Synthese von selbstaggregierenden Glycopeptidkonjugaten mit (per)fluorierten Membranankern

Für eine effektive Erkennung tumorassoziierter Kohlenhydratantigene durch das Immun-system in der Krebs¬immuntherapie ist eine multivalente Präsentation der Haptene notwendig. In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuer Zugang zu einer solch räumlichen Konzentration der Haptene untersucht, indem MUC1-Antigene mit perfluorierten Alkylketten funktionalisiert und in einer geeigneten Lipidmatrix entmischt wurden. Perfluoralkyl-Amphiphile zeichnen sich durch eine hohe Entmischungstendenz in Alkyllipiden aus und bewirken dadurch eine Anreicherung der Erkennungsstrukturen (Haptene) in Analogie zu den natürlichen raft-Domänen auf der Zelloberfläche.rnDazu wurden zunächst verschiedene Membranankersysteme mit unterschiedlichem Fluorierungsgrad entwickelt. Beispielsweise konnte ausgehend von einem zentralen Glycerin-fragment ein Membrananker mit zwei Perfluoralkylketten hergestellt werden. Letztere wurden mittels radikalischer Perfluoralkylierung eingeführt, wobei der Fluorgehalt der Verbindung über die Kettenlänge gesteuert wurde. Daneben konnte ein weiteres Ankersystem, basierend auf der Aminosäure Lysin, synthetisiert werden, dass einen bequemen Einbau der Perfluoralkylketten durch Peptidkupplungen von entsprechenden perfluorierten Aminen bzw. perfluorierten Carbonsäuren erlaubte. In diesem Fall wurde der Fluorgehalt durch die Einführung von Alkyl- bzw. Perfluoralkylketten verändert.rnBeide Systeme konnten für erste Untersuchungen ihres Phasenverhaltens mit polaren Kopf-gruppen ausgestattet werden, wobei neben einem hydrophilen, nicht-immunogenen Triethylenglycolspacer vor allem ein TN-Antigen tragendes Dipeptid zum Einsatz kam. In Gegenwart des Matrixlipids DODAMA konnten in Langmuir-Blodgett-Untersuchungen mit diesen Verbindungen eine Entmischung und die Ausbildung mikroseparierter Bereiche nachgewiesen werden. Auch war es möglich, durch Anbindung eines Fluoreszenzfarbstoffes zu zeigen, dass solche amphiphilen Membrananker auf perfluorierten Oberflächen effektiv und dauerhaft immobilisiert werden können. Damit eröffnet diese Verbindungsklasse interessante Anwendungsmöglichkeiten in der Entwicklung von diagnostischen Microarray-Formaten.rnUm eine Anbindung der fluorierten Membrananker an den N-Terminus eines an fester Phase aufgebauten mucinanalogen Glycopeptids als antigene Einheit zu ermöglichen, wurde ein entsprechendes Ankersystem auf Basis von Glutaminsäure entwickelt. Dabei wurden an diese Verbindung neben dem TN-Antigen noch weitere komplexe tumorassoziierte Kohlenhydrat-antigene des Mucintyps angebunden, wobei der Aufbau der resultierenden amphiphilen Glycolipopeptide vollständig an der festen Phase gelang. Insgesamt konnten so mithilfe des teilfluorierten Lysinankers und des zweifach perfluorierten Glutaminsäureankers erste amphiphile Glycopeptid-Konjugate hergestellt werden, deren antigene Kopfgruppe aus einer 20 Aminosäuren umfassenden Wiederholungseinheit des Mucins MUC1 mit TN-, T- bzw. STN-Antigen-Seitenkette besteht. Derartige Verbindungen stellen reizvolle Bausteine für die Tumordiagnostik und für die Entwicklung von stabilen liposomalen Tumorvakzinen dar, da die verwendeten Perfluoralkylanker die Antigenpräsentation nicht wesentlich beeinflussen und die Bindung des Antikörpers nicht behindern. rn

For an effective recognition of tumor-associated carbohydrate antigens by the immune system in cancer immune therapies a multivalent presentation of the haptenes is necessary. In the work presented here a novel approach for such a spatial concentration of haptenes is explored by functionalization of MUC1-antigens with perfluorinated alkyl groups, and subsequent separation in a suitable lipid matrix. Perfluoroalkylated amphiphiles are characterized by a high tendency of demixing in alkyl lipids and thus they cause an enrichment of the recognition motifs (haptenes) analogous to natural raft-domains on cell surfaces. rnFor this purpose different membrane anchor systems with varying degrees of fluorination were developed. For example, a membrane anchor with two perfluoroalkylated chains could be prepared starting from a central glycerin fragment. The perfluoroalkyl groups were introduced by a radical perfluoroalkylation protocol, whereas the content of fluorine atoms is tuned by the chain length. Additionally a second anchor system could be synthesized. This system is based on the amino acid lysine and permits the introduction of perfluoroalkyl chains through peptide coupling of appropriate amines and the respective carboxylic acids. In this case the degree of fluorination was altered by the introduction of alkyl chains or perfluoroalkyl chains.rnFor preliminary investigations of their phase separation behavior both systems could be provided with polar head groups, whereby apart from a hydrophilic, non-immunogenic triethylene glycol spacer especially a TN-antigen bearing dipeptide was deployed. With these compounds demixing and formation of micro separated areas could be detected in the presence of the matrix lipid DODAMA by Langmuir-Blodgett experiments. Furthermore it was possible to effectively and permanently immobilize such amphiphilic membrane anchors onto perfluorinated surfaces as shown by the attachment of a fluorescent dye. Therefore, this class of compounds represents promising candidates in the development of new diagnostic microarray formats.rnFor the linkage of fluorinated membrane anchors to the N-terminus of a mucin-analogue glycopeptide, synthesized on solid phase as antigenic unit, an alternative anchor system based on glutamic acid was developed. In addition to the TN-antigen further complex tumor-associated carbohydrate antigens were attached to the membrane anchors. The synthesis of the resulting amphiphilic glycolipoconjugates was conducted solely on the solid phase. Altogether the first amphiphilic glycopeptide conjugates with the semi-fluorinated lysine anchor and the twofold fluorinated glutamic acid anchor could be prepared in which the antigenic head group consists of a 20 amino acid comprising tandem repeat sequence of the mucin MUC1 with a TN-, T- or STN-antigen side chain. Such compounds display attractive building blocks for tumor detection and for the development of stable, liposomal tumor vaccines because the employed perfluoroalkylated anchors did not affect the antigen presentation and did not interfere with the binding of the antibodies.rn