Identifizierung und Charakterisierung T-zellerkannter tumorassoziierter Antigene im Melanommodell D41

In der vorliegenden Arbeit wurden Zielstrukturen autologer, tumorreaktiver CD8+ T-Zellen im Modell des Melanompatienten D41 charakterisiert, der im metastasierten Stadium nach Vakzinierung mit autologen dendritischen Zellen und bestrahlten Tumorzellen eine dauerhafte komplette Remission erreichte (O´Rourke et al., Melanoma Res. 17:316, 2007). Aus kryokonservierten Blutlymphozyten verschiedener Zeitpunkte wurden durch Stimulation mit autologen Tumorzellen (D41-MEL) in unabhängigen gemischten Lymphozyten-/Tumorzell-Kulturen (MLTCs) tumorreaktive CD8+ T-Zellen angereichert. Als Erstes wurde überprüft, ob sie gegen bekannte Melanomantigene in Assoziation mit den HLA-Klasse I-Allelen des Patienten gerichtet waren. Dabei zeigten sich Reaktivitäten gegen das melanosomale Differenzierungsantigen Melan-A mit HLA-A*0201 und darüber hinaus gegen die Cancer/Testis-Antigene (CTA) MAGE-A3 und MAGE-A6 mit HLA-A*0101, sowie NY-ESO-1, MAGE-A4 und MAGE-A10 mit HLA-A*0201. In einem zweiten Schritt wurde mit T-Zell-Klonen aus D41-MLTC 2, die keines dieser Antigene erkannten, eine cDNA-Expressionsbank von D41-MEL gescreent. Dies führte zur Klonierung einer für TSPY 1 (testis-specific protein Y-encoded 1) kodierenden cDNA mit einem der T-Zell-Klone. Er erkannte mit hoher Affinität die synthetischen TSPY 1-Peptide LLDDIMAEV (Aminosäurepositionen 66-73) und LLLDDIMAEV (Aminosäurepositionen 65-73) in Assoziation mit HLA-A*0201. Serologische Immunantworten gegen das als CTA einzustufende TSPY 1 sind bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals eine T-Zell-Antwort gegen TSPY 1 nachgewiesen. TSPY 1 trägt mutmaßlich zu Entstehung des Gonadoblastoms bei, seine Expression wurde jedoch z.B. auch in Seminomen, Leberzellkarzinomen und Melanomen nachgewiesen. Die Expression von TSPY 1 in der Zelllinie D41-MEL-Zellen war sehr heterogen. Einzelne Klone der Linie exprimierten TSPY 1 auf stabil hohem, andere Klone auf ebenso stabil intermediärem bzw. nicht detektierbarem Niveau. Die Expression und die Erkennung durch TSPY 1-reaktive T-Zell-Klone wurde durch die demethylierende Substanz 5-Aza-2´-deoxycytidine gesteigert. Dies spricht für eine Promotor-Hypermethylierung als Ursache fehlender bzw. niedriger Expression, wie dies für verschiedene CTA zutrifft. Die im Blut des Patienten D41 detektierbare antitumorale T-Zell-Reaktivität war bereits vor der Vakzinierung mit Tumorzellen nachweisbar und hatte sich somit spontan entwickelt. Ihre Individualität war vorgegeben durch das Antigenexpressionsmuster der D41-Tumorzellen, sowie durch den HLA-Phänotyp und mutmaßlich auch das T-Zellrepertoire des Patienten. Die detaillierte Analyse komplexer antitumoraler T-Zellantworten legt den Grundstein für eine Immuntherapie, die sich auf das tatsächliche Potential des individuellen T-Zellsystems stützen kann.

Within this dissertation, the targets of autologous tumor-reactive CD8+ T cells have been identified in a human melanoma model derived from the patient D41. Patient D41 has been diagnosed with metastatic disease and has participated in a phase I/II clinical trial on therapeutic vaccination with a mixture of autologous dendritic cells and irradiated tumor cells. In the course of vaccination he has achieved a durable complete remission (O´Rourke et al., Melanoma Res. 17:316, 2007). In independent mixed lymphocyte/tumor cell cultures (MLTCs) tumor-reactive CD8+ T cells have been enriched by stimulation of cryopreserved peripheral blood lymphocytes obtained at different time points during the study with autologous tumor cells (D41-MEL). In a first step, the reactivity of D41 MLTCs has been tested against a panel of known melanoma-associated antigens in association with all of the patient´s HLA-class I alleles. Thereby reactivities against the melanosomal differentiation antigen Melan-A (with HLA A*0201) as well as Cancer/Testis antigens (CTA) MAGE A3, MAGE-A6 (both with HLA-A*0101), NY-ESO-1, MAGE-A4 and MAGE-A10 (all three with HLA A*0201) have been detected. In a second step, T-cell clones (CTL) with unknown specificities have been applied to the expression screening of a cDNA library constructed from D41 MEL. This has led to the identification of an antigen encoded by the gene testis-specific protein Y-encoded 1 (TSPY 1) and recognized by one of these CTL in association with HLA-A*0201. The TSPY 1 peptides LLDDIMAEV (TSPY166-173) and LLLDDIMAEV (TSPY165-173) have been found to induce half-maximal T-cell recognition at concentrations below 1 ng/ml. Antibody responses against TSPY 1, which can be classified as a Cancer/Testis antigen (CTA), have been reported previously. Within this dissertation, an anti-TSPY 1 CD8+ T cell response has been observed for the first time. TSPY 1 is regarded as a potential gonadoblastoma oncogene. It is known to be expressed also in seminomas, hepatocellular carcinomas and melanomas. The TSPY 1 expression in the melanoma-cell line D41-MEL has been very heterogeneous. The expression levels in single D41 MEL clones have been found to be stable over time and to range from high or intermediate to not detectable according to quantitative RTR-PCR. Treatment of D41-melanoma cells with the demethylating agent 5 aza 2' deoxycytidine has increased both the TSPY 1 expression as well as the recognition by TSPY 1-reactive CTLs. This can be due to promoter hypermethylation as observed for many CTAs. Antitumoral T-cell reactivity has been detected in the blood of the patient D41 already before vaccination and has, therefore, developed spontaneously. Its individuality has been determined by the antigen-expression pattern of the D41-melanoma cells, the patient´s HLA phenotype and presumably his particular T-cell repertoire. The detailed analysis of antitumoral T-cell responses will form the basis for individualized vaccination approaches which can fully exploit the potential of the individual T-cell system.