High mobility rates during the period of the "Celtic migrations"? - 87 Sr, 86 Sr and delta 18 O evidence from Early La Tène Europe

Although the period of the historic “Celtic migrations” is archaeologically extensively studied, the long-lasting question whether mass migration or increased individual mobility caused the expansion of the La Tène culture throughout continental Europe persist. Strontium (Sr) and in part oxygen (O) isotope analysis of human remains from the early La Tène cemeteries of Nebringen (Germany), Münsingen-Rain (Switzerland), Monte Bibele (Italy) and the Czech cemeteries of Radovesice I, Radovesice II and Kutná Hora was, therefore, carried out to investigate the importance of residential changes during this time period. These isotope analyses showed that most analysed individuals either came from the area they were buried in or from the surrounding area of the cemetery. An exception was formed by the Czech cemeteries, where almost a quarter of the studied individuals appeared non-local. Together with Nebringen, these cemeteries also had the most varied Sr isotope ratios, which suggest highly mobile communities in which individuals regularly changed their residency. The isotopic ratios of the cemeteries of Münsingen-Rain and Monte Bibele appeared far less varied. In part, these differences might be explained by the community structures of these cemeteries. Morphological kinship analysis in Münsingen-Rain demonstrated biological relatedness among most of the analysed individuals. These related individuals also shared similar isotope signatures, which suggest an origin from the surrounding Aar Valley. In the vicinity of the cemetery of Monte Bibele, an associated settlement site was discovered. The deceased presumably not only shared this settlement, but also cultivated the same land plots. Dispersed settlement structures were suggested for Nebringen, Radovesice and Kutná Hora, as these agriculturally favourable landscapes were densely populated during prehistoric times. Connected to these community structures are the prevailing geological conditions in these areas. Both Münsingen-Rain and Monte Bibele are located in a region where homogeneous geological conditions prevail, whereas the landscapes of Nebringen, Radovesice and Kutná Hora are characterised by complex heterogeneous geological conditions. As the majority of individuals in Nebringen and the Czech cemeteries correspond to the expected isotope values for the studied areas, regularly changing land plots might have contributed to the observed variation. Although mass migration as depicted by the historical sources was not observed individual mobility of a small part of these studied communities certainly played a role. Males appeared, thereby, to have slightly more often a non-local birthplace or moved during childhood. Male mobility was, however, not always associated with burial as a warrior. Females, on the other hand, originated more often from the region. Patrilocal residential patterns, with the exception of the Czech cemeteries, were nevertheless not observed. Objects and ideas also seem to have been exchanged freely, as there are no indications that individuals with particular grave goods came from specific areas. It rather appears that the individuals buried with them were either local or had different places of origin. This can be explained by the fact that the exact origin of grave goods is difficult to establish and the occurrence of similar 87Sr/86Sr values in different areas. This study provided important new insights on the period of the “Celtic migrations” and the way of life of these prehistoric people.

Na +-coupled betaine symporters involved in osmotic stress response in prokaryotes and eukaryotes

The betaine/GABA transporter BGT1 is one of the most important osmolyte transporters in the kidney. BGT1 is a member of the neurotransmitter sodium symporter (NSS) family, facilitates Na+/Cl--coupled betaine uptake to cope with hyperosmotic stress. Betaine transport in kidney cells is upregulated under hypertonic conditions by a yet unknown mechanism when increasing amounts of intracellular BGT1 are inserted into the plasma membrane. Re-establishing isotonicity results in ensuing depletion of BGT1 from the membrane. BGT1 phosphorylation on serines and threonines might be a regulation mechanism. In the present study, four potential PKC phosphorylation sites were mutated to alanines and the responses to PKC activators, phorbol 12-myristate acetate (PMA) and dioctanoyl-sn-glycerol (DOG) were determined. GABA-sensitive currents were diminished after 30 min preincubation with these PKC activators. Staurosporine blocked the response to DOG. Three mutants evoked normal GABA-sensitive currents but currents in oocytes expressing the mutant T40A were greatly diminished. [3H]GABA uptake was also determined in HEK-293 cells expressing EGFP-tagged BGT1 with the same mutations. Three mutants showed normal upregulation of GABA uptake after hypertonic stress, and downregulation by PMA was normal compared to EGFP-BGT1. In contrast, GABA uptake by the T40A mutant showed no response to hypertonicity or PMA. Confocal microscopy of the EGFP-BGT1 mutants expressed in MDCK cells, grown on glass or filters, revealed that T40A was present in the cytoplasm after 24 h hypertonic stress while the other mutants and EGFP-BGT1 were predominantely present in the plasma membrane. All four mutants co-migrated with EGFP-BGT1 on Western blots suggesting they are full-length proteins. In conclusion, T235, S428, and S564 are not involved in downregulation of BGT1 due to phosphorylation by PKC. However, T40 near the N-terminus may be part of a hot spot important for normal trafficking or insertion of BGT1 into the plasma membrane. Additionally, a link between substrate transport regulation, insertion of BGT1 into the plasma membrane and N-glycosylation in the extracellular loop 2 (EL2) could be revealed. The functional importance of two predicted N-glycosylation sites, which are conserved in EL2 within the NSS family were investigated for trafficking, transport and regulated plasma membrane insertion by immunogold-labelling, electron microscopy, mutagenesis, two-electrode voltage clamp measurements in Xenopus laevis oocytes and uptake of radioactive-labelled substrate into MDCK cells. Trafficking and plasma membrane insertion of BGT1 was clearly promoted by proper N-glycosylation in both, oocytes and MDCK cells. De-glycosylation with PNGase F or tunicamycin led to a decrease in substrate affinity and transport rate. Mutagenesis studies revealed that in BGT1 N183 is the major N-glycosylation site responsible for full protein activity. Replacement of N183 with aspartate resulted in a mutant, which was not able to bind N-glycans suggesting that N171 is a non-glycosylated site in BGT1. N183D exhibited close to WT transport properties in oocytes. Surprisingly, in MDCK cells plasma membrane insertion of the N183D mutant was no longer regulated by osmotic stress indicating unambiguously that association with N-glycans at this position is linked to osmotic stress-induced transport regulation in BGT1. The molecular transport mechanism of BGT1 remains largely unknown in the absence of a crystal structure. Therefore investigating the structure-function relationship of BGT1 by a combination of structural biology (2D and 3D crystallization) and membrane protein biochemistry (cell culture, substrate transport by radioactive labeled GABA uptake into cells and proteoliposomes) was the aim of this work. While the functional assays are well established, structure determination of eukaryotic membrane transporters is still a challenge. Therefore, a suitable heterologous expression system could be defined, starting with cloning and overexpression of an optimized gene. The achieved expression levels in P. pastoris were high enough to proceed with isolation of BGT1. Furthermore, purification protocols could be established and resulted in pure protein, which could even be reconstituted in an active form. The quality and homogeneity of the protein allowed already 2D and 3D crystallization, in which initial crystals could be obtained. Interestingly, the striking structural similarity of BGT1 to the bacterial betaine transporter BetP, which became a paradigm for osmoregulated betaine transport, provided information on substrate coordination in BGT1. The structure of a BetP mutant that showed activity for GABA was solved to 3.2Å in complex with GABA in an inward facing open state. This structure shed some light into the molecular transport mechanisms in BGT1 and might help in future to design conformationally locked BGT1 to enforce the on-going structure determination.

Intraflagellar transport in the developing and mature vertebrate retina

Intraflagellar transport (IFT) is required for the assembly and maintenance of cilia. In this study we analyzed the subcellular localization of IFT proteins in retinal cells by correlative high-resolution immunofluorescence and immunoelectron microscopy. The rod photoreceptor cell was used as a model system to analyze protein distribution in cilia. To date the expression of IFT proteins has been described in the ciliary region without deciphering the precise spatial and temporal subcellular localization of IFT proteins, which was the focus of my work. rnThe establishment of the pre-embedding immunoelectron method was an important first step for the present doctoral thesis. Results of this work reveal the differential localization of IFT20, IFT52, IFT57, IFT88, IFT140 in sub-ciliary compartments and also their presence in non-ciliary compartments of retinal photoreceptor cells. Furthermore, the localization of IFT20, IFT52 and IFT57 in dendritic processes of non-ciliated neurons indicates that IFT protein complexes also operate in non-ciliated cells and may participate in intracellular vesicle trafficking in eukaryotic cells in general.rnIn addition, we have investigated the involvement of IFT proteins in the ciliogenesis of vertebrate photoreceptor cilia. Electron microscopy analyses revealed six morphologically distinct stages. The first stages are characterized by electron dense centriolar satellites and a ciliary vesicle, while the formation of a ciliary shaft and of the light sensitive outer segment disks are features of the later stages. IFT proteins were expressed during all stages of photoreceptor cell development and found to be associated with the ciliary apparatus. In addition to the centriole and basal body IFT proteins are present in the photoreceptor cytoplasm, associated with centriolar satellites, post-Golgi vesicles and with the ciliary vesicle. Therewith the data provide an evidence for the involvement of IFT proteins during ciliogenesis, including the formation of the ciliary vesicle and the elongation of the primary cilium of photoreceptor cells. Moreover, the cytoplasmic localization of IFT proteins in the absence of a ciliary shaft in early stages of ciliogenesis indicates roles of IFT proteins beyond their well-established function for IFT in mature cilia and flagella. rn

The oxidation capacity of the atmosphere - OH and HO 2 radical measurements in a boreal forest environment using laser induced fluorescence spectroscopy

Das wichtigste Oxidationsmittel für den Abbau flüchtiger Kohlenwasserstoffverbindungen (VOC, engl.: volatile organic compounds) in der Atmosphäre ist das Hydroxylradikal (OH), welches sich in einem schnellen chemischen Gleichgewicht mit dem Hydroperoxylradical (HO2) befindet. Bisherige Messungen und Modellvergleiche dieser Radikalspezies in Waldgebieten haben signifikante Lücken im Verständnis der zugrundeliegenden Prozesse aufgezeigt.rnIm Rahmen dieser Doktorarbeit wurden Messungen von OH- und HO2-Radikalen mittelsrnlaserinduzierten Fluoreszensmesstechnik (LIF, engl.: laser-induced fluorescence) in einem Nadelwald in Süd-Finnland während der Messkampagne HUMPPA–COPEC–2010 (Hyytiälä United Measurements of Photochemistry and Particles in Air – Comprehensive Organic Precursor Emission and Concentration study) im Sommer 2010 durchgeführt. Unterschiedliche Komponenten des LIF-Instruments wurden verbessert. Eine modifizierte Methode zur Bestimmung des Hintergrundsignals (engl.: InletPreInjector technique) wurde in den Messaufbaurnintegriert und erstmals zur Messung von atmosphärischem OH verwendet. Vergleichsmessungen zweier Instrumente basierend auf unterschiedlichen Methoden zur Messung von OH-Radikalen, chemische Ionisationsmassenspektrometrie (CIMS - engl.: chemical ionization mass spectrometry) und LIF-Technik, zeigten eine gute Übereinstimmung. Die Vergleichsmessungen belegen das Vermögen und die Leistungsfähigkeit des modifizierten LIF-Instruments atmosphärische OH Konzentrationen akkurat zu messen. Nachfolgend wurde das LIF-Instrument auf der obersten Plattform eines 20m hohen Turmes positioniert, um knapp oberhalb der Baumkronen die Radikal-Chemie an der Schnittstelle zwischen Ökosystem und Atmosphäre zu untersuchen. Umfangreiche Messungen - dies beinhaltet Messungen der totalen OH-Reaktivität - wurden durchgeführt und unter Verwendung von Gleichgewichtszustandsberechnungen und einem Boxmodell, in welches die gemessenen Daten als Randbedingungen eingehen, analysiert. Wenn moderate OH-Reaktivitäten(k′(OH)≤ 15 s−1) vorlagen, sind OH-Produktionsraten, die aus gemessenen Konzentrationen von OH-Vorläuferspezies berechnet wurden, konsistent mit Produktionsraten, die unter der Gleichgewichtsannahme von Messungen des totalen OH Verlustes abgeleitet wurden. Die primären photolytischen OH-Quellen tragen mit einem Anteil von bis zu einem Drittel zur Gesamt-OH-Produktion bei. Es wurde gezeigt, dass OH-Rezyklierung unter Bedingungen moderater OH-Reaktivität hauptsächlich durch die Reaktionen von HO2 mit NO oder O3 bestimmt ist. Während Zeiten hoher OH-Reaktivität (k′(OH) > 15 s−1) wurden zusätzliche Rezyklierungspfade, die nicht über die Reaktionen von HO2 mit NO oder O3, sondern direkt OH bilden, aufgezeigt.rnFür Hydroxylradikale stimmen Boxmodell-Simulationen und Messungen gut übereinrn(OHmod/OHobs=1.04±0.16), während HO2-Mischungsverhältnisse in der Simulation signifikant unterschätzt werden (HO2mod/HO2obs=0.3±0.2) und die simulierte OH-Reaktivität nicht mit der gemessenen OH-Reaktivität übereinstimmt. Die gleichzeitige Unterschätzung der HO2-Mischungsverhältnisse und der OH-Reaktivität, während OH-Konzentrationen von der Simulation gut beschrieben werden, legt nahe, dass die fehlende OH-Reaktivität in der Simulation eine noch unberücksichtigte HO2-Quelle darstellt. Zusätzliche, OH-unabhängigernRO2/HO2-Quellen, wie z.B. der thermische Zerfall von herantransportiertem peroxyacetylnitrat (PAN) und die Photolyse von Glyoxal sind indiziert.

Nanoparticular iron complex drugs for parenteral administration - physicochemical characterization, biological distribution and pharmacological safety

Iron deficiency is the most common deficiency disease worldwide with many patients who require intravenous iron. Within the last years new kind of parenteral iron complexes as well as generic preparations entered the market. There is a high demand for methods clarifying benefit to risk profiles of old and new iron complexes. It is also necessary to disclose interchangeability between originator and intended copies to avoid severe anaphylactic and anaphylactoid side reaction and assure equivalence of therapeutic effect.rnrnThe investigations presented in this work include physicochemical characterization of nine different parenteral iron containing non-biological complex drugs. rnWe developed an in-vitro assay, which allows the quantification of labile iron in the different complexes and thus it is a useful tool to estimate the pharmaclogical safety regarding iron related adverse drug events. This assay additionally allowed the estimation of complex stability by evaluation of degradation kinetics at the applied conditions.rnrnAn in-ovo study was performed to additionally compare different complexes in respect to body distribution. This in combination with complex stability information allowed the risk estimation of potential local acute and chronic reactions to iron overload.rnrnInformation obtained by the combination of the methods within this work are helpful to estimate the safety and efficacy profile of different iron containing non-biological complex drugs. rnrnPhysicochemical differences between the complexes were demonstrated in respect to size of the inorganic fraction, size and size distribution of the complete particles, structure of the inorganic iron fraction, morphology of the complexes and charge of the complexes. And furthermore significant differences in the biological behavior of different complexes were demonstrated. rnrnThe combination of complex stability and biodistribution as well as the combination of structure, size and stability represent helpful tools for the physicochemical characterization of iron containing non-biological complex drugs and for the estimation of pharmacological safety. This work thus represents an up to date summary of some relevant methods for the characterization of intravenous iron complex drugs in respect to pharmaceutical quality, pharmacological safety and aspects of efficacy. rnrnProspectively, it is worthwhile that the methods within this work will contribute to the development and/or characterization of iron containing nanoparticular formulations with beneficial efficacy and safety profiles.rn

Development of models and methods to simulate peptide-assisted nucleation and growth of calcium-minerals

In den vergangenen Jahren wurden einige bislang unbekannte Phänomene experimentell beobachtet, wie etwa die Existenz unterschiedlicher Prä-Nukleations-Strukturen. Diese haben zu einem neuen Verständnis von Prozessen, die auf molekularer Ebene während der Nukleation und dem Wachstum von Kristallen auftreten, beigetragen. Die Auswirkungen solcher Prä-Nukleations-Strukturen auf den Prozess der Biomineralisation sind noch nicht hinreichend verstanden. Die Mechanismen, mittels derer biomolekulare Modifikatoren, wie Peptide, mit Prä-Nukleations-Strukturen interagieren und somit den Nukleationsprozess von Mineralen beeinflussen könnten, sind vielfältig. Molekulare Simulationen sind zur Analyse der Formation von Prä-Nukleations-Strukturen in Anwesenheit von Modifikatoren gut geeignet. Die vorliegende Arbeit beschreibt einen Ansatz zur Analyse der Interaktion von Peptiden mit den in Lösung befindlichen Bestandteilen der entstehenden Kristalle mit Hilfe von Molekular-Dynamik Simulationen.rnUm informative Simulationen zu ermöglichen, wurde in einem ersten Schritt die Qualität bestehender Kraftfelder im Hinblick auf die Beschreibung von mit Calciumionen interagierenden Oligoglutamaten in wässrigen Lösungen untersucht. Es zeigte sich, dass große Unstimmigkeiten zwischen etablierten Kraftfeldern bestehen, und dass keines der untersuchten Kraftfelder eine realistische Beschreibung der Ionen-Paarung dieser komplexen Ionen widerspiegelte. Daher wurde eine Strategie zur Optimierung bestehender biomolekularer Kraftfelder in dieser Hinsicht entwickelt. Relativ geringe Veränderungen der auf die Ionen–Peptid van-der-Waals-Wechselwirkungen bezogenen Parameter reichten aus, um ein verlässliches Modell für das untersuchte System zu erzielen. rnDas umfassende Sampling des Phasenraumes der Systeme stellt aufgrund der zahlreichen Freiheitsgrade und der starken Interaktionen zwischen Calciumionen und Glutamat in Lösung eine besondere Herausforderung dar. Daher wurde die Methode der Biasing Potential Replica Exchange Molekular-Dynamik Simulationen im Hinblick auf das Sampling von Oligoglutamaten justiert und es erfolgte die Simulation von Peptiden verschiedener Kettenlängen in Anwesenheit von Calciumionen. Mit Hilfe der Sketch-Map Analyse konnten im Rahmen der Simulationen zahlreiche stabile Ionen-Peptid-Komplexe identifiziert werden, welche die Formation von Prä-Nukleations-Strukturen beeinflussen könnten. Abhängig von der Kettenlänge des Peptids weisen diese Komplexe charakteristische Abstände zwischen den Calciumionen auf. Diese ähneln einigen Abständen zwischen den Calciumionen in jenen Phasen von Calcium-Oxalat Kristallen, die in Anwesenheit von Oligoglutamaten gewachsen sind. Die Analogie der Abstände zwischen Calciumionen in gelösten Ionen-Peptid-Komplexen und in Calcium-Oxalat Kristallen könnte auf die Bedeutung von Ionen-Peptid-Komplexen im Prozess der Nukleation und des Wachstums von Biomineralen hindeuten und stellt einen möglichen Erklärungsansatz für die Fähigkeit von Oligoglutamaten zur Beeinflussung der Phase des sich formierenden Kristalls dar, die experimentell beobachtet wurde.

Medicalgenomics.org : an open source database and retrieval system for biomedical analysis

Die Molekularbiologie von Menschen ist ein hochkomplexes und vielfältiges Themengebiet, in dem in vielen Bereichen geforscht wird. Der Fokus liegt hier insbesondere auf den Bereichen der Genomik, Proteomik, Transkriptomik und Metabolomik, und Jahre der Forschung haben große Mengen an wertvollen Daten zusammengetragen. Diese Ansammlung wächst stetig und auch für die Zukunft ist keine Stagnation absehbar. Mittlerweile aber hat diese permanente Informationsflut wertvolles Wissen in unüberschaubaren, digitalen Datenbergen begraben und das Sammeln von forschungsspezifischen und zuverlässigen Informationen zu einer großen Herausforderung werden lassen. Die in dieser Dissertation präsentierte Arbeit hat ein umfassendes Kompendium von humanen Geweben für biomedizinische Analysen generiert. Es trägt den Namen medicalgenomics.org und hat diverse biomedizinische Probleme auf der Suche nach spezifischem Wissen in zahlreichen Datenbanken gelöst. Das Kompendium ist das erste seiner Art und sein gewonnenes Wissen wird Wissenschaftlern helfen, einen besseren systematischen Überblick über spezifische Gene oder funktionaler Profile, mit Sicht auf Regulation sowie pathologische und physiologische Bedingungen, zu bekommen. Darüber hinaus ermöglichen verschiedene Abfragemethoden eine effiziente Analyse von signalgebenden Ereignissen, metabolischen Stoffwechselwegen sowie das Studieren der Gene auf der Expressionsebene. Die gesamte Vielfalt dieser Abfrageoptionen ermöglicht den Wissenschaftlern hoch spezialisierte, genetische Straßenkarten zu erstellen, mit deren Hilfe zukünftige Experimente genauer geplant werden können. Infolgedessen können wertvolle Ressourcen und Zeit eingespart werden, bei steigenden Erfolgsaussichten. Des Weiteren kann das umfassende Wissen des Kompendiums genutzt werden, um biomedizinische Hypothesen zu generieren und zu überprüfen.

Chemical interaction between ocean and atmosphere

The exchange of chemical constituents between ocean and atmosphere provides potentially important feedback mechanisms in the climate system. The aim of this study is to develop and evaluate a chemically coupled global atmosphere-ocean model. For this, an atmosphere-ocean general circulation model with atmospheric chemistry has been expanded to include oceanic biogeochemistry and the process of air-sea gas exchange. The calculation of seawater concentrations in the oceanic biogeochemistry submodel has been expanded from DMS, CO₂

Enzyme tRNA interaction and (t)RNA conformation probed via environmentally sensitive cyanine dyes

Nukleosidmodifikationen beeinflussen Dynamik und Konformation von RNArnund sind epigenetisch wirksam. Wenig verstanden sind konformationelle Dynamik und enzymatische Erkennung von tRNA, sowie der Einfluss des mutmaßlichen kovalenten Inhibitors 5-Fluorouridine (5FU) auf Y Synthasen, die Pseudouridin (Y) erzeugen. Frühere Arbeiten nutzten mit den Fluorophoren Cy3 und Cy5rnmarkierte tRNA, um diese Fragen zu adressieren.rnDie vorliegende Arbeit weitet Cy3-Cy5-Markierung auf Hefe tRNArnPhernaus undrnnutzt Thermophorese und fortschrittliche Fluoreszenzspektroskopie. In der Thermophorese zeigte sich eine hohe Toleranz gegenüber Fluoreszenzmarkierung beirngleichzeitiger Erhöhung der Cy5 Fluoreszenz durch Enzymbindung. Zudem konnte die Konformation verschiedener Mutanten human mitochondrialer tRNArnLysrnund die Bindung von SAM durch SAM-I Riboswitch RNA untersucht werden.rnUm etwaige Unterschiede in der Interaktion von Y55 Synthase TruB mit Cy5-gelabelter U55- bzw. 5FU55-tRNA aufzudecken, wurde eine Kombination ausrnThermophorese, zeit- und polarisationsaufgelöster Fluoreszenzspektroskopie undrn’gel shift’ Experimenten genutzt. Alle Ergebnisse zeigten übereinstimmend einernreversible Bindung ähnlicher Affinität für beide tRNAs und widersprechen somit einer kovalenten Inhibition durch 5FU. Folgerichtig wurde der SDS-stabilernKomplex von TruB mit 5FU-tRNA neu evaluiert, da er bisher als kovalent interpretiert wurde. Es erfolgte eine schnelle Komplexbildung in hoher Ausbeute auchrnfür schlechte Substrate, außerdem ließ sich die Komplexausbeute nicht durch andere Reaktionsbedingungen beeinflussen. Somit kann der SDS stabile Komplexrnnur den ersten, nicht-kovalenten Kontakt von Enzym und 5FU55-tRNA darstellen und repräsentiert kein kovalentes Addukt späterer Katalyse.

Imiquimod based transcutaneous immunization – insights and novel concepts

This work aims at developing a transcutaneous immunization (TCI) approach in order to activate cytotoxic T-cells. A tumor specific immune response was therefore generated by the TLR7-Agonist imiquimod. Five commercially available creams including the innovators product Aldara® 5% creme were assessed to ascertain their capability to induce an immune response in C57BL/6 mice after dermal administration. Moreover, creams were investigated regarding their imiquimod permeation in a Franz-diffusion cell model. Results obtained from this study were used to develop novel formulation approaches based on dissolved state imiquimod in a submicron scale range. High pressure homogenization ensured emulsification as well as particle size reduction. A freeze dried spreadable solid nanoemulsion based on sucrose fatty acid esters and oil components represented a major formulation approach. Within the scope of this approach the influence of pharmaceutical oils i.e. middle chain triglycerides, avocado oil, jojoba wax, and squalen was assessed towards their TCI performance. Furthermore, an aqueous jojoba wax based emulsion gel was developed. Unlike the innovators product, all formulations demonstrated a distinctly reduced imiquimod permeation across murine skin, a fact particularly evident in case of jojoba wax. Squalen significantly augmented in vivo immune response (p≤0.05 Mann-Whitney-Test). The emulsion gel demonstrated a 10fold decrease of imiquimod permeation. In comparison with the innovators product, the emulsion gel induced an equal immune response with a simultaneously enhanced tumor rejection in a mouse model.

Physiologische Konsequenzen eines gestörten Ceramid Stoffwechsels unter Beteiligung von Ceramidsynthase 3 und saurer Ceramidase = Physiological consequences of a disturbed ceramide metabolism due to altered activities of ceramide synthase 3 and acidic ceramidase

Tiefes Wissen über den Ceramid Stoffwechsel ist rudimentär für das Verständnis der Haut-Pathophysiologie (z.B. für atopische Dermatitis oder Psoriasis ) und unabdingbar für gezielte Therapieansätze. Wenn die zwei wichtigen Barriere Funktionen, gegen transepidermalen Wasserverlust und Pathogene Invasionen undicht werden, sind bestimmte Barriere Komponenten wie z.B. Ceramide stark verändert. In Haut und Hoden führt die Deletion der Ceramid-Synthase 3 zu einem Arrest der epidermalen Reifung und der Spermatogenese, welches ihre Bedeutung für eine intakte Barriere heraushebt. Sphingosin (So), ein Abbauprodukt von Cer, wurde als antimikrobielles Mittel identifiziert. So konnte das Wachstum von Candida albicans hemmen und die Invasion von Pathogenen in tiefere Hautschichten verringern, wodurch ihre mögliche Rolle in der Therapie von Hauterkrankungen gezeigt wurde. Auch eine neue Klasse von Ceramiden, die 1-O-acylceramide, wurde entdeckt. 1-O-acylceramide könnten zu einer funktionellen Wasserdurchlässigkeit Barriere beitragen, da sie zu den hydrophobesten der epidermalen Cers gehören. Die neutrale Glucosylceramidase scheint topologisch mit der 1-Oacylceramid Produktion verbunden zu sein, sowie die Enzyme der Diacylglycerol O-Acyltransferase-2 (DGAT2) Familie eine Rolle dabei spielen könnten. Die Identifizierung der für die 1-O-acylceramid Synthese verantwortlichen Enzyme wir Gegenstand weiterer Forschung sein, jedoch zeigten Untersuchungen an Mäusen, defizient für die saure Ceramidase (Farber-Krankheit), dass Makrophagen ein weiterer potenzieller Produktionsort sein könnten.

The sensitivity of the photostationary state of NOx and its implication for the oxidation capacity in a semi-rural and boreal forest region

Für das Vermögen der Atmosphäre sich selbst zu reinigen spielen Stickstoffmonoxid (NO) und Stickstoffdioxid (NO2) eine bedeutende Rolle. Diese Spurengase bestimmen die photochemische Produktion von Ozon (O3) und beeinflussen das Vorkommen von Hydroxyl- (OH) und Nitrat-Radikalen (NO3). Wenn tagsüber ausreichend Solarstrahlung und Ozon vorherrschen, stehen NO und NO2 in einem schnellen photochemischen Gleichgewicht, dem „Photostationären Gleichgewichtszustand“ (engl.: photostationary state). Die Summe von NO und NO2 wird deshalb als NOx zusammengefasst. Vorhergehende Studien zum photostationären Gleichgewichtszustand von NOx umfassen Messungen an unterschiedlichsten Orten, angefangen bei Städten (geprägt von starken Luftverschmutzungen), bis hin zu abgeschiedenen Regionen (geprägt von geringeren Luftverschmutzungen). Während der photochemische Kreislauf von NO und NO2 unter Bedingungen erhöhter NOx-Konzentrationen grundlegend verstanden ist, gibt es in ländlicheren und entlegenen Regionen, welche geprägt sind von niedrigeren NOx-Konzetrationen, signifikante Lücken im Verständnis der zugrundeliegenden Zyklierungsprozesse. Diese Lücken könnten durch messtechnische NO2-Interferenzen bedingt sein - insbesondere bei indirekten Nachweismethoden, welche von Artefakten beeinflusst sein können. Bei sehr niedrigen NOx-Konzentrationen und wenn messtechnische NO2-Interferenzen ausgeschlossen werden können, wird häufig geschlussfolgert, dass diese Verständnislücken mit der Existenz eines „unbekannten Oxidationsmittels“ (engl.: unknown oxidant) verknüpft ist. Im Rahmen dieser Arbeit wird der photostationäre Gleichgewichtszustand von NOx analysiert, mit dem Ziel die potenzielle Existenz bislang unbekannter Prozesse zu untersuchen. Ein Gasanalysator für die direkte Messung von atmosphärischem NO¬2 mittels laserinduzierter Fluoreszenzmesstechnik (engl. LIF – laser induced fluorescence), GANDALF, wurde neu entwickelt und während der Messkampagne PARADE 2011 erstmals für Feldmessungen eingesetzt. Die Messungen im Rahmen von PARADE wurden im Sommer 2011 in einem ländlich geprägten Gebiet in Deutschland durchgeführt. Umfangreiche NO2-Messungen unter Verwendung unterschiedlicher Messtechniken (DOAS, CLD und CRD) ermöglichten einen ausführlichen und erfolgreichen Vergleich von GANDALF mit den übrigen NO2-Messtechniken. Weitere relevante Spurengase und meteorologische Parameter wurden gemessen, um den photostationären Zustand von NOx, basierend auf den NO2-Messungen mit GANDALF in dieser Umgebung zu untersuchen. Während PARADE wurden moderate NOx Mischungsverhältnisse an der Messstelle beobachtet (10^2 - 10^4 pptv). Mischungsverhältnisse biogener flüchtige Kohlenwasserstoffverbindungen (BVOC, engl.: biogenic volatile organic compounds) aus dem umgebenden Wald (hauptsächlich Nadelwald) lagen in der Größenordnung 10^2 pptv vor. Die Charakteristiken des photostationären Gleichgewichtszustandes von NOx bei niedrigen NOx-Mischungsverhältnissen (10 - 10^3 pptv) wurde für eine weitere Messstelle in einem borealen Waldgebiet während der Messkampagne HUMPPA-COPEC 2010 untersucht. HUMPPA–COPEC–2010 wurde im Sommer 2010 in der SMEARII-Station in Hyytiälä, Süd-Finnland, durchgeführt. Die charakteristischen Eigenschaften des photostationären Gleichgewichtszustandes von NOx in den beiden Waldgebieten werden in dieser Arbeit verglichen. Des Weiteren ermöglicht der umfangreiche Datensatz - dieser beinhaltet Messungen von relevanten Spurengasen für die Radikalchemie (OH, HO2), sowie der totalen OH-Reaktivität – das aktuelle Verständnis bezüglich der NOx-Photochemie unter Verwendung von einem Boxmodell, in welches die gemessenen Daten als Randbedingungen eingehen, zu überprüfen und zu verbessern. Während NOx-Konzentrationen in HUMPPA-COPEC 2010 niedriger sind, im Vergleich zu PARADE 2011 und BVOC-Konzentrationen höher, sind die Zyklierungsprozesse von NO und NO2 in beiden Fällen grundlegend verstanden. Die Analyse des photostationären Gleichgewichtszustandes von NOx für die beiden stark unterschiedlichen Messstandorte zeigt auf, dass potenziell unbekannte Prozesse in keinem der beiden Fälle vorhanden sind. Die aktuelle Darstellung der NOx-Chemie wurde für HUMPPA-COPEC 2010 unter Verwendung des chemischen Mechanismus MIM3* simuliert. Die Ergebnisse der Simulation sind konsistent mit den Berechnungen basierend auf dem photostationären Gleichgewichtszustand von NOx.

Cytotoxicity and P-glycoprotein inhibition by cardiotonic steroids

Herzwirksame Glykoside sind in der Natur sowohl im Tier- als auch im Pflanzenreich zu finden und werden regelmäßig zur Therpaie von Herzinsuffizienz eingesetzt. In letzter Zeit belegten viele Studien, dass herzwirksame Glykoside vielversprechende Substanzen für die Behandlung von Krebs darstellen. Ihr Wirkmechanismus basiert auf der Hemmung der Na+/K+-ATPase. Die Na+/K+-ATPase spielt neuerdings eine wichtige Rolle in der Krebsbiologie, da sie viele relevante Signalwege beeinflusst. Multiresistenzen gegen Arzneimittel sind oftmals verantwortlich für das Scheitern einer Chemotherapie. Bei multi-drug-resistenten Tumoren erfolgt ein Transport der Chemotherapeutika aus der Krebszelle hinaus durch das Membranprotein P-Glykoprotein. In der vorliegenden Arbeit wurde die Zytotoxizität von 66 herzwirksamen Glykosiden und ihren Derivaten in sensitiven und resistenten Leukämie-Zellen getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Naturstoffe die Zell-Linien in verschiedenen molaren Bereichen abtöten. Allerdings waren die Resistenz-Indizes niedrig (d. h. die IC50 Werte waren in beiden Zell-Linien ähnlich). Die untersuchten 66 Substanzen besitzen eine große Vielfalt an chemischen Substituenten. Die Wirkung dieser Substituenten auf die Zytotoxizität wurde daher durch Struktur-Aktivitäts-Beziehung (SAR) erforscht. Des Weiteren wiesen quantitative Struktur-Aktivitäts-Beziehung (QSAR) und molekulares Docking darauf hin, dass die Na+/K+-ATPase in sensitiven und resistenten Zellen unterschiedlich stark exprimiert wird. Eine Herunterregulation der Na+/K+-ATPase in multi-drug-resistenten Zellen wurde durch Western Blot bestätigt und die Wirkung dieser auf relevante Signalwege durch Next-Generation-Sequenzierung weiter verfolgt. Dadurch konnte eine Verbindung zwischen der Überexpression von P-Glykoprotein und der Herunterregulation der Na+/K+-ATPase hergestellt werden. Der zweite Aspekt der Arbeit war die Hemmung von P-Glykoprotein durch herzwirksame Glykoside, welche durch Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie getestet wurde. Sechs wirksame Glykoside konnten den P-Glykoprotein-vermittelten Transport von Doxorubicin inhibieren. Zudem konnte die Zytotoxität von Doxorubicin in multi-drug-resistenten Zellen teilweise wieder zurück erlangt werden. Unabhängig von herzwirksamen Glykosiden war die Bewertung der Anwendung von molekularem Docking in der P-Glykoprotein Forschung ein weiterer Aspekt der Arbeit. Es ließ sich schlussfolgern, dass molekulares Docking fähig ist, zwischen den verschiedenen Molekülen zu unterscheiden, die mit P-Glykoprotein interagieren. Die Anwendbarkeit von molekularem Docking in Bezug auf die Bestimmung der Bindestelle einer Substanz wurde ebenfalls untersucht.

Hydrodynamics and solid dosage form disintegration/dissolution : immediate release tablets and novel in situ polyelectrolyte gastroretentive drug delivery systems

Solid oral dosage form disintegration in the human stomach is a highly complex process dependent on physicochemical properties of the stomach contents as well as on physical variables such as hydrodynamics and mechanical stress. Understanding the role of hydrodynamics and forces in disintegration of oral solid dosage forms can help to improve in vitro disintegration testing and the predictive power of the in vitro test. The aim of this work was to obtain a deep understanding of the influence of changing hydrodynamic conditions on solid oral dosage form performance. Therefore, the hydrodynamic conditions and forces present in the compendial PhEur/USP disintegration test device were characterized using a computational fluid dynamics (CFD) approach. Furthermore, a modified device was developed and the hydrodynamic conditions present were simulated using CFD. This modified device was applied in two case studies comprising immediate release (IR) tablets and gastroretentive drug delivery systems (GRDDS). Due to the description of movement provided in the PhEur, the movement velocity of the basket-rack assembly follows a sinusoidal profile. Therefore, hydrodynamic conditions are changing continually throughout the movement cycle. CFD simulations revealed that the dosage form is exposed to a wide range of fluid velocities and shear forces during the test. The hydrodynamic conditions in the compendial device are highly variable and cannot be controlled. A new, modified disintegration test device based on computerized numerical control (CNC) technique was developed. The modified device can be moved in all three dimensions and radial movement is also possible. Simple and complex moving profiles can be developed and the influence of the hydrodynamic conditions on oral solid dosage form performance can be evaluated. Furthermore, a modified basket was designed that allows two-sided fluid flow. CFD simulations of the hydrodynamics and forces in the modified device revealed significant differences in the fluid flow field and forces when compared to the compendial device. Due to the CNC technique moving velocity and direction are arbitrary and hydrodynamics become controllable. The modified disintegration test device was utilized to examine the influence of moving velocity on disintegration times of IR tablets. Insights into the influence of moving speed, medium viscosity and basket design on disintegration times were obtained. An exponential relationship between moving velocity of the modified basket and disintegration times was established in simulated gastric fluid. The same relationship was found between the disintegration times and the CFD predicted average shear stress on the tablet surface. Furthermore, a GRDDS was developed based on the approach of an in situ polyelectrolyte complex (PEC). Different complexes composed of different grades of chitosan and carrageenan and different ratios of those were investigated for their swelling behavior, mechanical stability, and in vitro drug release. With an optimized formulation the influence of changing hydrodynamic conditions on the swelling behavior and the drug release profile was demonstrated using the modified disintegration test device. Both, swelling behavior and drug release, were largely dependent on the hydrodynamic conditions. Concluding, it has been shown within this thesis that the application of the modified disintegration test device allows for detailed insights into the influence of hydrodynamic conditions on solid oral dosage form disintegration and dissolution. By the application of appropriate test conditions, the predictive power of in vitro disintegration testing can be improved using the modified disintegration test device. Furthermore, CFD has proven a powerful tool to examine the hydrodynamics and forces in the compendial as well as in the modified disintegration test device. rn

Chlamydiae host cell interaction and immune evasion strategies

Chlamydiae are obligate intracellular bacteria with a strong global prevalence. They cause infections of the eye, lung and the genital tract and can either replicate in inclusion compartments or persist inside their host cell. In this thesis we focused on two aspects of chlamydiae infection. We hypothesize that transcription factor AP-1 is crucial for a replicative chlamydiae infection in epithelial cells. In addition we suggest that chlamydiae hide inside apoptotic blebs for a silent uptake by macrophages as immune evasion strategy.rnFocusing on AP-1, we could demonstrate that during Chlamydia pneumoniae infection, protein expression and phosphorylation of the AP-1 family member c-Jun significantly increased in a time and dose dependent manner. A siRNA knockdown of c-Jun in HEp-2 cells reduced chlamydial load, resulting in smaller inclusions and a significant lower chlamydial recovery. Furthermore, inhibition of the c-Jun containing AP-1 complexes, using Tanshinone IIA, changed the replicative infection into a persistent phenotype, characterized by (i) smaller, aberrant inclusions, (ii) a strong decrease in chlamydial load, as well as by (iii) its reversibility after removal of Tanshinone IIA. As chlamydiae are energy parasites, we investigated whether Tanshinone IIA interferes with energy/metabolism related processes. rnA role for autophagy or gene expression of glut-1 and c-jun in persistence could not be determined. However we could demonstrate Tanshinone IIA treatment to be accompanied by a significant decrease of ATP levels, probably causing a chlamydiae persistent phenotype.rnRegarding the chlamydial interaction with human primary cells we characterized infection of different chlamydiae species in either pro-inflammatory (type I) or anti-inflammatory (type II) human monocyte derived macrophages (hMDM). We found both phenotypes to be susceptible to chlamydiae infection. Furthermore, we observed that upon Chlamydia trachomatis and GFP-expressing Chlamydia trachomatis infection more hMDM type II were infected. However the chlamydial load was higher in hMDM type I and correspondingly, more replicative-like inclusions were found in this phenotype. Next, we focused on the chlamydial transfer using a combination of high speed live cell imaging and GFP-expressing Chlamydia trachomatis for optimal visualization. Thereby, we could successfully visualize the formation of apoptotic, chlamydiae-containing blebs and the interaction of hMDM with these blebs. Moreover, we observed the development of a replicative infection in hMDM. rnIn conclusion, we demonstrated a crucial role of AP-1 for C. pneumoniae development and preliminary time lapse data suggest that chlamydiae can be transferred to hMDMs via apoptotic blebs. In all, these data may contribute to a better understanding of chlamydial infection processes in humans.rn