Na +-coupled betaine symporters involved in osmotic stress response in prokaryotes and eukaryotes

The betaine/GABA transporter BGT1 is one of the most important osmolyte transporters in the kidney. BGT1 is a member of the neurotransmitter sodium symporter (NSS) family, facilitates Na+/Cl--coupled betaine uptake to cope with hyperosmotic stress. Betaine transport in kidney cells is upregulated under hypertonic conditions by a yet unknown mechanism when increasing amounts of intracellular BGT1 are inserted into the plasma membrane. Re-establishing isotonicity results in ensuing depletion of BGT1 from the membrane. BGT1 phosphorylation on serines and threonines might be a regulation mechanism. In the present study, four potential PKC phosphorylation sites were mutated to alanines and the responses to PKC activators, phorbol 12-myristate acetate (PMA) and dioctanoyl-sn-glycerol (DOG) were determined. GABA-sensitive currents were diminished after 30 min preincubation with these PKC activators. Staurosporine blocked the response to DOG. Three mutants evoked normal GABA-sensitive currents but currents in oocytes expressing the mutant T40A were greatly diminished. [3H]GABA uptake was also determined in HEK-293 cells expressing EGFP-tagged BGT1 with the same mutations. Three mutants showed normal upregulation of GABA uptake after hypertonic stress, and downregulation by PMA was normal compared to EGFP-BGT1. In contrast, GABA uptake by the T40A mutant showed no response to hypertonicity or PMA. Confocal microscopy of the EGFP-BGT1 mutants expressed in MDCK cells, grown on glass or filters, revealed that T40A was present in the cytoplasm after 24 h hypertonic stress while the other mutants and EGFP-BGT1 were predominantely present in the plasma membrane. All four mutants co-migrated with EGFP-BGT1 on Western blots suggesting they are full-length proteins. In conclusion, T235, S428, and S564 are not involved in downregulation of BGT1 due to phosphorylation by PKC. However, T40 near the N-terminus may be part of a hot spot important for normal trafficking or insertion of BGT1 into the plasma membrane. Additionally, a link between substrate transport regulation, insertion of BGT1 into the plasma membrane and N-glycosylation in the extracellular loop 2 (EL2) could be revealed. The functional importance of two predicted N-glycosylation sites, which are conserved in EL2 within the NSS family were investigated for trafficking, transport and regulated plasma membrane insertion by immunogold-labelling, electron microscopy, mutagenesis, two-electrode voltage clamp measurements in Xenopus laevis oocytes and uptake of radioactive-labelled substrate into MDCK cells. Trafficking and plasma membrane insertion of BGT1 was clearly promoted by proper N-glycosylation in both, oocytes and MDCK cells. De-glycosylation with PNGase F or tunicamycin led to a decrease in substrate affinity and transport rate. Mutagenesis studies revealed that in BGT1 N183 is the major N-glycosylation site responsible for full protein activity. Replacement of N183 with aspartate resulted in a mutant, which was not able to bind N-glycans suggesting that N171 is a non-glycosylated site in BGT1. N183D exhibited close to WT transport properties in oocytes. Surprisingly, in MDCK cells plasma membrane insertion of the N183D mutant was no longer regulated by osmotic stress indicating unambiguously that association with N-glycans at this position is linked to osmotic stress-induced transport regulation in BGT1. The molecular transport mechanism of BGT1 remains largely unknown in the absence of a crystal structure. Therefore investigating the structure-function relationship of BGT1 by a combination of structural biology (2D and 3D crystallization) and membrane protein biochemistry (cell culture, substrate transport by radioactive labeled GABA uptake into cells and proteoliposomes) was the aim of this work. While the functional assays are well established, structure determination of eukaryotic membrane transporters is still a challenge. Therefore, a suitable heterologous expression system could be defined, starting with cloning and overexpression of an optimized gene. The achieved expression levels in P. pastoris were high enough to proceed with isolation of BGT1. Furthermore, purification protocols could be established and resulted in pure protein, which could even be reconstituted in an active form. The quality and homogeneity of the protein allowed already 2D and 3D crystallization, in which initial crystals could be obtained. Interestingly, the striking structural similarity of BGT1 to the bacterial betaine transporter BetP, which became a paradigm for osmoregulated betaine transport, provided information on substrate coordination in BGT1. The structure of a BetP mutant that showed activity for GABA was solved to 3.2Å in complex with GABA in an inward facing open state. This structure shed some light into the molecular transport mechanisms in BGT1 and might help in future to design conformationally locked BGT1 to enforce the on-going structure determination.

Nierenzellen sind extremen hyperosmotischen Bedingungen ausgesetzt, da bei der Bildung des konzentrierten Urins die interstitiellen NaCl- und Harnstoffkonzentrationen stark ansteigen. Zur Osmoadaptation akkumulieren Nierenzellen Osmolyte wie Betain, welches zudem die strukturelle Integrität von intrazellulären Proteinen vor zu hohen Harnstoffkonzentrationen schützt. Betain wird mittels des Na+- gekoppelten und Cl--abhängigen Co-Transporters BGT1 über die basolaterale Membran des Tubulusepithels transportiert. BGT1 ist über Transkription und Membraneinbau indirekt in die Osmoregulation der Niere involviert. Es stellt sich nun die Frage, ob der Transporter direkt auf Aktivitätsebene reguliert ist. Als Mitglied der Neurotransmitter-Sodium-Symporter (NSS)-Familie akzeptiert BGT1 auch GABA als Substrat, einen inhibitorischen Neurotransmitter, der u.a. im zentralen Nervensystem von großer Bedeutung ist. Ein wichtiger Regulierungsmechanismus konnte über die Phosphorylierung mittels Protein Kinase C (PKC) an einem bestimmten Threonin-Rest (T40) im N-terminus von BGT1 gezeigt werden. Hierzu, wurden vier potentielle PKC Phosphorylierungsstellen gegen Alanine ausgetauscht und die Resonanz auf die PKC Aktivatoren, PMA und DOG, ermittelt. Die Transportaktivitäten wurden sowohl in Oozyten als auch in Zellkultur überprüft, letzteres wurde ebenfalls auch zur zellulären Lokalisierung des WT-BGT1 und der Mutanten genutzt. Drei der Mutanten wiesen ähnliche Transporteigenschaften, gleiche Herunterregulierung durch PMA bzw. DOG und eine gleiche zelluläre Verteilung unter hypertonischen Bedingungen auf, wie der Wildtyp (WT). Wohingegen kein Transport, weder nach hypertonischem Schock noch auf den PKC Aktivator bei der T40A Mutante zu detektieren war. Die zelluläre Verteilung dieser Mutante wies auf, dass diese nach 24h hypertonischem Stress im Cytoplasma verweilte, im Gegensatz zum WT und den anderen drei Mutanten, welche unter diesen Bedingungen primär in der Plasmamembran eingebaut waren. Dadurch lässt sich festhalten, dass T40 im N-Terminus von BGT1 eine wichtige Funktion in der Lokalisierung und Verankerung von BGT1 zur und in die Plasmamembran erfüllt. Des Weiteren wurde die funktionelle Bedeutung zweier vorhergesagten N-Glykosylierungsstellen (N171, N183) in Bezug auf die zelluläre Verteilung, den Transport und den regulierten Einbau von BGT1 in die Plasmamembran untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass, sowohl in Oozyten als auch in Zellkultur, die Lokalisierung und der Plasmamembraneinbau von BGT1 durch die N-Glykosylierung eindeutig begünstigt wurde. Eine Deglykosylierung mit PNGase F oder Tunicamycin führte zu einer Abnahme sowohl in der Substrataffinität als auch bei der Transportrate. Mittels Mutagenesestudien konnte aufgezeigt werden, dass N183 die Haupt-N-Glykosylierungsstelle und diese auch für die vollständige Proteinaktivität verantwortlich ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Zuckerreste an N183 unabdingbar für den osmoregulierten Regulationsmechanismus von BGT1 sind. Der molekulare Mechanismus des GABA- und Betain-Transports in BGT1 ist in Ermangelung einer Struktur und dem Fehlen von in vitro Transportuntersuchungen weitgehend unbekannt. Deswegen wurde eine Kombination aus strukturbiologischen (2D und 3D Kristallisation) und biochemischen/biophysikalischen Methoden (Substrattransport mit radioaktiv-markiertem GABA in Zellen und Proteoliposomen) zur Struktur- und Funktionsuntersuchung dieses biologisch und medizinisch hoch relevanten eukaryotischen Sekundärtransporters angewendet. Hierfür wurde BGT1 zunächst als Volllängenprotein heterolog in vier verschiedenen Expressionssystemen hergestellt. Anschließend erfolgte die Etablierung eines Reinigungsprotokolls, welches u.a. im Fall der Expression in P. pastoris zu reinem und stabilem Protein führte. Trotz der geringeren Ausbeute an gereinigtem Protein war es möglich Aktivitätsmessungen in Proteoliposomen, sowie 2D und gar 3D Kristallisation durchzuführen, welche sogar zu ersten Proteinkristallen führte. In enger Anknüpfung an frühere Studien des bakteriellen, osmoregulierten Betain-Transporters BetP, welches als Modellsystem für osmoregulierten Sekundärtransport etabliert werden konnte, war es möglich eine Mutante herzustellen, welche nicht nur GABA transportieren, sondern auch in Komplex mit GABA kristallisiert und strukturell untersucht werden konnte. Diese Erkenntnis ermöglicht nun eine weitere Etablierung des molekularen Transportmechanismus von BGT1 und könnte ferner dazu beitragen, BGT1 in einer bestimmten Konformation zu fixieren, um die Strukturaufklärung dieses Transporters voranzubringen.