Intraflagellar transport in the developing and mature vertebrate retina

Intraflagellar transport (IFT) is required for the assembly and maintenance of cilia. In this study we analyzed the subcellular localization of IFT proteins in retinal cells by correlative high-resolution immunofluorescence and immunoelectron microscopy. The rod photoreceptor cell was used as a model system to analyze protein distribution in cilia. To date the expression of IFT proteins has been described in the ciliary region without deciphering the precise spatial and temporal subcellular localization of IFT proteins, which was the focus of my work. rnThe establishment of the pre-embedding immunoelectron method was an important first step for the present doctoral thesis. Results of this work reveal the differential localization of IFT20, IFT52, IFT57, IFT88, IFT140 in sub-ciliary compartments and also their presence in non-ciliary compartments of retinal photoreceptor cells. Furthermore, the localization of IFT20, IFT52 and IFT57 in dendritic processes of non-ciliated neurons indicates that IFT protein complexes also operate in non-ciliated cells and may participate in intracellular vesicle trafficking in eukaryotic cells in general.rnIn addition, we have investigated the involvement of IFT proteins in the ciliogenesis of vertebrate photoreceptor cilia. Electron microscopy analyses revealed six morphologically distinct stages. The first stages are characterized by electron dense centriolar satellites and a ciliary vesicle, while the formation of a ciliary shaft and of the light sensitive outer segment disks are features of the later stages. IFT proteins were expressed during all stages of photoreceptor cell development and found to be associated with the ciliary apparatus. In addition to the centriole and basal body IFT proteins are present in the photoreceptor cytoplasm, associated with centriolar satellites, post-Golgi vesicles and with the ciliary vesicle. Therewith the data provide an evidence for the involvement of IFT proteins during ciliogenesis, including the formation of the ciliary vesicle and the elongation of the primary cilium of photoreceptor cells. Moreover, the cytoplasmic localization of IFT proteins in the absence of a ciliary shaft in early stages of ciliogenesis indicates roles of IFT proteins beyond their well-established function for IFT in mature cilia and flagella. rn

Intraflagellarer Transport ist für die Entstehung und den Erhalt von Cilien erforderlich. In dieser Arbeit wurde die subzelluläre Lokalisation von IFT-Proteinen in retinalen Zellen mit Hilfe von korrelativer, hochauflösender Immuno-Elektronenmikroskopie untersucht. Dabei wurde der Stäbchen-Photorezeptor als Modell zur Proteinverteilung in Cilien verwendet. Bis heute wurden IFT-Proteine zwar in der Ciliären-Region beschrieben, ohne dabei jedoch die präzise subzelluläre Lokalisation räumlich und zeitlich zu betrachten. Die Etablierung der Pre-embedding-Immuno-Elektronenmikroskopie war eine wichtige methodische Voraussetzung für die hier vorliegende Dissertation. In den Ergebnissen der Arbeit wird die differenzielle Lokalisation der Proteine IFT20, IFT52, IFT58, IFT88 und IFT140 in subziliären Kompartimenten sowie ihr Auftreten in nicht-ciliären Bereichen der Photorezeptorzelle beschrieben. Darüber hinaus zeigte die Lokalisation von IFT20, IFT52 und IFT57 in den dendritischen Fortsätzen von nicht-cilientragenden Zellen, dass IFT-Protein-Komplexe auch hier vorkommen und möglicherweise eine Rolle beim allgemeinen intrazallulären Vesikeltransport eukaryontischer Zellen spielen.rnZusätzlich wurde die Beteiligung von IFT-Proteinen bei der Ciliogenese der Vertebraten-Photorezeptoren untersucht. In elektronenmikroskopischen Untersuchungen wurden sechs getrennte morphologische Stadien beschrieben. Die frühen Stadien sind dabei durch elektronendichte Centriol-Satelliten gekennzeichnet, während die Bildung des Cilienschafts und der lichtsensitiven Membranscheiben die späteren Stadien charakterisieren. Es zeigte sich, dass IFT-Proteine in allen Entwicklungsstadien des Photorezeptors exprimiert werden und immer mit dem Ciliärapparat assoziiert sind. Zusätzlich zur Centriole und dem Basalkörper finden sich IFT-Proteine auch im Cytoplasma - dort mit den Centriolären-Satelliten assoziiert - in post-Golgi-Vesikeln und in Ciliärenvesikeln.rnDiese Ergebnisse sind Hinweise darauf, dass IFT-Proteine an der Ciliogenese des Photorezeptors beteiligt sind; einschließlich der Bildung der Ciliärvesikel und der Elongation des Primärciliums. Darüber hinaus ist die cytoplasmatische Lokalisation der IFT-Proteine in frühen Stadien Evidenz für weitere Funktionen, die über die bereits bekannten in voll ausgebildeten Cilien und Flagellen hinausgehen.rnrn