Zur Struktur und Funktion der Typ-3-Kupferproteine sowie der Lichtsammlerkomplexe LHCI und LHCII

In der vorliegenden Arbeit wurden die bioinformatischen Methoden der Homologie-Modellierung und Molekularen Modellierung dazu benutzt, die dreidimensionalen Strukturen verschiedenster Proteine vorherzusagen und zu analysieren. Experimentelle Befunde aus Laborversuchen wurden dazu benutzt, die Genauigkeit der Homologie-Modelle zu erhöhen. Die Ergebnisse aus den Modellierungen wurden wiederum dazu benutzt, um neue experimentelle Versuche vorzuschlagen. Anhand der erstellten Modelle und bekannten Kristallstrukturen aus der Protein-Datenbank PDB wurde die Struktur-Funktionsbeziehung verschiedener Tyrosinasen untersucht. Dazu gehörten sowohl die Tyrosinase des Bakteriums Streptomyces als auch die Tyrosinase der Hausmaus. Aus den vergleichenden Strukturanalysen der Tyrosinasen resultierten Mechanismen für die Monophenolhydroxylase-Aktivität der Tyrosinasen sowie für den Import der Kupferionen ins aktive Zentrum. Es konnte der Beweis geführt werden, daß die Blockade des CuA-Zentrums tatsächlich der Grund für die unterschiedliche Aktivität von Tyrosinasen und Catecholoxidasen ist. Zum ersten Mal konnte mit der Maus-Tyrosinase ein vollständiges Strukturmodell einer Säugetier-Tyrosinase erstellt werden, das dazu in der Lage ist, die Mechanismen bekannter Albino-Mutationen auf molekularer Ebene zu erklären. Die auf der Basis des ermittelten 3D-Modells gewonnenen Erkenntnisse über die Wichtigkeit bestimmter Aminosäuren für die Funktion wurde durch gerichtete Mutagenese an der rekombinant hergestellten Maus-Tyrosinase getestet und bestätigt. Weiterhin wurde die Struktur der Tyrosinase des Krebses Palinurus elephas durch eine niedrigaufgelöste 3D-Rekonstruktion aus elektronenmikroskopischen Bildern aufgeklärt. Der zweite große Themenkomplex umfasst die Strukturanalyse der Lichtsammlerkomplexe LHCI-730 und LHCII. Im Falle des LHCII konnte der Oligomerisierungszustand der LHCMoleküle mit diskreten Konformationen des N-Terminus korreliert werden. Auch hier kam eine Kombination von Homologie-Modellierung und einer experimentellen Methode, der Elektronen-Spin-Resonanz-Messung, zum Einsatz. Die Änderung des Oligomerisierungszustands des LHCII kontrolliert den Energiezufluß zu den Photosystemen PS I und PS II. Des Weiteren wurde ein vollständiges Modell des LHCI-730 erstellt, um die Auswirkungen gerichteter Mutagenese auf das Dimerisierungsverhalten zu untersuchen. Auf Basis dieses Modells wurden die Wechselwirkungen zwischen den Monomeren Lhca1 und Lhca4 evaluiert und potentielle Bindungspartner identifiziert.

Functionalization and detection of RNA and its modifications

Unterschiedlich substituierte Reagenzien, basierend auf dem Cumarin Körper, wurden untersucht und Struktur-Funktions-Beziehungsstudien zeigten eine Selektivität für ein natürlich vorkommendes, modifiziertes Nukleosid, 4-Thiouridine (s4U). Im Verlauf dieser Experimente, fiel ein multifunktionales Cumarin, namens PBC, aus mehreren Gründen auf. Neben seiner 2000 fachen Selektivität für s4U gegenüber Uridin, besitzt PBC ein zusätzliches terminales Alkin für Konjugationsreaktionen mit Aziden. Es wurde zusätzlich zur Fluoreszenzmarkierung von small interfering RNA benutzt, deren Fluoreszenz in Zellen beobachtet werden konnte. Mit PBC kommt ein neues chemisches Reagenz zur Detektion von modifizierten Nukleosiden zum bereits vorhandenen Repertoire hinzu.rnDiese Arbeit zeigt zusätzlich eine neue Labelingstrategie, basierend auf einem kleinen, multifunktionalen chemischen Reagenz, welches spezifisch mit Uridinen in RNA reagiert. Dieses Cumarin-basierte Reagenz, namens N3BC, hat den Vorteil (I) post-transkriptionell gegenüber allen möglichen RNAs einsetzbar zu sein, (II) Fluoreszenz zu zeigen und (III) eine weitere funktionelle Gruppe zu besitzen, die in Biokonjugationsreaktionen einsetzbar ist. Die letzteren umfassen z.B. die durch UV ausgelösten crosslinking Experimente mit verwandten Proteinen, sowie die bioorthognale CuAAC Reaktion mit fluoreszenten Alkin-Farbstoffen.rnFür verlässliche Detektion wurden mehrere LC-MS/MS Methoden, zur Identifizierung und Quantifizierung von bis zu 21 Ribonukleosiden und 5 Deoxyribonukleosiden in einem Einzellauf, entwickelt. Zusätzlich wurden diese Methoden in mehreren Studien, hauptsächlich von Methyltransferasen, angewandt. rn

Na +-coupled betaine symporters involved in osmotic stress response in prokaryotes and eukaryotes

The betaine/GABA transporter BGT1 is one of the most important osmolyte transporters in the kidney. BGT1 is a member of the neurotransmitter sodium symporter (NSS) family, facilitates Na+/Cl--coupled betaine uptake to cope with hyperosmotic stress. Betaine transport in kidney cells is upregulated under hypertonic conditions by a yet unknown mechanism when increasing amounts of intracellular BGT1 are inserted into the plasma membrane. Re-establishing isotonicity results in ensuing depletion of BGT1 from the membrane. BGT1 phosphorylation on serines and threonines might be a regulation mechanism. In the present study, four potential PKC phosphorylation sites were mutated to alanines and the responses to PKC activators, phorbol 12-myristate acetate (PMA) and dioctanoyl-sn-glycerol (DOG) were determined. GABA-sensitive currents were diminished after 30 min preincubation with these PKC activators. Staurosporine blocked the response to DOG. Three mutants evoked normal GABA-sensitive currents but currents in oocytes expressing the mutant T40A were greatly diminished. [3H]GABA uptake was also determined in HEK-293 cells expressing EGFP-tagged BGT1 with the same mutations. Three mutants showed normal upregulation of GABA uptake after hypertonic stress, and downregulation by PMA was normal compared to EGFP-BGT1. In contrast, GABA uptake by the T40A mutant showed no response to hypertonicity or PMA. Confocal microscopy of the EGFP-BGT1 mutants expressed in MDCK cells, grown on glass or filters, revealed that T40A was present in the cytoplasm after 24 h hypertonic stress while the other mutants and EGFP-BGT1 were predominantely present in the plasma membrane. All four mutants co-migrated with EGFP-BGT1 on Western blots suggesting they are full-length proteins. In conclusion, T235, S428, and S564 are not involved in downregulation of BGT1 due to phosphorylation by PKC. However, T40 near the N-terminus may be part of a hot spot important for normal trafficking or insertion of BGT1 into the plasma membrane. Additionally, a link between substrate transport regulation, insertion of BGT1 into the plasma membrane and N-glycosylation in the extracellular loop 2 (EL2) could be revealed. The functional importance of two predicted N-glycosylation sites, which are conserved in EL2 within the NSS family were investigated for trafficking, transport and regulated plasma membrane insertion by immunogold-labelling, electron microscopy, mutagenesis, two-electrode voltage clamp measurements in Xenopus laevis oocytes and uptake of radioactive-labelled substrate into MDCK cells. Trafficking and plasma membrane insertion of BGT1 was clearly promoted by proper N-glycosylation in both, oocytes and MDCK cells. De-glycosylation with PNGase F or tunicamycin led to a decrease in substrate affinity and transport rate. Mutagenesis studies revealed that in BGT1 N183 is the major N-glycosylation site responsible for full protein activity. Replacement of N183 with aspartate resulted in a mutant, which was not able to bind N-glycans suggesting that N171 is a non-glycosylated site in BGT1. N183D exhibited close to WT transport properties in oocytes. Surprisingly, in MDCK cells plasma membrane insertion of the N183D mutant was no longer regulated by osmotic stress indicating unambiguously that association with N-glycans at this position is linked to osmotic stress-induced transport regulation in BGT1. The molecular transport mechanism of BGT1 remains largely unknown in the absence of a crystal structure. Therefore investigating the structure-function relationship of BGT1 by a combination of structural biology (2D and 3D crystallization) and membrane protein biochemistry (cell culture, substrate transport by radioactive labeled GABA uptake into cells and proteoliposomes) was the aim of this work. While the functional assays are well established, structure determination of eukaryotic membrane transporters is still a challenge. Therefore, a suitable heterologous expression system could be defined, starting with cloning and overexpression of an optimized gene. The achieved expression levels in P. pastoris were high enough to proceed with isolation of BGT1. Furthermore, purification protocols could be established and resulted in pure protein, which could even be reconstituted in an active form. The quality and homogeneity of the protein allowed already 2D and 3D crystallization, in which initial crystals could be obtained. Interestingly, the striking structural similarity of BGT1 to the bacterial betaine transporter BetP, which became a paradigm for osmoregulated betaine transport, provided information on substrate coordination in BGT1. The structure of a BetP mutant that showed activity for GABA was solved to 3.2Å in complex with GABA in an inward facing open state. This structure shed some light into the molecular transport mechanisms in BGT1 and might help in future to design conformationally locked BGT1 to enforce the on-going structure determination.

Spin polarized transport in manganese oxide double-perovskite thin films

Gegenstand dieser Arbeit war die Untersuchung von metallischen gemischtvalenten Manganaten und magnetischen Doppelperowskiten. Aufgrund ihres großen negativen Magnetowiderstandes (MW) sind diese halbmetallischen Oxide interessant für mögliche technische Anwendungen, z.B. als Leseköpfe in Festplatten. Es wurden die kristallographischen, elektronischen und magnetischen Eigenschaften von epitaktischen Dünnschichten und polykristallinen Pulverproben bestimmt.Epitaktische Dünnschichten der Verbindungen La_0.67Ca_0.33MnO₃ und La_0.67Sr_0.33MnO₃ wurdenmit Kaltkathodenzerstäubung und Laserablation auf einkristallinen Substraten wie SrTiO₃abgeschieden. Mit Hall-Effekt Messungen wurde ein Zusammenbruch der Ladungsträgerdichte bei der Curie-Temperatur T_C beobachtet.Mit dem Wechsel des Dotierungsatoms A von Ca (T_C=232 K) zu Sr (T_C=345 K)in La_0.67A_0.33MnO₃ konnte die Feldsensitivität des Widerstandes bei Raumtemperatur gesteigert werden. Um die Sensitivität weiter zu erhöhen wurde die hohe Spinpolarisation von nahezu 100% in Tunnelexperimenten ausgenutzt. Dazu wurden biepitaktische La_0.67Ca_0.33MnO₃ Schichten auf SrTiO₃ Bikristallsubstraten hergestellt. Die Abhängigkeit des Tunnelmagnetowiderstandes (TMW) vom magnetischen Feld, Temperatur und Strum war ein Schwerpunkt der Untersuchung. Mittels spinpolarisierten Tunnelns durch die künstliche Korngrenze konnte ein hysteretischer TMW von 70% bei 4 K in kleinen Magnetfeldern von 120 Oe gemessen werden. Eine weitere magnetische Oxidverbindung, der Doppelperowskit Sr₂FeMoO₆ miteine Curie-Temperatur oberhalb 400 K und einem großen MW wurde mittels Laserablation hergestellt. Die Proben zeigten erstmals das Sättigunsmoment, welches von einer idealen ferrimagnetischen Anordnung der Fe und Mo Ionen erwartet wird. Mit Hilfe von Magnetotransportmessungen und Röntgendiffraktometrie konnte eine Abhängigkeit zwischen Kristallstruktur (Ordnung oder Unordnung im Fe, Mo Untergitter) und elektronischem Transport (metallisch oder halbleitend) aufgedeckt werden.Eine zweiter Doppelperowskit Ca₂FeReO₆ wurde im Detail als Pulverprobe untersucht. Diese Verbindung besitzt die höchste Curie-Temperatur von 540 K, die bis jetzt in magnetischen Perowskiten gefunden wurde. Mit Neutronenstreuung wurde eine verzerrte monoklinische Struktur und eine Phasenseparation aufgedeckt.

On the development of novel cocaine-analogues for in vivo imaging of the dopamine transporter status

The present thesis is concerned with the development of novel cocaine-derived dopamine transporter ligands for the non-invasive exploration of the striatal and extra-striatal dopamine transporter (DAT) in living systems. The presynaptic dopamine transporter acquires an important function within the mediation of dopaminergic signal transduction. Its availability can serve as a measure for the overall integrity of the dopaminergic system. The DAT is upregulated in early Parkinson’s disease (PD), resulting in an increased availability of DAT-binding sites in the striatal DAT domains. Thereby, DAT imaging has become an important routine diagnostic tool for the early diagnosis of PD in patients, as well as for the differentiation of PD from symptomatically similar medical conditions. Furthermore, the dopaminergic system is involved in a variety of psychiatric diseases. In this regard, DAT-selective imaging agents may provide detailed insights into the scientific understanding of the biochemical background of both, the progress as well as the origins of the symptoms. DAT-imaging may also contribute to the determination of the dopaminergic therapeutic response for a given medication and thereby contribute to more convenient conditions for the patient. From an imaging point of view, the former demands a high availability of the radioactive probe to facilitate broad application of the modality, whereas the latter profits from short-lived probes, suitable for multi-injection studies. Therefore, labelling with longer-lived 18F-fluoride and in particular the generator nuclide 68Ga is worthwhile for clinical routine imaging. In contrast, the introduction of a 11C-label is a prerequisite for detailed scientific studies of neuronal interactions. The development of suitable DAT-ligands for medical imaging has often been complicated by the mixed binding profile of many compounds that that interact with the DAT. Other drawbacks have included high non-specific binding, extensive metabolism and slow accumulation in the DAT-rich brain areas. However, some recent examples have partially overcome the mentioned complications. Based on the structural speciality of these leads, novel ligand structures were designed and successfully synthesised in the present work. A structure activity relationship (SAR) study was conducted wherein the new structural modifications were examined for their influence on DAT-affinity and selectivity. Two of the compounds showed improvements in in vitro affinity for the DAT as well as selectivity versus the serotonin transporter (SERT) and norepinephrine transporter (NET). The main effort was focussed on the high-affinity candidate PR04.MZ, which was subsequently labelled with 18F and 11C in high yield. An initial pharmacological characterisation of PR04.MZ in rodents revealed highly specific binding to the target brain structures. As a result of low non-specific binding, the DAT-rich striatal area was clearly visualised by autoradiography and µPET. Furthermore, the radioactivity uptake into the DAT-rich brain regions was rapid and indicated fast binding equilibrium. No radioactive metabolite was found in the rat brain. [18F]PR04.MZ and [11C]PR04.MZ were compared in the primate brain and the plasma metabolism was studied. It was found that the ligands specifically visualise the DAT in high and low density in the primate brain. The activity uptake was rapid and quantitative evaluation by Logan graphical analysis and simplified reference tissue model was possible after a scanning time of 30 min. These results further reflect the good characteristics of PR04.MZ as a selective ligand of the neuronal DAT. To pursue 68Ga-labelling of the DAT, initial synthetic studies were performed as part of the present thesis. Thereby, a concept for the convenient preparation of novel bifunctional chelators (BFCs) was developed. Furthermore, the suitability of novel 1,4,7-triazacyclononane based N3S3-type BFCs for biomolecule-chelator conjugates of sufficient lipophilicity for the penetration of the blood-brain-barrier was elucidated.

Molecular dynamics simulations of silicate and borate glasses and melts : structure, diffusion dynamics and vibrational properties

Molecular dynamics simulations of silicate and borate glasses and melts: Structure, diffusion dynamics and vibrational properties. In this work computer simulations of the model glass formers SiO2 and B2O3 are presented, using the techniques of classical molecular dynamics (MD) simulations and quantum mechanical calculations, based on density functional theory (DFT). The latter limits the system size to about 100−200 atoms. SiO2 and B2O3 are the two most important network formers for industrial applications of oxide glasses. Glass samples are generated by means of a quench from the melt with classical MD simulations and a subsequent structural relaxation with DFT forces. In addition, full ab initio quenches are carried out with a significantly faster cooling rate. In principle, the structural properties are in good agreement with experimental results from neutron and X-ray scattering, in all cases. A special focus is on the study of vibrational properties, as they give access to low-temperature thermodynamic properties. The vibrational spectra are calculated by the so-called ”frozen phonon” method. In all cases, the DFT curves show an acceptable agreement with experimental results of inelastic neutron scattering. In case of the model glass former B2O3, a new classical interaction potential is parametrized, based on the liquid trajectory of an ab initio MD simulation at 2300 K. In this course, a structural fitting routine is used. The inclusion of 3-body angular interactions leads to a significantly improved agreement of the liquid properties of the classical MD and ab initio MD simulations. However, the generated glass structures, in all cases, show a significantly lower fraction of 3-membered planar boroxol rings as predicted by experimental results (f=60%-80%). The largest boroxol ring fraction of f=15±5% is observed in the full ab initio quenches from 2300 K. In case of SiO2, the glass structures after the quantum mechanical relaxation are the basis for calculations of the linear thermal expansion coefficient αL(T), employing the quasi-harmonic approximation. The striking observation is a change change of sign of αL(T) going along with a temperature range of negative αL(T) at low temperatures, which is in good agreement with experimental results.

Synthese und Charakterisierung neuer funktionalisierter Mono- und Bis-tetrahydropyrrolo[3,4-b]carbazole als potentielle DNA-Liganden

Synthese und Charakterisierung neuer funktionalisierter Mono- und Bis-tetrahydro-pyrrolo[3,4-b]carbazole als potentielle DNA-Liganden In der Carbazol-Chemie sollen neue anellierte Verbindungen mit potentieller DNA-Affinität und damit verbundener Antitumoraktivität entwickelt werden. Auf molekularer Ebene sind DNA-Interkalation oder DNA-Rinnenbindung zu erwarten. Darauf aufbauend wurden in Anlehnung an literaturbekannte Cytostatika Mono- und Bis-tetrahydropyrrolo[3,4-b]carbazole synthetisiert, die zur Entwicklung neuer Leitstrukturen bzw. -substanzen beitragen können.In der vorliegenden Arbeit wurde als synthetische Schlüsselreaktion die in unserem Arbeitkreis etablierte Indol-2,3-chinodimethan-Diels-Alder-Reaktion mit geeigneten cyclischen Mono- und Bismaleinimiden als Dienophilen weiterführend genutzt. Auf Grund des Aufbaus von künftigen Struktur-Wirkungsbeziehungen wurden variable Linker zwischen die beiden zu verbindenden Pyrrolotetrahydrocarbazole eingeführt. Diese waren aliphatischer und diamidischer Natur. Diamidische Strukturelemente wurden im Hinblick auf die Entwicklung neuer Peptidomimetika eingeführt. Deren Synthese gelang zum einen über die gemischte Säureanhydrid-Methode und zum anderen über die Azolid-Methode. Die Struktursicherung der als Cycloaddukte erhaltenen Tetrahydrocarbazole erfolgte mittels Standardverfahren (1D-, 2D-NMR-, IR-Spektroskopie und Massenspektrometrie).Enantiomere bzw. Diastereomere chiraler Wirkstoffe unterscheiden sich stark in ihren pharmakologischen Eigenschaften, deshalb müssen Verfahren entwickelt werden, um diese Substanzen gegebenenfalls auch in enantiomerenreiner Form darstellen zu können. Die Racemate der Monotetrahydrocarbazole und die Racemate sowie die dazu diastereomeren meso-Formen der Bistetrahydrocarbazole, die bei der Reaktion entstehen, konnten erstmals mittels chiraler HPLC analytisch getrennt werden.In einer der Synthese ergänzten theoretischen Studie wurde Computer-Molecular-Modelling zur Problematik der Diels-Alder-Reaktion durchgeführt, außerdem wurden kraftfeld-mechanische Berechnungen zur Konformationsanalyse der 'einfachen' Monotetrahydro-carbazole herangezogen und darauf aufbauend schließlich einfache DNA-Docking-Experimente zur ersten Abschätzung des DNA-Binde-Verhaltens der synthetisierten Verbindungen vorgenommen.

Messung des Wirkungsquerschnitts der Reaktion d(e,e'p)n für fehlende Impulse bis 950 MeV/c und Trennung der longitudinalen und transversalen Reaktionsanteile für fehlende Impulse bis 350 MeV/c

Die Dreispektrometeranlage der A1-Kollaboration am MainzerElektronenbeschleuniger MAMI wurde im Rahmen dieser Arbeitverwendet, um die Elektrodisintegration des Deuteronsmit Hilfe der Reaktion d(e,e'p)n zu untersuchen. Im ersten Teil der Untersuchungen wurde die longitudinaleund transversale Strukturfunktion aus denWirkungsquerschnitten extrahiert. Die Zentralwerte derkinematischen Parameter waren dabei wie folgt eingestellt:1) Der Impulsübertrag wurde für alle Messungen auf 450 MeV/c festgelegt.2) Das Proton wurde in Richtung des Impulsübertrags nachgewiesen (parallele Kinematik).3) Vier Einstellungen des Energieübertrags, und damit korrespondierend des fehlenden Impulses, wurden gemessen: Energieübertrag / MeV : 128, 226, 289, 360. Fehlender Impuls / (MeV/c): 50, 200, 275, 350.4) Für jede dieser vier Kinematiken wurden mindestens drei verschiedene Einschußenergien bzw. Elektronenstreuwinkel eingestellt, um die Strukturfunktionen mit Hilfe der Rosenbluth-Separation zu bestimmen. Im zweiten Teil der Untersuchungen wurde derWirkungsquerschnitt für hohe fehlende Impulse bestimmt.Dessen Zentralwerte wurden von 30 MeV/c bis 906 MeV/cvariiert, wobei für die hohen fehlenden Impulse das Protonweit außerhalb der Richtung des Impulsübertragesnachzuweisen war. Der Energieübertrag lag dabei zwischen180 MeV und 600 MeV und der Impulsübertrag zwischen608 MeV/c und 698 MeV/c.

(S)-(-)-Curvularin als Leitstruktur für die Synthese neuartiger antiinflammatorischer Wirkstoffe

Ziel dieser Arbeit war die Darstellung antiinflammatorischer Wirkstoffe basierend auf (S)-(-)-Curvularin. Zur Ermittlung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen sollte eine möglichst große Zahl an Derivaten dargestellt und in Zusammenarbeit mit pharmakologischen und mikrobiologischen Arbeitsgruppen. Es wurde ein neuer und effizienter totalsynthetischer Zugang zu Curvularin sowie analogen Ringsystemen erarbeitet mit einer Ringschluss-Metathese als Schlüsselschritt zur Bildung des Makrocyclus. Ausgehend von den Synthesebausteinen 3,5-Dihydroxyphenylessigsäure und (S)-Propenoxid gelang die Darstellung des Naturstoffes (S) ( )-Curvularin mit einer Gesamtausbeute von 10 % über sieben Stufen. Der Naturstoff Curvularin selbst wurde durch Modifikationen an den phenolischen Funktionen, durch elektrophile aromatische Substitution, Reduktion sowie konjugierte Addition an den Naturstoff 10,11-Dehydrocurvularin derivatisiert. Mit diesen synthetischen Ansätzen konnten die Strukturelemente des Naturstoffes systematisch variiert werden und es konnten insgesamt 28 Makrolactone synthetisiert werden. Anhand der biologischen Evaluierung der Verbindungen ließen sich Rückschlüsse auf die pharmakophoren Gruppen des Naturstoffes ziehen, bei vier der synthetisierten Verbindungen konnten im Vergleich zu Curvularin eine höhere biologische Aktivität erzielt werden. Anhand der Erkenntnisse aus den biologischen Tests ließen sich strukturell einfachere Verbindungen als potentielle Wirkstrukturen entwerfen. Es wurden verschiedene ortho-acylierte 3,5-Dihydroxyphenylessigsäurederivate sowie substituierte 6,8-Dihydoxytetralon- und 6,8-Dihydroxyisochinolon-Verbindungen synthetisiert. Diese vereinfachten Partialstrukturen zeigten eine geringere biologischen Aktivität als der Naturstoff.

QCD-Strahlungskorrekturen zu Polarisationsobservablen in semileptonischen Zerfällen schwerer Quarks

In dieser Arbeit werden die QCD-Strahlungskorrekturen in erster Ordnung der starken Kopplungskonstanten für verschiedene Polarisationsobservablen zu semileptonischen Zerfällen eines bottom-Quarks in ein charm-Quark und ein Leptonpaar berechnet. Im ersten Teil wird der Zerfall eines unpolarisierten b-Quarks in ein polarisiertes c-Quark sowie ein geladenes Lepton und ein Antineutrino im Ruhesystem des b-Quarks analysiert. Es werden die Strahlungskorrekturen für den unpolarisierten und den polarisierten Beitrag zur differentiellen Zerfallsrate nach der Energie des c-Quarks berechnet, wobei das geladene Lepton als leicht angesehen und seine Masse daher vernachlässigt wird. Die inklusive differentielle Rate wird durch zwei Strukturfunktionen in analytischer Form dargestellt. Anschließend werden die Strukturfunktionen und die Polarisation des c-Quarks numerisch ausgewertet. Nach der Einführung der Helizitäts-Projektoren befaßt sich der zweite Teil mit dem kaskadenartigen Zerfall eines polarisierten b-Quarks in ein unpolarisiertes c-Quark und ein virtuelles W-Boson, welches weiter in ein Paar leichter Leptonen zerfällt. Es werden die inklusiven Strahlungskorrekturen zu drei unpolarisierten und fünf polarisierten Helizitäts-Strukturfunktionen in analytischer Form berechnet, welche die Winkelverteilung für die differentielle Zerfallsrate nach dem Viererimpulsquadrat des W-Bosons beschreiben. Die Strukturfunktionen enthalten die Informationen sowohl über die polare Winkelverteilung zwischen dem Spinvektor des b-Quarks und dem Impulsvektor des W-Bosons als auch über die räumliche Winkelverteilung zwischen den Impulsen des W-Bosons und des Leptonpaars. Der Impuls und der Spinvektor des b-Quarks sowie der Impuls des W-Bosons werden im b-Ruhesystem analysiert, während die Impulse des Leptonpaars im W-Ruhesystem ausgewertet werden. Zusätzlich zu den genannten Strukturfunktionen werden noch die unpolarisierte und die polarisierte skalare Strukturfunktion angegeben, die in Anwendungen bei hadronischen Zerfällen eine Rolle spielen. Anschließend folgt eine numerische Auswertung aller berechneten Strukturfunktionen. Im dritten Teil werden die nichtperturbativen HQET-Korrekturen zu inklusiven semileptonischen Zerfällen schwerer Hadronen diskutiert, welche ein b-Quark enthalten. Sie beschreiben hadronische Korrekturen, die durch die feste Bindung des b-Quarks in Hadronen hervorgerufen werden. Es werden insgesamt fünf unpolarisierte und neun polarisierte Helizitäts-Strukturfunktionen in analytischer Form angegeben, die auch eine endliche Masse und den Spin des geladenen Leptons berücksichtigen. Die Strukturfunktionen werden sowohl in differentieller Form in Abhängigkeit des quadrierten Viererimpulses des W-Bosons als auch in integrierter Form präsentiert. Zum Schluß werden die zuvor erhaltenen Resultate auf die semi-inklusiven hadronischen Zerfälle eines polarisierten Lambda_b-Baryons oder eines B-Mesons in ein D_s- oder ein D_s^*-Meson unter Berücksichtigung der D_s^*-Polarisation angewandt. Für die zugehörigen Winkelverteilungen werden die inklusiven QCD- und die nichtperturbativen HQET-Korrekturen zu den Helizitäts-Strukturfunktionen in analytischer Form angegeben und anschließend numerisch ausgewertet.

Electronic energy transfer processes and charge carrier transport in pi-conjugated polymers

Conjugated polymers have attracted tremendous academical and industrial research interest over the past decades due to the appealing advantages that organic / polymeric materials offer for electronic applications and devices such as organic light emitting diodes (OLED), organic field effect transistors (OFET), organic solar cells (OSC), photodiodes and plastic lasers. The optimization of organic materials for applications in optoelectronic devices requires detailed knowledge of their photophysical properties, for instance energy levels of excited singlet and triplet states, excited state decay mechanisms and charge carrier mobilities. In the present work a variety of different conjugated (co)polymers, mainly polyspirobifluorene- and polyfluorene-type materials, was investigated using time-resolved photoluminescence spectroscopy in the picosecond to second time domain to study their elementary photophysical properties and to get a deeper insight into structure-property relationships. The experiments cover fluorescence spectroscopy using Streak Camera techniques as well as time-delayed gated detection techniques for the investigation of delayed fluorescence and phosphorescence. All measurements were performed on the solid state, i.e. thin polymer films and on diluted solutions. Starting from the elementary photophysical properties of conjugated polymers the experiments were extended to studies of singlet and triplet energy transfer processes in polymer blends, polymer-triplet emitter blends and copolymers. The phenomenon of photonenergy upconversion was investigated in blue light-emitting polymer matrices doped with metallated porphyrin derivatives supposing an bimolecular annihilation upconversion mechanism which could be experimentally verified on a series of copolymers. This mechanism allows for more efficient photonenergy upconversion than previously reported for polyfluorene derivatives. In addition to the above described spectroscopical experiments, amplified spontaneous emission (ASE) in thin film polymer waveguides was studied employing a fully-arylated poly(indenofluorene) as the gain medium. It was found that the material exhibits a very low threshold value for amplification of blue light combined with an excellent oxidative stability, which makes it interesting as active material for organic solid state lasers. Apart from spectroscopical experiments, transient photocurrent measurements on conjugated polymers were performed as well to elucidate the charge carrier mobility in the solid state, which is an important material parameter for device applications. A modified time-of-flight (TOF) technique using a charge carrier generation layer allowed to study hole transport in a series of spirobifluorene copolymers to unravel the structure-mobility relationship by comparison with the homopolymer. Not only the charge carrier mobility could be determined for the series of polymers but also field- and temperature-dependent measurements analyzed in the framework of the Gaussian disorder model showed that results coincide very well with the predictions of the model. Thus, the validity of the disorder concept for charge carrier transport in amorphous glassy materials could be verified for the investigated series of copolymers.

Neuronal differentiation and epithelial integrity: the role of Drosophila Short stop

The nervous system is the most complex organ in animals and the ordered interconnection of neurons is an essential prerequisite for normal behaviour. Neuronal connectivity requires controlled neuronal growth and differentiation. Neuronal growth essentially depends on the actin and microtubule cytoskeleton, and it has become increasingly clear, that crosslinking of these cytoskeletal fractions is a crucial regulatory process. The Drosophila Spectraplakin family member Short stop (Shot) is such a crosslinker and is crucial for several aspects of neuronal growth. Shot comprises various domains: An actin binding domain, a plakin-like domain, a rod domain, calcium responsive EF-hand motifs, a microtubule binding Gas2 domain, a GSR motif and a C-terminal EB1aff domain. Amongst other phenotypes, shot mutant animals exhibit severely reduced dendrites and neuromuscular junctions, the subcellular compartmentalisation of the transmembrane protein Fasciclin2 is affected, but it is also crucially required in other tissues, for example for the integrity of tendon cells, specialised epidermal cells which anchor muscles to the body wall. Despite these striking phenotypes, Shot function is little understood, and especially we do not understand how it can carry out functions as diverse as those described above. To bridge this gap, I capitalised on the genetic possibilities of the model system Drosophila melanogaster and carried out a structure-function analysis in different neurodevelopmental contexts and in tendon cells. To this end, I used targeted gene expression of existing and newly generated Shot deletion constructs in Drosophila embryos and larvae, analyses of different shot mutant alleles, and transfection of Shot constructs into S2 cells or cultured fibroblasts. My analyses reveal that a part of the Shot C-terminus is not essential in the nervous system but in tendon cells where it stabilises microtubules. The precise molecular mechanism underlying this activity is not yet elucidated but, based on the findings presented here, I have developed three alternative testable hypothesis. Thus, either binding of the microtubule plus-end tracking molecule EB1 through an EB1aff domain, microtubulebundling through a GSR rich motif or a combination of both may explain a context-specific requirement of the Shot C-terminus for tendon cell integrity. Furthermore, I find that the calcium binding EF-hand motif in Shot is exclusively required for a subset of neuronal functions of Shot but not in the epidermal tendon cells. These findings pave the way for complementary studies studying the impact of [Ca2+] on Shot function. Besides these differential requirements of Shot domains I find, that most Shot domains are required in the nervous system and tendon cells alike. Thus the microtubule Gas2 domain shows no context specific requirements and is equally essential in all analysed cellular contexts. Furthermore, I could demonstrate a partial requirement of the large spectrin-repeat rod domain of Shot in neuronal and epidermal contexts. I demonstrate that this domain is partially required in processes involving growth and/or tissue stability but dispensable for cellular processes where no mechanical stress resistance is required. In addition, I demonstrate that the CH1 domain a part of the N-terminal actin binding domain of Shot is only partially required for all analysed contexts. Thus, I conclude that Shot domains are functioning different in various cellular environments. In addition my study lays the base for future projects, such as the elucidation of Shot function in growth cones. Given the high degree of conservation between Shot and its mammalian orthologues MACF1/ACF7 and BPAG1, I believe that the findings presented in this study will contribute to the general understanding of spectraplakins across species borders.

Functional characterisation of in vitro synthesised G-protein coupled receptors in polymersomes

Membrane proteins play an indispensable role in physiological processes. It is, therefore, not surprising that many diseases are based on the malfunction of membrane proteins. Hence membrane proteins and especially G-protein coupled receptors(GPCRs)- the largest subfamily- have become an important drug target. Due to their high selectivity and sensitivity membrane proteins are also feasible for the detection of small quantities of substances with biosensors. Despite this widespread interest in GPCRs due to their importance as drug targets and biosensors there is still a lack of knowledge of structure, function and endogenous ligands for quiet a few of the previously identified receptors.rnBottlenecks in over-expression, purification, reconstitution and handling of membrane proteins arise due to their hydrophobic nature. Therefore the production of reasonable amounts of functional membrane proteins for structural and functional studies is still challenging. Also the limited stability of lipid based membrane systems hampers their application as platforms forrnscreening applications and biosensors.rnIn recent years the in vitro protein synthesis became a promising alternative to gain better yields for expression of membrane proteins in bio-mimetic membrane systems. These expression systems are based on cell extracts. Therefore cellular effects on protein expression are reduced. The open nature of the cell-free expression systems easily allows for the adjustment of reactionrnconditions for the protein of interest. The cell-free expression in the presence of bio-mimetic membrane systems allows the direct incorporation of the membrane proteins and therefore skips the time-consuming purification and reconstitution processes. Amphiphilic block-copolymers emerged as promising alternative for the less stable lipid-based membrane systems. They, likernlipids, form membraneous structures in aqueous solutions but exhibit increased mechanical and chemical stability.rnThe aim of this work was the generation of a GPCR-functionalised membrane system by combining both promising alternatives: in vitro synthesis and polymeric membrane systems. This novel platform should be feasible for the characterisation of the incorporated GPCR. Immunodetection of Dopamine receptor 1 and 2 expressed in diblock- and triblock-polymersomes demonstrated the successful in vitro expression of GPCRs in polymeric membranes. Antibodyrnbinding studies suggested a favoured orientation of dopamine receptors in triblockpolymersomes.rnA dopamine-replacement assay on DRD2-functionalised immobilised triblockpolymersomes confirmed functionality of the receptor in the polymersomes. The altered binding curve suggests an effect of the altered hydrophobic environment presented by the polymer membrane on protein activity.

Cytotoxicity and P-glycoprotein inhibition by cardiotonic steroids

Herzwirksame Glykoside sind in der Natur sowohl im Tier- als auch im Pflanzenreich zu finden und werden regelmäßig zur Therpaie von Herzinsuffizienz eingesetzt. In letzter Zeit belegten viele Studien, dass herzwirksame Glykoside vielversprechende Substanzen für die Behandlung von Krebs darstellen. Ihr Wirkmechanismus basiert auf der Hemmung der Na+/K+-ATPase. Die Na+/K+-ATPase spielt neuerdings eine wichtige Rolle in der Krebsbiologie, da sie viele relevante Signalwege beeinflusst. Multiresistenzen gegen Arzneimittel sind oftmals verantwortlich für das Scheitern einer Chemotherapie. Bei multi-drug-resistenten Tumoren erfolgt ein Transport der Chemotherapeutika aus der Krebszelle hinaus durch das Membranprotein P-Glykoprotein. In der vorliegenden Arbeit wurde die Zytotoxizität von 66 herzwirksamen Glykosiden und ihren Derivaten in sensitiven und resistenten Leukämie-Zellen getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Naturstoffe die Zell-Linien in verschiedenen molaren Bereichen abtöten. Allerdings waren die Resistenz-Indizes niedrig (d. h. die IC50 Werte waren in beiden Zell-Linien ähnlich). Die untersuchten 66 Substanzen besitzen eine große Vielfalt an chemischen Substituenten. Die Wirkung dieser Substituenten auf die Zytotoxizität wurde daher durch Struktur-Aktivitäts-Beziehung (SAR) erforscht. Des Weiteren wiesen quantitative Struktur-Aktivitäts-Beziehung (QSAR) und molekulares Docking darauf hin, dass die Na+/K+-ATPase in sensitiven und resistenten Zellen unterschiedlich stark exprimiert wird. Eine Herunterregulation der Na+/K+-ATPase in multi-drug-resistenten Zellen wurde durch Western Blot bestätigt und die Wirkung dieser auf relevante Signalwege durch Next-Generation-Sequenzierung weiter verfolgt. Dadurch konnte eine Verbindung zwischen der Überexpression von P-Glykoprotein und der Herunterregulation der Na+/K+-ATPase hergestellt werden. Der zweite Aspekt der Arbeit war die Hemmung von P-Glykoprotein durch herzwirksame Glykoside, welche durch Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie getestet wurde. Sechs wirksame Glykoside konnten den P-Glykoprotein-vermittelten Transport von Doxorubicin inhibieren. Zudem konnte die Zytotoxität von Doxorubicin in multi-drug-resistenten Zellen teilweise wieder zurück erlangt werden. Unabhängig von herzwirksamen Glykosiden war die Bewertung der Anwendung von molekularem Docking in der P-Glykoprotein Forschung ein weiterer Aspekt der Arbeit. Es ließ sich schlussfolgern, dass molekulares Docking fähig ist, zwischen den verschiedenen Molekülen zu unterscheiden, die mit P-Glykoprotein interagieren. Die Anwendbarkeit von molekularem Docking in Bezug auf die Bestimmung der Bindestelle einer Substanz wurde ebenfalls untersucht.

From polyarylated cycloparaphenylenes to carbon nanotube segments and metallo N 4-macrocycles as fuel cell catalysts

In this work the synthesis of polyarylated cycloparaphenylenes (CPPs) is described in order to form structurally defined carbon nanotube (CNT) segments by the Scholl reaction. Therefore, polyphenylene macrocycles in different sizes and substitution patterns were synthesized. The influence of the ring-strain on the oxidative cyclodehydrogenation of these macrocycles towards CNT segments was investigated. It was demonstrated that a selective solution based bottom-up synthesis of CNT segments could be accomplished, having polyarylated CPPs, sufficient in size and with the right substituents at the critical positions. These findings mark an important step towards the bottom-up synthesis of length- and diameter defined ultrashort CNTsrnIn the second part of this work, novel non-precious metal catalysts (NPMCs) based on phenanthroline-indole macrocycles were synthesized and their electrocatalytic performance in the cathodic oxygen reduction was investigated. It could be demonstrated that all catalysts contributed to the direct 4-electron reduction of oxygen to water in alkaline media and a superior long-term stability was observed. Since these NPMCs are not heat pre-treated, the catalytically active site was structurally well-defined, allowing the investigation of the structure-property relationship. Moreover, it could be shown that these novel NPMCs act as efficient ORR catalysts and could replace the expensive and scarce platinum in fuel cell applications.rn