Charakterisierung von Tumorantigenen des kutanen T-Zell Lymphoms

Immuntherapien stellen basierend auf gut charakterisierten, tumorspezifischen Antigenen ein vielversprechendes Konzept in der Tumor-Therapie dar. Für das kutane T-Zell Lymphom (CTCL) sind bislang nur wenige tumorassoziierte Antigene bekannt. In dieser Arbeit konnten ein mögliches Onkogen (PAR-3ta), ein weiteres, putativ Virus-induziertes Antigen (se57-1), neue Antigene und ihre Splicing-Varianten (se70-2, cTAGE-1/2, cTAGE-5), sowie lymphozytenspezifische Differenzierungsantigene (se20-10-Familie) für das CTCL gefunden werden. Auf Grund des Cancer-Testis spezifischen Expressionsprofils kommen die Antigene cTAGE-1 (46% CTCL-Expression), cTAGE-1B (31%) und cTAGE-5A (44%) für eine CTCL-Immuntherapie in Frage. Einige bekannte, spezifische Tumorantigene konnten auch im CTCL nachgewiesen werden: MAGE-A9 (21%), GAGE 3-7b (46%) und MUC-1 (44%). Die Immunogenität konnte mittels der SEREX-Technologie durch reaktive Antikörper gegen rekombinantes MAGE-A9 in 22% der getesteten CTCL-Seren, gegen GAGE in 16% und gegen cTAGE-5A in 15% bewiesen werden. Die cTAGE-mRNAs bilden eine neue Cancer-Testis Antigenfamilie. Die Multigenfamilie ist durch Retrotransposition eines aktiven Gens (cTAGE-5) entstanden, wobei 7 aktive, transkribierte und 7 nicht transkribierte Pseudogene unterschieden werden müssen. Die aktiven Gene cTAGE-1, cTAGE-1B und cTAGE-5A werden tumorspezifisch aus den Chromosomen 18p11.2 und 14 gespliced. Die Testis-CTCL spezifischen mRNAs können häufig auch in anderen Tumoren gefunden werden. Die Antigene cTAGE-1, cTAGE-5, MAGE-A9 und GAGE 3-7b gehören zu den ersten spezifischen Zielstrukturen des CTCLs, die somit für mögliche Immuntherapien in Betracht kommen.

Die Synthese von Glycopeptiden und Glycopeptid-Protein-Konjugaten mit einer Partialstruktur des tumorassoziierten Mucins MUC1 zur Entwicklung von Tumorvakzinen

„Synthese von Glycopeptiden und Glycopeptid-Protein-Konjugaten mit einer Partialstruktur des tumorassoziierten Mucins MUC1 zur Entwicklung von Tumorvakzinen“ Das Glycoprotein MUC1 ist in Tumorepithelzellen sonderlich stark überexprimiert und wegen der vorzeitig einsetzenden Sialylierung sind die Saccharid-Epitope der O-Glycanketten stark verkürzt (sog. tumorassoziierte Antigene). Dadurch werden auch bisher verborgene Peptidepitope des Glycoprotein-Rückgrates auf der Zelloberfläche der Epithelzellen zugänglich, die als fremd von den Zellen des Immunsystems erkannt werden können. Dies macht das MUC1-Zelloberfächenmolekül zu einem Zielmolekül in der Entwicklung von Tumorvakzinen. Diese beiden strukturellen Besonderheiten wurden in der Synthese von Glycohexadecapeptiden verbunden, indem die veränderten tumorassoziierten Saccharidstrukturen TN-, STN- und T-Antigen als Glycosylaminosäure-Festphasenbausteine synthetisiert wurden und in das Peptidepitop der Wiederholungseinheit des MUC1 durch Glycopeptid-Festphasensynthese eingebaut wurden. Wegen der inhärenten schwachen Immunogenität der kurzen Glycopeptide müssen die synthetisierten Glycopeptidstrukturen an ein Trägerprotein, welches das Immunsystem stimuliert, gebunden werden. Zur Anbindung der Glycopeptide ist ein selektives Kupplungsverfahren nötig, um definierte und strukturell einheitliche Glycopeptid-Protein-Konjugate zu erhalten. Es konnte eine neue Methode entwickelt werden, bei der die Konjugation durch eine radikalische Additionsreaktion von als Allylamide funktionalisierten Glycopeptiden an ein Thiol-modifiziertes Trägerprotein erfolgte. Dazu wurde anhand von synthetisierten, als Allylamide modifizierten Modellaminosäuren untersucht, ob diese Reaktion generell für eine Biokonjugation geeignet ist und etwaige Nebenreaktionen auftreten können. Mit dieser Methode konnten verschiedene MUC1-Glycopeptid-Trägerprotein-Konjugate hergestellt werden, deren immunologische Untersuchung noch bevorsteht. Das tumorassoziierte MUC1 nimmt in der immundominanten Region seiner Wiederholungseinheit eine knaufartige Struktur ein. Für die Entwicklung von selektiven Tumorvakzinen ist es von großer Bedeutung möglichst genau die Struktur der veränderten Zelloberflächenmoleküle nachzubilden. Durch die Synthese von cyclischen (Glyco)Peptiden wurde dieses Strukturelement fixiert. Dazu wurden olefinische Aminosäure Festphasenbausteine hergestellt, die zusammen mit den oben genannten Glycosylaminosäuren mittels einer Glycopeptid-Festphasensynthese in acyclische Glycopeptide eingebaut wurden. Diese wurden dann durch Ringschlussmetathese zyklisiert und im Anschluss reduziert und vollständig deblockiert. In einem dritten Projekt wurde der Syntheseweg zur Herstellung einer C-Glycosylaminosäure mit einer N-Acetylgalactosamin-Einheit entwickelt. Wichtige Schritte bei der von Glucosamin ausgehenden Synthese sind die Keck-Allylierung, eine Epimerisierung, die Herstellung eines Brom-Dehydroalanin-Derivates und eine B-Alkyl-Suzuki-Miyaura-Kreuzkupplung sowie Schutzgruppenoperationen. Der racemische Baustein konnte dann in der Peptid-Festphasensynthese eines komplexen MUC1-Tetanustoxin-Konjugates eingesetzt werden.

Identification of preferentially targeted tumor-associated antigens in melanoma patients via mRNA stimulation of CD8+ blood lymphocytes

Until now, therapeutic vaccination of cancer patients has mainly relied on rather few T cell epitopes processed from structurally normal shared tumor antigens and presented by frequent HLA alleles. So far the design of these studies has not addressed the individuality of tumor-host interactions, which are not only determined by the antigenic tumor phenotype or the natural HLA polymorphism, but also by the individual T cell repertoire. The procedure described herein was developed to identify the preferential targets of the individual repertoire from a panel of known shared tumor-associated antigens. Lymphocytes were isolated from the peripheral blood of cancer patients or healthy donors and stimulated twice with autologous mRNA-transfected FastDC (Dauer et al., J Immunol. 170:4069, 2003). FastDC were generated from blood monocytes and separately transfected via lipofection with in vitro transcribed mRNAs encoding the panel antigens. Responder lymphocytes were tested on day 12 in a 20-hour IFN-g ELISPOT assay for recognition of 293T cells co-transfected pairwise with plasmids encoding the stimulation antigens and the respective individual’s HLA class I alleles. In a first step, stimulation parameters were optimized for the detection of anti-HCMV pp65 responses. A maximum amplification of pp65-specific CD8+ T cell responses was obtained at a rather low IL-2 concentration (25 IU/ml) and at a minimum APC-to-effector ratio of 1:10. Addition of IL-4, IL-7 or IL-15 did not substantially improve the stimulatory potential. The test was applied to the human melanoma models D05 and MZ2, in both of which multiple T cell-defined antigens had previously been identified by expression screening. Blood lymphocytes were stimulated in parallel with autologous tumor cells and with mRNA-transfected FastDC. In D05, T cell reactivities against three out of eleven epitopes induced by stimulation with tumor cells were also found after stimulation with mRNA-transfected FastDC. Two further T cell target epitopes were identified with mRNA but not with tumor cell stimulation. In MZ2, T cell responses against five distinct epitopes were detected on day 12 after stimulation with mRNA transfectants. The same responses were detectable after stimulation with tumor cells only on day 32. mRNA stimulations against 21 tumor-associated antigens in addition to HCMV pp65 were performed in four healthy individuals. In all cases, CD8+ T cells against HCMV pp65 could be expanded. Among tumor-associated antigens, only reactivity against Melan-A/MART-1 in association with HLA-A*0201 was detectable in one of the donors. The vaccination of patients with targets a priori known to be recognized by their T cell repertoire may help to improve the outcome of therapeutic vaccination.

Antigen-dependent induction of a CD40 signal in peripheral B cells

Monoclonal antibodies have emerged as one of the most promising therapeutics in oncology over the last decades. The generation of fully human tumorantigen-specific antibodies suitable for anti-tumor therapy is laborious and difficult to achieve. Autoreactive B cells expressing those antibodies are detectable in cancer patients and represent a suitable source for human antibodies. However, the isolation and cultivation of this cell type is challenging. A novel method was established to identify antigen-specific B cells. The method is based on the conversion of the antigen independent CD40 signal into an antigen-specific one. For that, the artificial fusion proteins ABCos1 and ABCos2 (Antigen-specific B cell co-stimulator) were generated, which consist of an extracellular association-domain derived from the constant region of the human immunoglobulin (Ig) G1, a transmembrane fragment and an intracellular signal transducer domain derived of the cytoplasmic domain of the human CD40 receptor. By the association with endogenous Ig molecules the heterodimeric complex allows the antigen-specific stimulation of both the BCR and CD40. In this work the ability of the ABCos constructs to associate with endogenous IgG molecules was shown. Moreover, crosslinking of ABCos stimulates the activation of NF-κB in HEK293-lucNifty and induces proliferation in B cells. The stimulation of ABCos in transfected B cells results in an activation pattern different from that induced by the conventional CD40 signal. ABCos activated B cells show a mainly IgG isotype specific activation of memory B cells and are characterized by high proliferation and the differentiation into plasma cells. To validate the approach a model system was conducted: B cells were transfected with IVT-RNA encoding for anti-Plac1 B cell receptor (antigen-specific BCR), ABCos or both. The stimulation with the BCR specific Plac1 peptide induces proliferation only in the cotransfected B cell population. Moreover, we tested the method in human IgG+ memory B cells from CMV infected blood donors, in which the stimulation of ABCos transfected B cells with a CMV peptide induces antigen-specific expansion. These findings show that challenging ABCos transfected B cells with a specific antigen results in the activation and expansion of antigen-specific B cells and not only allows the identification but also cultivation of these B cells. The described method will help to identify antigen-specific B cells and can be used to characterize (tumor) autoantigen-specific B cells and allows the generation of fully human antibodies that can be used as diagnostic tool as well as in cancer therapy.

Synthese und immunologische Evaluierung von Antitumor-Impfstoffen aus dem epithelialen tumorassoziierten Mucin MUC1

Eine Immuntherapie von Tumorerkrankungen, die mit Hilfe von Antitumorimpfstoffen prophylaktisch und therapeutisch erfolgen könnte, wäre eine attraktive Alternative zu den bisher angewendeten Krebsbehandlungen. Aufgrund charakteristisch veränderter Aktivitäten von Glycosyltransferasen in der Glycoprotein-Biosynthese werden auf malignen Zellen stark verkürzte, frühzeitig sialylierte mucinartige Glycoproteine exprimiert. Diese verkürzten Kohlenhydrate repräsentieren tumorassoziierte Antigene. Sie haben zur Folge, dass Peptidepitope der Mucin-Glycoproteine, die auf gesundem Gewebe durch den hohen Glycosylierungsgrad maskiert sind, für das Immunsystem freiliegen. Diese Strukturunterschiede sollten einen selektiven Angriff auf das Tumorgewebe erlauben, ohne dass gesundes Gewebe beeinträchtigt wird, wenn es gelänge, das Immunsystem auf diese veränderten Strukturelemente zu fokussieren. Dabei ist es wichtig, dass die Immunantwort mit synthetisch definierten Glycopeptidepitopen ausgelöst wird, um Autoimmunreaktionen zu vermeiden. Somit ist die Synthese von exakt definierten tumorassoziierten Glycopeptiden von zentraler Bedeutung für die Entwicklung eines Antitumor-Impfstoffes. rnDa die tumorassoziierten Kohlenhydratstrukturen Antigene darstellen, die vom Immunsystem weitgehend toleriert werden, ist es notwendig, ihre Immunogenität mit Hilfe immunstimulierender Epitope so zu erhöhen, dass eine effiziente Immunreaktion erfolgt. Nach diesem Konzept wurden in der vorliegenden Arbeit Methoden und Strategien entwickelt, synthetische Impfstoff-Konjugate zu synthetisieren und immunologisch in Mausexperimenten zu evaluieren. So konnte gezeigt werden, das mit vollsynthetischen Analoga aus tumorassoziierten Glycopeptid-Oberflächenmolekülen in Kombination mit immunstimulierenden Substanzen, wie Trägerproteinen oder Mitogenen, hochselektive humorale Immunantworten ausgelöst werden können.rn

Synthese von tumorassoziierten Glycopeptiden basierend auf der epithelialen Struktur des MUC1

In epithelialen Tumorzellen zeigen Membranglycoproteine ein charakteristisch verändertes Glycosylierungsmuster, das durch eine veränderte Aktivität von Glycosyltransferasen hervorgerufen wird. Diese veränderte Aktivität führt zur Expression von stark verkürzten und frühzeitig sialylierten Kohlenhydratseitenketten der mucinartigen Glycoproteine auf Tumorzellen, welche als tumorassoziierte Antigene bezeichnet werden. Die tumorassoziierten Peptidepitope stellen eine wichtige Zielstruktur für eine potentielle selektive Immuntherapie dar. Das Ziel ist es, dass das Immunsystem zwischen den tumorassoziierten und den normal exprimierten Glycoproteinen unterscheiden kann, und damit in der Lage ist, eine selektiv gegen Tumorzellen gerichtete Immunantwort auszulösen. Daher ist eine Synthese von strukturell exakt definierten synthetischen Glycopeptiden und deren Einbau in Vakzine ein entscheidender Schritt für eine angestrebte Immuntherapie gegen Krebs. Ein Ziel dieser Arbeit war in diesem Zusammenhang die Synthese exakt definierter tumorassoziierter Glycopeptide, wobei Peptide aus der Tandem Repeat-Domäne des MUC1 synthetisiert wurden. Die verschiedenen Saccharidantigene wurden als glycosylierte Aminosäurebausteine in die immundominante Domäne der MUC1-Peptidsequenz eingebaut (TN-Antigen sowie das Sialyl-TN-Antigen, das (2,6)-Sialyl-T- und das (2,3)-Sialyl-T-Antigen). Zum einen wurden die MUC1-Glycopeptide anschließend über einen nicht immunogenen Triethylenglycol-Spacer an Carrier-Proteine wie Ovalbumin-OVA323-339-Sequenz und Rinderserumalbumin (BSA) konjugiert, so dass potenzielle Tumorvakzine erhalten wurden. Diese wurden in ersten ELISA-Experimenten untersucht und haben gezeigt, dass mit den synthetischen Glycopeptidantigenen feine Strukturunterschiede immunologisch differenziert werden können, was für die Unterscheidung zwischen Tumorzellen und gesunden Zellen bedeutsam ist. rnFür Immunisierungen ohne Freunds Adjuvanz wurde der TLR2-Agonist Pam3CSKKKK synthetisiert, der in einer Fragmentkondensation mit einem OVA-Spacer-MUC1-Glycopeptid konjugiert wurde. Die immunologischen Evaluierungen stehen noch aus.rnrn

Synthese und biologische Evaluierung von fluorierten und carbaanalogen Glycopeptiden für die Entwicklung von tumorselektiven Vakzinen

Tumorassoziierte Kohlenhydrat-Antigene werden von einer Vielzahl epithelialer Tumoren in erhöhtem Maße exprimiert und können sowohl als selektive Tumormarker, als auch als Zielstrukturen zur Entwicklung von synthetischen Krebsvakzinen dienen. Mucine, allen voran MUC1, sind hochgradig O-glycosylierte Zelloberflächenproteine, die im Fall maligner Zellen in deutlich überexprimierter Form mit charakteristisch veränderten Glycosylierungsmustern auftreten und somit vom Immunsystem erkannt werden können. Die relativ schwache Immunogenität und die geringe metabolische Stabilität dieser Glycopeptid-Epitope stehen jedoch der Entwicklung effizienter, auf Kohlenhydraten basierender Krebsvakzine entgegen.rnEin interessanter Ansatz, die Stabilität und Immunogenität der Vakzinbausteine zu erhöhen, ohne dabei deren Tumorspezifität nennenswert zu beeinträchtigen, stellt die Verwendung von modifizierten Glycopeptid-Konjugaten mit Kohlenhydratmimetika dar, z.B. basierend auf Fluor- und Carbazuckern. rnUm die Eignung solcher bislang unbekannter MUC1-Antigenanaloga als Vakzinbausteine zu untersuchen, konnten im Rahmen dieses Promotionsvorhabens Synthesen zu verschiedenen, modifizierten Antigen-Threonin-Konjugaten erarbeitet werden. Dabei konnte neben der erstmaligen Synthese eines in 6-Position fluorierten Carbazuckers auch ein 1→3 verknüpftes Carbadisaccharid synthetisiert werden. Zudem wurden mehrere Vertreter der in Position 6 bzw. 6‘ fluorierten TN, T und der beiden ST-Antigene dargestellt und über eine Festphasenpeptidsynthese in die aus 20 Aminosäuren bestehende tandem-repeat-Sequenz des MUC1 eingebaut. Eine anschließende Konjugation dieser Glycopeptide über einen nicht-immunogenen Spacer auf Triethylenglycol Basis an Carrierproteine wie BSA und das Tetanus Toxoid lieferte nicht nur potente Tumorvakzine, sondern auch die für die Durchführung von ELISA-Studien benötigten Glycopeptid-Konjugate. rnIn ersten ELISA und Neutralisationsexperimenten konnte gezeigt werden, dass bereits erhaltene Antikörper gegen strukturell sehr ähnliche Vakzine in der Lage sind, die neuartigen fluorierten Glycopeptide zu erkennen und an ihnen zu binden. Zusätzlich konnte erstmals in Impfstudien gezeigt werden, dass mit diesen neuen fluorierten Glycopeptid-TTox-Konjugaten nicht nur eine stakt toleranzbrechende humorale Immunantwort induziert werden kann, sondern auch dass diese MUC1 spezifischen Antikörper zudem in der Lage sind Brustkrebszellen der Linie MCF-7 zu erkennen und zu binden. rnrn

Analyse molekularer Mechanismen der Immundominanz MHC Klasse I-präsentierter Antigene bei Humaner Cytomegalovirus-Infektion

Das Humane Cytomegalovirus (HCMV) ist ein Erreger von großer klinischer Relevanz. Die HCMV-Infektion, die insbesondere bei immunsupprimierten Patienten mit hoher Morbidität und Mortalität assoziiert ist, wird vorwiegend durch CD8+-zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) kontrolliert. Das Tegumentprotein pp65 und das immediate early 1-Protein (IE1) waren als die dominanten CTL-Antigene bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, die zur Immundominanz des pp65 führenden molekularen Mechanismen aufzuklären und die Grundlagen für die Analyse der IE1-spezifischen Immunantwort zu erarbeiten. Durch Peptidimmunisierung HLA-A2-transgener Mäuse wurden hochaffine pp65-spezifische CTL-Klone generiert. Für die Generierung ähnlicher CTL-Klone gegen IE1 konnte erstmals ein konserviertes HLA-A2-bindendes Peptid identifiziert werden. Mit Hilfe der pp65-spezifischen CTL-Klone konnte gezeigt werden, dass das durch Viruspartikel in die Zelle eingebrachte pp65 die Erkennung infizierter Zellen durch CD8+-CTL vermittelt. Durch den Nachweis der außergewöhnlichen Stabilität von pp65 in der Zelle gelang es, eine hohe metabolische Umsatzrate als eine Ursache von Immundominanz auszuschließen. Dagegen hob die Blockierung des CRM1-vermittelten nukleären Exportweges durch Zugabe von Hemmstoffen oder Zutransfektion kompetitiver Inhibitoren die Erkennung des pp65 nahezu auf. Hiermit wurde erstmalig eine Abhängigkeit der Präsentation eines immundominanten nukleären Proteins vom nukleozytoplasmatischen Transport nachgewiesen. Die Erkenntnisse dieser Arbeit stellen die Grundlage für die detaillierte Analyse der Zusammenhänge zwischen nukleärem Export und Antigenpräsentation dar.

Einfluss immunevasiver Strategien des humanen Cytomegalovirus auf die MHC-Klasse-I-Präsentation der viralen Antigene pp65 und IE1

Das Humane Cytomegalovirus (HCMV) stellt eine große Bedrohung für Patienten mit geschwächtem oder unausgereiftem Immunsystem dar. Bei immunkompetenten Personen hingegen werden schwere Erkrankungen insbesondere durch die Wirkung antiviraler zytotoxischer CD8+-T-Lymphozyten (CTL) weitgehend verhindert. Aus Zellkultur-Systemen war bekannt, dass virale Glykoproteine, welche in der US2-US11-Region des HCMV-Genoms kodiert werden, inhibitorisch in den MHC-Klasse-I-Präsentationsweg eingreifen und somit die entsprechende Präsentation durch infizierte Zellen behindern. Über die Bedeutung dieser US2-US11-vermittelten Immunevasion für die Präsentation viraler Antigene im Kontext der Virusinfektion war jedoch nichts bekannt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte daher der Einfluss der Immunevasion auf die MHC-Klasse-I-Präsentation der beiden wichtigsten CTL-Zielstrukturen von HCMV, dem Tegumentprotein pp65 und dem regulatorischen immediate early Protein IE1, untersucht werden. In Ergänzung dazu sollte das immunevasive Potential eines durch HCMV kodierten Homologs des immunmodulatorischen Zytokins Interleukin-10 (cmvIL-10) analysiert werden. Hierzu wurden über Peptidimmunisierung HLA-A2-transgener Mäuse CTL-Klone hergestellt, welche ausgesuchte Peptide aus pp65 und IE1 in Assoziation mit HLA-A2 mit hoher Spezifität und Sensitivität erkannten. Auf diese Weise konnte eine direkte Beeinflussung der MHC-Klasse-I-Präsentation durch cmvIL-10 falsifiziert und somit der Hypothese, dass das von infizierten Zellen freigesetzte Zytokin die MHC-Klasse-I-Präsentation nicht infizierter Nachbarzellen beeinflussen könnte, widersprochen werden. Mit Hilfe einer US2-US11-Deletionsmutante des Virus konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Präsentation von sowohl pp65 als auch IE1 durch die Immunevasion beeinträchtigt wird. Dabei war die Präsentation des IE1-Peptids zu jedem untersuchten Zeitpunkt nach Infektion vollständig unterdrückt. Die Präsentation des pp65-Peptids hingegen war noch bis zu 72 Stunden nach Infektion detektierbar. Diese anhaltende Präsentation wurde dabei durch MHC-Klasse-I-Komplexe hervorgerufen, die trotz der Expression der US2-US11-Region an die Zelloberfläche transportiert wurden. Anhand des pp65 konnte somit erstmals gezeigt werden, dass die Immunevasion von HCMV Bildung und Transport bestimmter MHC-Klasse-I-Peptid-Komplexe zwar beeinträchtigen, jedoch nicht vollständig blockieren kann. Weitere Untersuchungen ergaben, dass die Präsentation von IE1-Peptiden durch das Vorhandensein des pp65-Proteins nicht beeinflusst wurde. Damit konnten aus der Literatur bekannte Daten anderer widerlegt werden. Mit Hilfe einer weiteren Virusmutante konnte schließlich gezeigt werden, das die Expression eines der Immunevasine, des gpUS11, hinreichend ist, die IE1-Präsentation vollständig zu unterdrücken, jedoch keinerlei messbaren Einfluss auf die Präsentation von pp65 ausübt. Die vorliegende Arbeit hat wichtige Erkenntnisse erbracht, die die Grundlage für weiterführende Untersuchungen zur Aufklärung der Bedeutung der einzelnen Immunevasionsgene für die Präsentation viraler Antigene im Rahmen der Virusinfektion darstellen.

Identifizierung und Charakterisierung T-zellerkannter tumorassoziierter Antigene im Melanommodell D41

In der vorliegenden Arbeit wurden Zielstrukturen autologer, tumorreaktiver CD8+ T-Zellen im Modell des Melanompatienten D41 charakterisiert, der im metastasierten Stadium nach Vakzinierung mit autologen dendritischen Zellen und bestrahlten Tumorzellen eine dauerhafte komplette Remission erreichte (O´Rourke et al., Melanoma Res. 17:316, 2007). Aus kryokonservierten Blutlymphozyten verschiedener Zeitpunkte wurden durch Stimulation mit autologen Tumorzellen (D41-MEL) in unabhängigen gemischten Lymphozyten-/Tumorzell-Kulturen (MLTCs) tumorreaktive CD8+ T-Zellen angereichert. Als Erstes wurde überprüft, ob sie gegen bekannte Melanomantigene in Assoziation mit den HLA-Klasse I-Allelen des Patienten gerichtet waren. Dabei zeigten sich Reaktivitäten gegen das melanosomale Differenzierungsantigen Melan-A mit HLA-A*0201 und darüber hinaus gegen die Cancer/Testis-Antigene (CTA) MAGE-A3 und MAGE-A6 mit HLA-A*0101, sowie NY-ESO-1, MAGE-A4 und MAGE-A10 mit HLA-A*0201. In einem zweiten Schritt wurde mit T-Zell-Klonen aus D41-MLTC 2, die keines dieser Antigene erkannten, eine cDNA-Expressionsbank von D41-MEL gescreent. Dies führte zur Klonierung einer für TSPY 1 (testis-specific protein Y-encoded 1) kodierenden cDNA mit einem der T-Zell-Klone. Er erkannte mit hoher Affinität die synthetischen TSPY 1-Peptide LLDDIMAEV (Aminosäurepositionen 66-73) und LLLDDIMAEV (Aminosäurepositionen 65-73) in Assoziation mit HLA-A*0201. Serologische Immunantworten gegen das als CTA einzustufende TSPY 1 sind bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals eine T-Zell-Antwort gegen TSPY 1 nachgewiesen. TSPY 1 trägt mutmaßlich zu Entstehung des Gonadoblastoms bei, seine Expression wurde jedoch z.B. auch in Seminomen, Leberzellkarzinomen und Melanomen nachgewiesen. Die Expression von TSPY 1 in der Zelllinie D41-MEL-Zellen war sehr heterogen. Einzelne Klone der Linie exprimierten TSPY 1 auf stabil hohem, andere Klone auf ebenso stabil intermediärem bzw. nicht detektierbarem Niveau. Die Expression und die Erkennung durch TSPY 1-reaktive T-Zell-Klone wurde durch die demethylierende Substanz 5-Aza-2´-deoxycytidine gesteigert. Dies spricht für eine Promotor-Hypermethylierung als Ursache fehlender bzw. niedriger Expression, wie dies für verschiedene CTA zutrifft. Die im Blut des Patienten D41 detektierbare antitumorale T-Zell-Reaktivität war bereits vor der Vakzinierung mit Tumorzellen nachweisbar und hatte sich somit spontan entwickelt. Ihre Individualität war vorgegeben durch das Antigenexpressionsmuster der D41-Tumorzellen, sowie durch den HLA-Phänotyp und mutmaßlich auch das T-Zellrepertoire des Patienten. Die detaillierte Analyse komplexer antitumoraler T-Zellantworten legt den Grundstein für eine Immuntherapie, die sich auf das tatsächliche Potential des individuellen T-Zellsystems stützen kann.

Synthese von selbstaggregierenden Glycopeptidkonjugaten mit (per)fluorierten Membranankern

Für eine effektive Erkennung tumorassoziierter Kohlenhydratantigene durch das Immun-system in der Krebs¬immuntherapie ist eine multivalente Präsentation der Haptene notwendig. In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuer Zugang zu einer solch räumlichen Konzentration der Haptene untersucht, indem MUC1-Antigene mit perfluorierten Alkylketten funktionalisiert und in einer geeigneten Lipidmatrix entmischt wurden. Perfluoralkyl-Amphiphile zeichnen sich durch eine hohe Entmischungstendenz in Alkyllipiden aus und bewirken dadurch eine Anreicherung der Erkennungsstrukturen (Haptene) in Analogie zu den natürlichen raft-Domänen auf der Zelloberfläche.rnDazu wurden zunächst verschiedene Membranankersysteme mit unterschiedlichem Fluorierungsgrad entwickelt. Beispielsweise konnte ausgehend von einem zentralen Glycerin-fragment ein Membrananker mit zwei Perfluoralkylketten hergestellt werden. Letztere wurden mittels radikalischer Perfluoralkylierung eingeführt, wobei der Fluorgehalt der Verbindung über die Kettenlänge gesteuert wurde. Daneben konnte ein weiteres Ankersystem, basierend auf der Aminosäure Lysin, synthetisiert werden, dass einen bequemen Einbau der Perfluoralkylketten durch Peptidkupplungen von entsprechenden perfluorierten Aminen bzw. perfluorierten Carbonsäuren erlaubte. In diesem Fall wurde der Fluorgehalt durch die Einführung von Alkyl- bzw. Perfluoralkylketten verändert.rnBeide Systeme konnten für erste Untersuchungen ihres Phasenverhaltens mit polaren Kopf-gruppen ausgestattet werden, wobei neben einem hydrophilen, nicht-immunogenen Triethylenglycolspacer vor allem ein TN-Antigen tragendes Dipeptid zum Einsatz kam. In Gegenwart des Matrixlipids DODAMA konnten in Langmuir-Blodgett-Untersuchungen mit diesen Verbindungen eine Entmischung und die Ausbildung mikroseparierter Bereiche nachgewiesen werden. Auch war es möglich, durch Anbindung eines Fluoreszenzfarbstoffes zu zeigen, dass solche amphiphilen Membrananker auf perfluorierten Oberflächen effektiv und dauerhaft immobilisiert werden können. Damit eröffnet diese Verbindungsklasse interessante Anwendungsmöglichkeiten in der Entwicklung von diagnostischen Microarray-Formaten.rnUm eine Anbindung der fluorierten Membrananker an den N-Terminus eines an fester Phase aufgebauten mucinanalogen Glycopeptids als antigene Einheit zu ermöglichen, wurde ein entsprechendes Ankersystem auf Basis von Glutaminsäure entwickelt. Dabei wurden an diese Verbindung neben dem TN-Antigen noch weitere komplexe tumorassoziierte Kohlenhydrat-antigene des Mucintyps angebunden, wobei der Aufbau der resultierenden amphiphilen Glycolipopeptide vollständig an der festen Phase gelang. Insgesamt konnten so mithilfe des teilfluorierten Lysinankers und des zweifach perfluorierten Glutaminsäureankers erste amphiphile Glycopeptid-Konjugate hergestellt werden, deren antigene Kopfgruppe aus einer 20 Aminosäuren umfassenden Wiederholungseinheit des Mucins MUC1 mit TN-, T- bzw. STN-Antigen-Seitenkette besteht. Derartige Verbindungen stellen reizvolle Bausteine für die Tumordiagnostik und für die Entwicklung von stabilen liposomalen Tumorvakzinen dar, da die verwendeten Perfluoralkylanker die Antigenpräsentation nicht wesentlich beeinflussen und die Bindung des Antikörpers nicht behindern. rn

Recent improvements in antigene technology

DNA triple helix based approaches to control and modulate cellular functions on the level of genomic DNA (antigene technology) suffered in the past from a stepmother like treatment in comparison to the flourishing field of oligonucleotide based control of translation (antisense technology). This was mostly due to lack of affinity of triplex forming oligonucleotides (TFOs) to their DNA target, to sequence restriciton constraints imposed by the triple helical recogniton motifs and by open questions to the accessibility of the target DNA. Recent developments in the area have brought about new bases that specifically recognize pyrimidine-purine inversion sites as well as sugar modifications, e.g. the 2'-aminoethoxy-oligonucleotides or oligonucleotides based on the locked nucleic acid (LNA) sugar unit, that greatly enhance triplex stability and alleviate in part the sequence restriction constraints. With this, sequence specific genomic DNA manipulation starts to become a useful tool in biotechnology

Linfoma renale del gatto:rilievi anatomopatologici, immunofenotipizzazione delle popolazioni linfocitarie ed espressione tissutale dell'antigene virale FeLV gp70.

Riassunto Il linfoma è una delle neoplasie più diffuse nel gatto. Questa neoplasia è stata classificata in base alla localizzazione anatomica nella forma Mediastinica (che interessa il timo e/o i linfonodi mediastinici), Alimentare, Multicentrica (che interessa diversi linfonodi e/o la milza e/o il fegato, Extranodale (che coinvolge i reni, SNC o la cute). Le cellule neoplastiche sono caratterizzate da diverse sottopopolazioni, che sono definite tramite immunofenotipizzazione ottenuta mediante tecniche immunoistochimiche (IHC), così che possano essere classificate come cellule B o T o non B/non T. I gatti infetti dal virus della leucemia felina (FeLV, Gammaretrovirus) presentano elevata incidenza di linfomi rispetto ai gatti non infetti. I meccanismi proposti di sviluppo neoplastico sono mutagenesi inserzionali o stimolazione persistente delle cellule immunitarie dell’ospite da parte di antigeni virali, i quali possono promuovere la trasformazione in senso maligno dei linfociti. Lo scopo di questo lavoro è stato esaminare i rilievi patologici, l’espressione di FeLV e l’immonofenotipo (B, T, nonB/nonT) nei reni felini affetti da linfoma. Abbiamo effettuato colorazione Ematossilina- Eosina ed Immunoistochimica per FeLV gp70, CD3 e CD79. Nello studio sono stati inclusi i tessuti di 49 gatti presentati all’Unità Operativa di Anatomia Patologica e Patologia Generale del Dipartimento di Scienze Medico Veterinarie dell’Università degli studi di Parma. Il 39% dei casi (19/49) sono caratterizzati dalla presenza di lesioni linfomatose a livello renale. Questa popolazione è costituita dal 52,6% 3 (10/19) maschi e dal 47,4% (9/19) femmine. L’età è compresa tra 8 mesi e 17 anni ed in particolare 26,6% (5/19) sono giovani (0-2 anni), 47,4% (9/19) sono adulti (2-10 anni) e 26,3% (5/19) sono anziani (>10 anni). Per quanto riguarda la classificazione anatomica la forma renale appare primitiva in 5 casi (25%), in 8 casi (42%) appare secondaria a linfomi multicentrici, in 3 casi (15,7%) a linfomi mediastinici e in altri 3 casi (15,7%) a linfomi gastrici e intestinali. Per quanto riguarda l’immunofenotipizzazione sono risultati CD3 positivi il 73,7% (14/19) e CD3 negativi il 27,3% (5/19); CD79 alpha positivi il 26,3% (5/19) e CD79 alpha negativi il 73,7% (14/19); l’espressione della proteina gp70 è stata individuata nel 78,9% (15/19) delle neoplasie renali, mentre il 21,1% (4/19) non presentava espressione della proteina. Nei 4 anni presi in considerazione nello studio si evince un’elevata incidenza della localizzazione anatomica renale sul totale di linfomi osservati. Non si è notata correlazione statistica tra linfomi renali, età e sesso dei soggetti presi in esame ma vi è un’elevata percentuale di animali adulti ed anziani affetti dalla patologia. Nella valutazione fenotipica dell’infiltrato neoplastico si è osservata l’elevata espressione di CD3, caratterizzando i linfociti come appartenenti alla sottopopolazione T. Inoltre si è evidenziato come un elevato numero di cellule neoplastiche esprimano gp70; ciò permette di affermare che i linfociti neoplastici sono infettati dal virus FeLV, il quale inoltre è in attiva replicazione. I marker CD3 e gp70 sono risultati fortemente correlati statisticamente; si può affermare perciò che l’espansione clonale dei linfociti T è correlata alla presenza e replicazione del virus.

Untersuchung molekularer Erkennungsreaktionen mit einem integriert-optischen Mach-Zehnder-Interferometer

Abstract (deutsch)Zielsetzung des Dissertationsvorhabens war die Beobachtung und Analyse von Gast-Wirt-Wechselwirkungen an oxidischen Oberflächen. Einer der Wechselwirkungspartner sollte dabei auf der Oberfläche immobilisiert, der andere in wäßriger Lösung darüber vorliegen.Eine empfindliche und oberflächensensitive Methode zur Beobachtung der Anlagerung unmarkierter Moleküle ist die Wellenleiterspektroskopie, insbesondere mit dem hier verwendeten und weiterentwickelten integriert-optischen Mach-Zehnder-Interferometer in Siliziumtechnik (Siliziumoxynitrid auf oxidiertem Siliziumwafer). Mit Hilfe des Interferometers wurden unterschiedliche Wirt-Gast-Systeme untersucht. Grundlage der Immobilisierung war jeweils die Funktionalisierung der Sensoroberfläche durch Selbstadsorption von Organosilanen. Durch unterschiedliche Organosilane, die zum Teil im Rahmen dieser Arbeit synthetisiert wurden, ließen sich die Wirtmoleküle beta-Cyclodextrin, Streptavidin, sowie unterschiedliche monoklonale Antikörperfragmente immobilisieren.- Der Einfluß der Oberfläche auf die Bindungsstärke des Wirtmoleküls beta-Cyclodextrin und unterschiedlicher Gastmoleküle wurde konzentrationsabhängig untersucht.- Silan-Biotinderivate mit unterschiedlicher Streptavidin-Affinität wurden an die Oberfläche immobilisiert und die Adsorption von Streptavidin an die Biotinderivate beobachtet. Dabei konnte unter anderem nachgewiesen werden, daß das Streptavidinadsorbat gequollen ist.- Als mögliche Anwendung wurde geprüft, ob das vorgestellte Interferometer durch die Funktionalisierung mit Antikörperfragmenten als Biosensor in Frage kommt. Es konnte nachgewiesen werden, daß sich Antikörper auf der Sensoroberfläche immobilisieren lassen und Antigene spezifisch an diese Antikörper adsorbieren.

Untersuchung des immunogenen Potentials von Dense Bodies des Humanen Cytomegalovirus (HCMV) als Grundlage für die Entwicklung einer neuartigen HCMV-Vakzine

ZusammenfassungDas Humane Cytomegalovirus (HCMV) ist ein Erreger von erheblicher klinischer Bedeutung. Eine HCMV-Vakzine ist bislang nicht verfügbar. Immunität ist nur durch eine Kombination effizienter humoraler und zellulärer Effektormechanismen zu vermitteln. Inhalt der Arbeit war es zu untersuchen, ob defekte virale Partikel, sog. Dense Bodies (DB) eine derartige Immunantwort gegen HCMV induzieren können. Die Immunisierung mit DB induzierte im Mausmodell die Bildung HCMV-neutralisierender Antikörper, die über ein Jahr hinweg im Serum der Tiere nachweisbar blieben. Die Spiegel an neutralisierenden Antikörpern waren mit Titern vergleichbar, die nach einer durchlaufenen, natürlichen HCMV-Infektion in menschlichen Seren gemessen wurden. Obwohl DB ein Totantigen darstellen und keine de novo-Synthese von viralen Proteinen vermitteln, stimulierten sie zudem eine deutliche HCMV-spezifische, zytotoxische T-Zell-Antwort (CTL-Antwort). Die Analyse der T-Helferzell-Antwort ergab, dass die Applikation von DB eine Th1-artige Immunantwort auslöste, die die Kontrolle einer Virusinfektion unterstützt. DB des HCMV sind folglich geeignet, sowohl humorale als auch zelluläre Immuneffektormechanismen effizient zu induzieren. Sie erwiesen sich als ein wirksames Antigentransportsystem, das als vielversprechende Grundlage für die Entwicklung einer rekombinanten HCMV-Vakzine dienen kann. Um die Immunogenität der DB für die Anwendung am Menschen weiter zu optimieren, müssen sie um zusätzliche Epitope ergänzt werden. Derartige rekombinante DB können nur durch Konstruktion mutanter HCMV-Genome generiert werden. Daher wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei Genombereiche des HCMV dahingehend charakterisiert, ob sie zur Insertion von Fremdsequenzen geeignet sind. Der Leserahmen UL32, der für das Phosphoprotein pp150 kodiert, erwies sich als essentiell. Mit der IE4-Region hingegen konnte ein 5 kB langes Genomfragment identifiziert werden, das aus dem Genom deletiert und gegen zusätzliche antigene Determinanten ausgetauscht werden kann. Zusammenfassend eröffnen die vorgestellten Ergebnisse neue Möglichkeiten zur Entwicklung eines wirksamen Impfstoffes gegen HCMV.