Die Synthese von Glycopeptiden und Glycopeptid-Protein-Konjugaten mit einer Partialstruktur des tumorassoziierten Mucins MUC1 zur Entwicklung von Tumorvakzinen

„Synthese von Glycopeptiden und Glycopeptid-Protein-Konjugaten mit einer Partialstruktur des tumorassoziierten Mucins MUC1 zur Entwicklung von Tumorvakzinen“ Das Glycoprotein MUC1 ist in Tumorepithelzellen sonderlich stark überexprimiert und wegen der vorzeitig einsetzenden Sialylierung sind die Saccharid-Epitope der O-Glycanketten stark verkürzt (sog. tumorassoziierte Antigene). Dadurch werden auch bisher verborgene Peptidepitope des Glycoprotein-Rückgrates auf der Zelloberfläche der Epithelzellen zugänglich, die als fremd von den Zellen des Immunsystems erkannt werden können. Dies macht das MUC1-Zelloberfächenmolekül zu einem Zielmolekül in der Entwicklung von Tumorvakzinen. Diese beiden strukturellen Besonderheiten wurden in der Synthese von Glycohexadecapeptiden verbunden, indem die veränderten tumorassoziierten Saccharidstrukturen TN-, STN- und T-Antigen als Glycosylaminosäure-Festphasenbausteine synthetisiert wurden und in das Peptidepitop der Wiederholungseinheit des MUC1 durch Glycopeptid-Festphasensynthese eingebaut wurden. Wegen der inhärenten schwachen Immunogenität der kurzen Glycopeptide müssen die synthetisierten Glycopeptidstrukturen an ein Trägerprotein, welches das Immunsystem stimuliert, gebunden werden. Zur Anbindung der Glycopeptide ist ein selektives Kupplungsverfahren nötig, um definierte und strukturell einheitliche Glycopeptid-Protein-Konjugate zu erhalten. Es konnte eine neue Methode entwickelt werden, bei der die Konjugation durch eine radikalische Additionsreaktion von als Allylamide funktionalisierten Glycopeptiden an ein Thiol-modifiziertes Trägerprotein erfolgte. Dazu wurde anhand von synthetisierten, als Allylamide modifizierten Modellaminosäuren untersucht, ob diese Reaktion generell für eine Biokonjugation geeignet ist und etwaige Nebenreaktionen auftreten können. Mit dieser Methode konnten verschiedene MUC1-Glycopeptid-Trägerprotein-Konjugate hergestellt werden, deren immunologische Untersuchung noch bevorsteht. Das tumorassoziierte MUC1 nimmt in der immundominanten Region seiner Wiederholungseinheit eine knaufartige Struktur ein. Für die Entwicklung von selektiven Tumorvakzinen ist es von großer Bedeutung möglichst genau die Struktur der veränderten Zelloberflächenmoleküle nachzubilden. Durch die Synthese von cyclischen (Glyco)Peptiden wurde dieses Strukturelement fixiert. Dazu wurden olefinische Aminosäure Festphasenbausteine hergestellt, die zusammen mit den oben genannten Glycosylaminosäuren mittels einer Glycopeptid-Festphasensynthese in acyclische Glycopeptide eingebaut wurden. Diese wurden dann durch Ringschlussmetathese zyklisiert und im Anschluss reduziert und vollständig deblockiert. In einem dritten Projekt wurde der Syntheseweg zur Herstellung einer C-Glycosylaminosäure mit einer N-Acetylgalactosamin-Einheit entwickelt. Wichtige Schritte bei der von Glucosamin ausgehenden Synthese sind die Keck-Allylierung, eine Epimerisierung, die Herstellung eines Brom-Dehydroalanin-Derivates und eine B-Alkyl-Suzuki-Miyaura-Kreuzkupplung sowie Schutzgruppenoperationen. Der racemische Baustein konnte dann in der Peptid-Festphasensynthese eines komplexen MUC1-Tetanustoxin-Konjugates eingesetzt werden.

„Synthesis of glycopeptides and glycopeptide-protein conjugates with a partial structure of tumor-associated mucin MUC1 for the development of antitumor vaccines“ The glycoprotein MUC1 is widely expressed by normal epithelial cells, but its expression is dramatically increased when the cells become malignant. Due to the premature sialylation carbohydrate epitopes are altered and extremely truncated. The aberrant glycosylation pattern exposes only short di- and tri-saccharide chains, and results in both the exposure of the cryptic core peptide epitopes and the exposure of the normally cryptic core TN and sialyl-TN (so called tumor-associated antigens), which might be recognized by the immune system. As a result, the MUC1 cell surface protein is a target molecule for the development of antitumor vaccines. These both structural features were combined by the synthesis of glycoheptadecapeptides. For that purpose the altered tumor-associated saccharides TN-, STN- and T-antigen were synthesized in form of glycosyl amino acids and were integrated into the peptide sequence of the MUC1 tandem repeat domain by the use of solid-phase peptide synthesis. Because of the inherent weak immunogenicity of glycopeptides with a low molecular weight, synthetic glycopeptides must be linked to a carrier protein stimulating the immune system. In order to obtain structurally uniform glycopeptide-protein conjugates a selective coupling procedure is needed. A novel method of bioconjugation was developed using the radical addition of an allylamide modified glycopeptide to a thiol modified carrier protein. Different allylamide modified amino acids and dipeptides were synthesized. The scope and limitation of the coupling procedure were investigated by the use of these surrogates. Several MUC1 glycopeptide-carrier protein conjugates were obtained using the novel conjugation method. With regard to the development of selective antitumor-vaccines it is important to reproduce the structure of the altered cell surface molecule as precise as possible. The epitope bearing the sequence PDTR within the tandem repeat is thought to have a knob-like structure. This structural feature was fixed by the synthesis of cyclic (glyco)peptides. Olefinic amino acids were synthesized and were integrated together with the above mentioned tumor-associated antigens into the partial sequence of the MUC1 tandem repeat domain using solid-phase peptide synthesis. The acyclic glycopeptides were cyclized via RCM, subsequently hydrogenated and finally deblocked. In a third project a C-glycosidic TN-analogon was synthesized. The reaction sequence started with Keck allylation of glucosamine followed by the epimerisation at the C-4 position. After having synthesized a -bromo-dehydroalanine derivate a B-alkyl-Suzuki-Miyaura cross-coupling and several protecting group manipulations followed. The racemic building block was integrated into a synthetic and complex tumor-associated MUC1/tetanus toxin epitope conjugate.