In-vitro-Studien zur Generierung bi-spezifischer T-Zellen durch T-Zell-Antigenrezeptor-Gentransfer

In der Dissertation konnte gezeigt werden, dass von einem pp65(495-503)-spezifischen Doppelketten-TZR (2-Plasmide-retrovirales Vektorsystem) ein Potential der Fremdinteraktion mit spezifitätsfremden humanen gp100(280-288)- und AML(14-22)- sowie murinen MDM2(81-88)- und p53(264-272)-Tumorantigen-spezifischen TZRa und -b Ketten besteht. Folglich zeichneten sich essentielle Optimierungsverfahren ab. Für die Generierung von bi-spezifischen T-Zellenrnwurden zwei Strategien etabliert. Das erste Verfahren hatte zur Voraussetzung, dass der Donor und Rezipient einen HCMV-seropositiven Status aufweisen würden. Es ließen sich pp65(495-503)-spezifische T-Zellen aus HCMV-seropositiven Blutproben expandieren, die eine effiziente pp65(495-503)-Spezifität charakterisierte. In der zweiten Strategie wurde die Situation behandelt, dass der Donor HCMV-seronegativ und der Rezipient HCMV-seropositiv wären.rnHierbei wurde das Verfahren der simultanen Kotransfektion mit einem pp65(495-503)- und p53(264-272)-spezifischen TZR etabliert. Bei der Verwendung beider Strategien konnten effizient p53(264-272)-Tumorantigen und pp65(495-503)-bi-spezifische T-Zellen generiert werden.rnHinzukommend konnte der Einfluss einer möglichen Kompetition um CD3 undrnFehlinteraktion mit den endogenen TZRa und -b Ketten dargelegt werden. Des Weiteren erfolgten Interaktionsanalysen mit einem p53(264-272)-Tumorantigen-spezifischen Einzelketten-TZR. Die Analysen erfolgten sowohl unter nicht-kompetitiven Bedingungen in der humanen Jurkat-76 Zelllinie, welche den genomischen Verlust von endogenen TZRa und -b Ketten kennzeichnete, als auch unter kompetitiven Bedingungen in den humanen T-Zellen, die endogene TZRa und -b Ketten besitzen. In dem 2-Plasmide-retroviralen Vektorsystem konnte gezeigt werden, dass unter nicht-kompetitiven Bedingungen der p53(264-272)- Tumorantigen-spezifische Einzelketten-TZR in erhöhtem Maße mit der murinen MDM2(81-88)-sowie homologen p53(264-272)- als auch mit den humanen TZRa Ketten der Spezifitäten AML(14-22), gp100(280-288) und pp65(495-503) (Vb3-Analyse) interagieren konnte. Interessanterweise zeigte sich im 1-Plasmid-retroviralen Vektorsystem ein geringeres Interaktionsverhalten mit murinen und vor allem humanen TZRa Ketten. Das Interaktionspotential schien TZR Subfamilien-abhängig zu sein. Essentiell war es, dass der p53(264-272)-Tumorantigenspezifische Einzelketten-TZR eines 1-Plasmid-retroviralen Vektorsystems, trotz minimaler Beeinflussungen, stets an der Zelloberfläche exprimiert werden konnte und sich kein vollständiger Verlust der p53(264-272)-Spezifität verzeichnen ließ. Aufgrund der Verdrängung der Va-Domäne des p53(264-272)-Tumorantigen-spezifischen Einzelketten-TZR durch eine Volllängen-TZRa-Kette, erfolgte die Optimierung der Va/Vb-Interaktion des Einzelketten-TZR (1-Plasmid-retrovirales Vektorsystem). Es konnte ein neuartiger p53(264-272)-Tumorantigenspezifischer Einzelketten-TZR mit einer zusätzlichen künstlichen Disulfidbrücke zwischen Va(Q51C) und dem C-terminalen Ende des SL7-Linkers (G16C) generiert werden. Dieser Einzelketten-TZR zeigte im Vergleich zum Ausgangskonstrukt eine stärkere Va/Vb-Bindung, ausgelesen an einer effizienten Reduktion der residuellen Kettenfehlinteraktion, sowie eine effiziente TZR-Expression und Funktionalität, als auch eine vergleichbare TZR-MHC:Peptid-Affinität. Zusammenfassend konnten pp65(465-503)- und p53(264-272)-Tumorantigen-bi-spezifische T-Zellen generiert werden, die eine effiziente duale Spezifität aufwiesen. Auch konnte detailliert das Interaktionsverhalten eines p53(264-272)-Tumorantigen-spezifischen Einzelketten-TZR mit spezifitätsfremden TZRa Ketten dargelegt sowie eine Optimierung eines p53(264-272)-Tumorantigen-spezifischen Einzelketten-TZR (1-Plasmid-retrovirales Vektorsystem) erzielt werden.

The dissertation described the potential of a pp65(495-503)-specific double chain TCR (2-plasmid-retroviral vector system) to pair with different specificities like human gp100(280-288)- and AML(14-22)- as well as murine MDM2(81-88)- and p53(264-272)-tumor antigen-specific TCRa and -b chains. Therefore essential optimizations were required. For the generation of bi-specific Trncells, two different strategies were established: The first approach implied the situation that donor and recipient are HCMV-seropositive. The expanded pp65(495-503)-specific T cells from HCMV-seropositive blood samples characterized efficient pp65(495-503)-specificity. In the second strategy the donor was HCMV-seronegative and the recipient HCMV-seropositive. Therefore a simultaneous retroviral transduction with a pp65(495-503)- and p53(264-272)-specificrnTCR was established. Using both methods led to the efficient generation of p53(264-272)-tumor antigen and pp65(495-503)-bi-specific T cells. Additional it was demonstrated the possibility of an influence of CD3 competition as well as interaction with the endogenous TCRa and -b chains. Furthermore it was assessed whether residual mispairing takes place in the chosen p53(264-272)-tumor antigen specific single chain TCR. The Jurkat-76 cell line, which in comparison to human T cells lacks endogenous TCR, represented a non-competitivernsituation. Therefore the human T cells included a competitive setting. The p53(264-272)-tumor antigen-specific single chain TCR of a 2-retroviral vector system indicated under non-competitive settings a higher incidence of mispairing with a murine MDM2(81-88)- and homologous p53(264-272)- as well as with human AML(14-22)-, gp100(280-288)- and pp65(495-503)- (Vb3-analysis) specific TCRa chains. Interestingly, the 1-retroviral vector system led to lessrnmispairing with murine and especially human TCRa chains. The potential of mispairing could be dependent of the TCR subfamily. Importantly, the p53(264-272)-tumor antigen-specific single chain TCR was still expressed on the cell surface and no complete deficiency of the p53(264-272)-specificity was observed. The p53(264-272)-tumor antigen-specific single chain TCR paired with a full length TCRa chain by displacement the Va-domain of the p53(264-272)-tumorrnantigen-specific single chain TCR. Therefore it was performed the optimization of the Va/Vb-interaction of the p53(264-272)-tumor antigen-specific single chain TCR (1-plasmid-retroviral vector system). It was generated a novel p53(264-272)-tumor antigen-specific single chain TCR which contained an additional disulfide bond between Va (Q51C) and the C-terminal end of the SL7-Linker (G16C). This single chain TCR construct showed a higher Va/Vb-binding, efficient TCR expression and functionality as well as comparable TCR-MHC:peptide affinity.rnIn summary it was demonstrated the generation of pp65(465-503)- and p53(264-272)-tumor antigen bi-specific T cells which indicated an efficient dual specificity. Additional the detailed analysis of the interaction of a p53(264-272)-tumor antigen-specific single chain TCR with different specificities of TCRa chains which led to the optimization of the single chain TCR constructrn(1-plasmid-retroviral system).