassen, betrifft jeden gesunden Mensch. Synästhetiker sind aber Menschen, deren Gehirne zur „Hyperbindung“ oder zum hyperkohärentem Erleben befähigt sind, da bei ihnen wesentlich mehr solcher Kopplungen entstehen. Das Phänomen der Synästhesie ist schon seit mehreren Jahrhunderten bekannt, aber immer noch ein Rätsel. Bisher glaubten Forscher, solche Phänomene beruhten bloß auf überdurchschnittlich dichten neuronalen Verdrahtungen zwischen sensorischen Hirnregionen. Aus der aktuellen Forschung kann man jedoch schließen, dass die Ursache der Synästhesie nicht allein eine verstärkte Verbindung zwischen zwei Sinneskanälen ist. Laut eigener Studien ist der Sinnesreiz selbst sowie seine fest verdrahteten sensorischen Pfade nicht notwendig für die Auslösung des synästhetischen Erlebens. Eine grundlegende Rolle spielt dabei dessen Bedeutung für einen Synästhetiker. Für die Annahme, dass die Semantik für die synästhetische Wahrnehmung das Entscheidende ist, müssten synästhetische Assoziationen ziemlich flexibel sein. Und genau das wurde herausgefunden, nämlich, dass normalerweise sehr stabile synästhetische Assoziationen unter bestimmten Bedingungen sich auf neue Auslöser übertragen lassen. Weitere Untersuchung betraf die neu entdeckte Schwimmstil-Farbe-Synästhesie, die tritt hervor nicht nur wenn Synästhetiker schwimmen, aber auch wenn sie über das Schwimmen denken. Sogar die Namen dieser charakteristischen Bewegungen können ihre Farbempfindungen auslösen, sobald sie im stimmigen Kontext auftauchen. Wie man von anderen Beispielen in der Hirnforschung weiß, werden häufig benutzte neuronale Pfade im Laufe der Zeit immer stärker ausgebaut. Wenn also ein Synästhetiker auf bestimmte Stimuli häufig stoßt und dabei eine entsprechende Mitempfindung bekommt, kann das mit der Zeit auch seine Hirnanatomie verändern, so dass die angemessenen strukturellen Verknüpfungen entstehen. Die angebotene Erklärung steht also im Einklang mit den bisherigen Ergebnissen. Die vorliegende Dissertation veranschaulicht, wie einheitlich und kohärent Wahrnehmung, Motorik, Emotionen und Denken (sensorische und kognitive Prozesse) im Phänomen der Synästhesie miteinander zusammenhängen. Das synästhetische nicht-konzeptuelle Begleiterlebnis geht mit dem konzeptuellen Inhalt des Auslösers einher. Ähnlich schreiben wir übliche, nicht-synästhetische phänomenale Eigenschaften den bestimmten Begriffen zu. Die Synästhesie bringt solche Verschaltungen einfach auf beeindruckende Weise zum Ausdruck und lässt das mannigfaltige Erleben stärker integrieren.

The NreABC system of Staphylococcus carnosus combines nitrate and oxygen sensing by an NreA,NreB sensor complex

Staphylococcus carnosus is a facultative anaerobic bacterium which features the cytoplasmic NreABC system. It is necessary for regulation of nitrate respiration and the nitrate reductase gene narG in response to oxygen and nitrate availability. NreB is a sensor kinase of a two-component system and represents the oxygen sensor of the system. It binds an oxygen labile [4Fe-4S]2+ cluster under anaerobic conditions. NreB autophosphorylates and phosphoryl transfer activates the response regulator NreC which induces narG expression. The third component of the Nre system is the nitrate receptor NreA. In this study the role of the nitrate receptor protein NreA in nitrate regulation and its functional and physiological effect on oxygen regulation and interaction with the NreBC two-component system were detected. In vivo, a reporter gene assay for measuring expression of the NreABC regulated nitrate reductase gene narG was used for quantitative evaluation of NreA function. Maximal narG expression in wild type S. carnosus required anaerobic conditions and the presence of nitrate. Deletion of nreA allowed expression of narG under aerobic conditions, and under anaerobic conditions nitrate was no longer required for maximal induction. This indicates that NreA is a nitrate regulated inhibitor of narG expression. Purified NreA and variant NreA(Y95A) inhibited the autophosphorylation of anaerobic NreB in part and completely, respectively. Neither NreA nor NreA(Y95A) stimulated dephosphorylation of NreB-phosphate, however. Inhibition of phosphorylation was relieved completely when NreA with bound nitrate (NreA•[NO3-]) was used. The same effects of NreA were monitored with aerobically isolated Fe-S-less NreB, which indicates that NreA does not have an influence on the iron-sulfur cluster of NreB. In summary, the data of this study show that NreA interacts with the oxygen sensor NreB and controls its phosphorylation level in a nitrate dependent manner. This modulation of NreB-function by NreA and nitrate results in nitrate/oxygen co-sensing by an NreA/NreB sensory unit. It transmits the regulatory signal from oxygen and nitrate in a joint signal to target promoters. Therefore, nitrate and oxygen regulation of nitrate dissimilation follows a new mode of regulation not present in other facultative anaerobic bacteria.