Isolierung und Charakterisierung von Spirochaeten aus dem Termitendarm

Termiten beherbergen in ihrem Darm eine einzigartige Flora aus Bakterien, Archaeen, Flagellaten und Hefen. Diese symbiontische mikrobielle Gemeinschaft ist am Abbau von komplexen organischen Verbindungen beteiligt und ermöglicht es den Termiten schwer abbaubares Material wie Holz als Nahrungsquelle zu nutzen. Spirochaeten, eine Gruppe beweglicher Bakterien die sich durch ihre besondere Morphologie und Art der Fortbewegung von allen anderen Mikroorganismen abgrenzen lassen, gehören zu den häufigsten Bakterien im Termitendarm. Ziel der Arbeit war die Isolierung und Charakterisierung bislang unbekannter Spirochaeten aus Termitendärmen. Aus drei niederen Termitenarten konnten sechs spirochaetale Stämme gewonnen und identifiziert werden. Die Isolate ließen sich anhand der 16S rRNA Gensequenzen den Gattungen Treponema und Spirochaeta zuordnen. Im Gegensatz zu allen bislang charakterisierten Spirochaeten zeigte der Stamm SPN1 aus der Termite Neotermes castaneus eine kokkoide Zellform und war unbeweglich. Der Organismus wurde daher als neue Art, Spirochaeta coccoides sp. nov., beschrieben. Bei allen gewonnenen Isolaten handelt es sich um strikt anaerobe Organismen die verschiedene Mono-, Di- und Oligosaccharide fermentieren. Als wesentliche Stoffwechselprodukte konnten Acetat und Ethanol (sowie Formiat bei einem Stamm) identifiziert werden. Weiterhin konnten bei den untersuchten Stämmen eine Reihe von enzymatischen Aktivitäten nachgewiesen werden, die für den Abbau von Lignocellulose im Termitendarm von Bedeutung sind. Die Untersuchungen deuten darauf hin, dass die Spirochaeten eine wichtige Rolle bei der Fermentation von Abbauprodukten der Lignocellulose im Termitendarm spielen.

Synthese und Analytik von sauer katalysiert dargestellten Polyorganosiloxan-Nanokugeln mit Kern-Schale-Architektur

In dieser Arbeit wurden zwei Wege zur sauer katalysierten Synthese von Polyorganosiloxan-Kern-Schale-Nanopartikeln mit monomodaler Größenverteilung erarbeitet. Zum einen führt eine Erhöhung der Rührergeschwindigkeit auf 14000 rpm unter Verwendung eines Ultrathorax, während der ersten Stunde der Kondensation des Kernes zu Nanokugeln mit einer monomodalen Größenverteilung mit einem hydrodynamischen Radius von 33.1 nm +/- 22%. Zum anderen eröffnete die Reduktion des Flottenverhältnisses S, d.h. des Verhältnisses von Tensid- zu Monomermenge, von S=0.02 auf S=0.001 einen zweiten Weg zur Synthese von Nanokugeln mit monomodaler Größenverteilung. Der Radius dieser Kugeln beträgt 54.2 nm +/- 20%. Durch diese beiden Synthesewege sind Polyorganosiloxan-Nanokugeln in zwei verschiedenen Größen zugänglich. Durch 29Si-NMR-Messungen der Kerndispersion konnte gezeigt werden, dass die Ursache der bimodalen Größenverteilung der Polyorganosiloxan-Nanokugeln in der Synthese der Kerndispersion zu finden ist. Aus den hieraus ermittelten Ergebnissen geht hervor, dass sich während der sauer katalysierten Kondensation von Diethoxydimethylsilan neben den PDMS-Ketten auch zyklische Kondensationsprodukte bilden. Die während der Reaktion fortschreitende Bildung von Zyklen - insbesondere von Vierringen - bewirkt eine Phasenseparation der Dispersion. Dies führt zur beobachteten Bildung der bimodalen Größenverteilung der Polyorganosiloxan-Nanokugeln. Wird die Rührergeschwindigkeit auf 14000 rpm während der ersten Stunde der Kondensation des Kernes erhöht, wird eine verminderte Ringbildung gefunden. Der erhöhte Energieeintrag und die damit verbundene bessere Durchmischung der Dispersion während der ersten Stunde der Kondensation des Kerns führt bevorzugt zum Kettenwachstum, so dass die Tendenz zur Ringbildung verringert wird. Es tritt keine Phasenseparation auf, wodurch die beobachtete monomodale Größenverteilung der Nanokugeln erklärt wird. Wird das Flottenverhältnis reduziert und somit der pH-Wert der Lösung erhöht, werden bevorzugt offenkettige PDMS-Produkte gebildet. Die Bildung von Vierringen erfolgt nicht, Ringe höherer Ordnung werden nur in untergeordneter Menge gebildet. Es erfolgt keine Phasenseparation der Dispersion und eine monomodale Größenverteilung der Polyorganosiloxan-Nanokugeln wird erhalten. Die durch Erniedrigung des Flottenverhältnisses synthetisierten Polyorganosiloxan-Nanokugeln zeigten in AFM-Experimenten interessante Eigenschaften. So ist es möglich, die Nanokugeln auf einer Mica-Oberfläche mittels der AFM-Spitze zu manipulieren, ohne sie hierbei sie degradieren. Die sauer katalysierte Synthese ermöglicht die Einführung von basenlabilen Hydridgruppen in die Polyorganosiloxan-Nanokugeln. Ausgehend von in organischen Lösungsmitteln redispergierbaren Polyorganosiloxan-Nanokugeln, deren Oberfläche mit Hydridgruppen funktionalisiert wurde, konnten durch Hydrosilylierung mit allylterminiertem Polyethylenoxid wasserlösliche potentielle Nanokontainer synthetisiert werden.

Generierung und Charakterisierung von rekombinanten Cytomegaloviren mit Punktmutationen in antigenen Peptiden

Die Kontrolle der produktiven Cytomegalovirus- (CMV) Infektion ist von der effizienten Rekonstitution antiviraler CD8 T-Zellen abhängig. Dies führt jedoch nicht zur vollständigen Eliminierung des viralen Genoms aus den Zielorganen, sondern das Virus verbleibt in einem nicht-replikativen Zustand: der Latenz. Es ist bekannt, dass während der Latenz nur ein geringer Anteil latenter mCMV-Genome in der Lunge die Major Immediate Early (MIE) Gene ie1 und ie2 exprimiert, die Latenz aber dennoch bestehen bleibt, weil das differentielle Splicing des primären IE1/3-Transkripts zum Transaktivator-Transkript IE3 nicht erfolgt. Damit war neben der Initiation der IE-Genexpression am MIE-Promotor-Enhancer das IE1/3-Splicing als zweiter molekularer Latenz-Kontrollpunkt identifiziert. Parallel zur Latenz-assoziierten IE1-Genexpression sind in der Lunge aktivierte CD62L-low CD8 T-Zellen mit Spezifität für das immundominante IE1-Peptid 168-YPHFMPTNL-176 angereichert. Dies legte die Hypothese nahe, dass neben der molekularen Kontrolle der Latenz auch eine immunologische Kontrolle, beispielsweise durch IE1-Epitop-spezifische CD8 T-Zellen besteht. Zur Evaluierung dieser Hypothese wurde in der vorliegenden Arbeit mittels BAC-Mutagenese erstmals ein rekombinantes mCMV generiert, in dem das IE1-Peptid durch Punktmutation der C-terminalen MHC-Ankeraminosäure L176A zerstört ist. Dazu musste zunächst die Technik der BAC-Mutagenese herpesviraler Genome (in Anlehnung an die publizierten Arbeiten von Messerle et al., 1997; Borst et al., 1999, 2004; Wagner et al., 1999) in der Arbeitsgruppe etabliert werden. Neben der Funktionsverlust-Mutante (mCMV-IE1-L176A) wurden zur Kontrolle zwei Revertanten (mCMV-IE1-A176L und mCMV-IE1-A176L*) generiert. In letzterer, als Wobble-Revertante bezeichnet, wird wieder die authentische MHC-Ankeraminosäure L eingesetzt, es verbleibt aber ein singulärer Nukleotidaustausch A->T in der Wobble-Position des Codons als Marker zur Unterscheidung zum WT-mCMV zurück. Der immunologische Phänotyp der Funktionsverlust-Mutante, also die funktionelle Auslöschung des antigenen IE1-Peptids im Priming einer CD8 T-Zell-Antwort, entsprach der Erwartung. Entsprechend konnte nach Infektion mit der Funktionsverlust-Mutante keine Reaktivität gegen das IE1-Peptid nachgewiesen werden. In den Revertanten hingegen war die Erkennung des IE1-Peptids wieder hergestellt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen weiter, dass die Funktionsverlust-Mutante sowie die Revertanten ohne signifikante Beeinflussung in vitro in permissiven Fibroblasten und in vivo in verschiedenen Geweben replizieren. Wie aktuelle Daten nach Knochenmarktransplantation und Infektion mit der Funktionsverlust-Mutante im Vergleich zu den Revertanten zeigen, ist die Frequenz Latenz-assoziierter IE1-Transkriptionsereignisse bei der Funktionsverlust-Mutante signifikant erhöht. Damit konnte erstmalig der Beweis für eine Kontrolle der Latenz-assoziierten IE1-Genexpression durch IE1-Epitop-spezifische CD8 T-Zellen und damit für eine Präsentation des IE1-Peptids während der Latenz erbracht werden.

Dynamik und Klimatologie von diabatischen Rossby-Wellen

Der Wintersturm Lothar zog am 26. Dezember 1999 über Europa und richtete in Frankreich, in Deutschland, in der Schweiz und in Österreich ungewöhnlich hohe Schäden an. Lothar entstand aus einer diabatischen Rossby Welle (DRW) und erreichte erst wenige Stunden vor dem europäischen Kontinent Orkanstärke. DRWs weisen ein interessantes atmosphärisches Strömungsmuster auf. Sie bestehen aus einer positiven PV-Anomalie in der unteren Troposphäre, die sich in einer Region mit starkem meridionalen Temperaturgradient befindet. Die positive PV-Anomalie löst eine zyklonale Strömung aus, dadurch wird östlich der PV-Anomalie warme Luft aus dem Süden herantransportiert. Während des Aufstieg der warmen Luft finden diabatische Prozesse statt, die zur Bildung einer neuen positiven PV-Anomalie in der unteren Troposphäre (PVA) führen. DRWs entstehen unabhängig von PV-Anomalien an der Tropopause. Falls sie jedoch mit ihnen in Wechselwirkung treten, kann - wie im Falle von Lothar - eine explosive Zyklogenese daraus resultieren. Im ersten Teil wird die Dynamik einer DRW am Beispiel des Wintersturms Lothar untersucht. Es wird insbesondere auf das Potential einer DRW zur explosiven Zyklogenese eingegangen. Im zweiten Teil wird das Aufretreten von DRWs in ECMWF-Vorhersagen untersucht. Es werden Unterschiede zwischen DRWs und anderen PV-Anomalien in der unteren Troposphäre hervorgehoben. Die Dynamik von DRWs wird mit Hilfe eines ECMWF-"Ensemble Prediction System" (EPS) des Wintersturms Lothar untersucht. Die 50 Modellläufe des EPS starten am 24. Dezember 1999 um 12 UTC und reichen bis zum 26. Dezember 1999 um 12 UTC. Nur 16 der 50 Modellläufe sagen einen ähnlich starken Sturm wie Lothar vorher. 10 Modellläufen sagen am 26. Dezember keine Zyklone mehr vorher. Die Ausprägung der baroklinen Zone, in der sich die DRW befindet, ist ausschlaggebend für die Intensität der DRW. Weitere wichtige Parameter sind der Feuchtegehalt der unteren Troposphäre und der latente Wärmefluss über dem Ozean. Diejenigen DRWs, die sich zu am 25. Dezember um 12 UTC näher als 400 km am Tropopausenjet befinden, entwickeln sich zu einer starken Zyklone. Alle anderen lösen sich auf oder bleiben schwache Zyklonen. Es ist schwierig, diabatische Prozesse in Wettervorhersagemodellen abzubilden, dementsprechend treten Schwierigkeiten bei der Vorhersage von PVAs auf. In den operationellen ECMWF-Vorhersagen von Juni 2004 bis Mai 2005 werden mit Hilfe eines Tracking- Algorithmus PVAs im Nordpazifik und Nordatlantik bestimmt und in fünf Kategorien eingeteilt. Die fünf Kategorien unterscheiden sich in ihrer Häufigkeit, ihrer Zugbahn und ihrer Gestalt. Im Nordpazifik entstehen doppelt so viele PVAs wie im Nordatlantik. Durchschnittlich werden im Winter weniger PVAs gefunden als im Sommer. Die Baroklinität und die Geschwindigkeit des Tropopausenjets ist in der Nähe von DRWs besonders hoch. Verglichen mit anderen PVAs weisen DRWs eine ähnliche Verteilung des reduzierten Bodendrucks auf. DRWs können in etwa gleich gut vorhergesagt werden wie andere PVAs.

Regulation und Funktion von hunchback in Neuroblasten-Zellstammbäumen von Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster wird das Nervensystem von neuralen Vorläuferzellen, den Neuroblasten (NB) gebildet. Diese teilen sich im Stammzellmodus und bringen bei jeder Teilung eine Ganglienmutterzelle (GMZ) hervor. GMZ teilen sich einmal und generieren zwei Zellen, die ein neuronales und/oder gliales Schicksal annehmen. Die Reihenfolge in der ein NB GMZ generiert, ist vermutlich ein zellautonomer Prozess, der an die transiente und sequenzielle Expression der Transkriptionsfaktoren Hunchback (Hb), Krüppel (Kr), Pdm, Castor (Cas) und Grainy head (Grh) gekoppelt ist. Hb ist der erste Faktor dieser Genkaskade. Damit der NB zur nächsten zeitlichen Identität übergehen kann, die in der Regel von Kr bestimmt wird, muss die Hb-Expression im NB beendet werden. Das Abschalten wird transkriptionell reguliert und ist von einer vorhergehenden Mitose abhängig. Im Gegensatz zum NB wird in der GMZ, die bei dieser Teilung entsteht, die Hb-Expression beibehalten. In der vorliegenden Arbeit wurde der Mitose-abhängige Mechanismus aufgeklärt, durch den eine selektive Abschaltung von hb im NB erfolgt, nicht aber in der GMZ. Der Transkriptionsfaktor Seven-up (Svp) beendet die hb-Expression im NB. svp wird vor der entscheidenden Zellteilung im NB transkribiert, aber kaum translatiert. Nach erfolgter Zellteilung wird Svp verstärkt translatiert und sowohl im NB als auch in der neu entstandenen GMZ exprimiert. Im NB führt die Svp-Funktion zur Abschaltung von Hb. In der ebenfalls Svp-positiven GMZ verhindert jedoch Prospero (Pros), das während der Teilung in diese Zelle segregiert ist, die Aktivität von Svp. Um zu überprüfen, ob Svp und Pros die Transkription von Hb entweder direkt oder indirekt regulieren, wurde eine Enhancerfragment-Analyse durchgeführt. Durch diese Unter-suchungen sollten relevante regulatorische Bereiche des hb-Gens identifiziert werden. Zusätzlich zu den bereits bekannten Regionen im 5´-Bereich von hb, konnten 3´ des transkribierten Bereiches weitere nervensystemspezifische Enhancerelemente gefunden werden. Neben der Spezifizierung von früh geborenen Nachkommen von NB hat Hb im Nervensystem die Funktion, den multipotenten Zustand junger NB aufrecht zu erhalten. Um den Beitrag einzelner Domänen des Hb-Proteins an diesen Aufgaben zu bestimmen, wurden verschiedene hb-Varianten, in denen spezifische Domänen deletiert bzw. mutiert waren, im NB7-1 überexprimiert und auf die Induktion von „frühem“ Schicksal getestet. In einem zweiten Ansatz wurden mutante hb-Allele analysiert. Es stellte sich heraus, dass der D-Box eine entscheidende Rolle bei der Spezifizierung von „frühem“ Schicksal zukommt. Die terminalen Zinkfinger sind vermutlich in die Aufrechterhaltung der Kompetenz von NB involviert. Eine Deletion der A-Box erhöht möglicherweise die Aktivität des Hb-Proteins.

Synthese und Photochemie von Dendrimeren mit stilbenoiden Chromophoren

Dendrimere spielen als strukturtreue Nanopartikel eine herausragende Rolle. Ziel dieser Arbeit war, Dendrimere mit einer hohen Dichte an photoaktiven Chromophoren herzu-stellen und zu untersuchen. Dazu wurden die terminalen Aminogruppen von Poly(propylenimin)dendrimeren 1. und 2. Generation, Astramol DAB-Am-4R und DAB-Am-8R, mit Stilbenen und Styrylstilbenen als Chromophor verknüpft. Mittels Wittig-Horner- und Heck-Reaktion wurden (E)-Stilbene aufgebaut, die auf der einen Seite drei Propoxygruppen zur Verbesserung der Löslichkeit und auf der anderen Seite eine passende Funktionalität zur Verknüpfung mit dem dendritischen Core tragen. Als Verknüpfungsmethoden wurden die Verknüpfung als Amid (PSDA), Schiffsche Base (PSDS) und Harnstoff (PSDH) getestet. Die Schiffschen Basen wurden außerdem zur Erhöhung der Hydrolysestabilität zum sekundären Amin reduziert (PSDR und PQDR). Durch die Verknüpfung mit dem Core werden die stilbenoiden Chromophore sehr stark photoaktiviert. Das beruht auf einem Singulett-Energietransfer (Förster-Mechanismus) von Chromophor zu Chromophor. Dieser Prozeß konkurriert zu den Deaktivierungsprozessen, verlängert die mittlere S1-Lebensdauer und erhöht somit die Chancen der Photochemie. Der Styrylstilben-Chromophor hat darüber hinaus einen erheblichen Teil seiner UV-Absorbtion bereits im Tageslicht und photopolymerisiert daher bereits im Tageslicht. Vor allem bei den Dendrimeren 2. Generation stellte sich die Frage nach der vollständigen, d.h. achtfachen Umsetzung; das Core sollte als Knäuel vorliegen, die Arme zum Teil nach innen gefaltet und somit dem Reaktand nur bedingt zugänglich. Auch dort konnten unter optimierten Reaktionsbedingungen alle Aminogruppen umgesetzt werden. Die vollständige Umsetzung der Dendrimere wurde mittels NMR und massenspektroskopischen Methoden untersucht. Bei den Absorptionsspektren der Dendrimere 1. Generation ändert sich die Lage der Maxima je nach Art der Verknüpfung der Chromophore mit dem Core. Die Verlängerung des Chromophors um eine Styryleinheit bedingt eine beträchtliche Rotverschiebung. Die Lage der Emissionsmaxima differiert stärker als die Lage der Absorptionsmaxima. Den geringsten Stokes-Shift weist der Harnstoff auf, dann folgt das sekundäre Amin, dann die Schiffsche Base. Dies weist auf unterschiedlich relaxierte S1-Geometrien hin. Die Verbindungen PSDS1, PSDR1 und PSDH1 aus 3,4,5-Tripropoxystilbeneinheit und Astramol-Core 1. Generation DAB-Am-4 wurden in einer Konzentration von 10-5 mol/L belichtet. Der vollständige Photoabbau durch Belichtung in Chloroform mit einer Xenon-Lampe erfolgte ohne jeglichen Filter innerhalb von zehn Minuten (PSDH1), 20 Minuten (PSDR1) und einer Stunde (PSDS1). Allen drei Verbindungen gemeinsam ist das Entstehen eines intermediären neuen Maximums geringer Intensität, das um etwa 100 nm bathochrom verschoben ist. Das Harnstoffsystem weist außerdem ein weiteres intermediäres Maximum bei 614 nm auf. Diese Maxima können (laut früherer Untersuchungen) durch Oxidation entstandenen chinoiden Strukturen zugeordnet werden, deren Lebensdauer (im Sekundenbereich) zu kurz für eine NMR-Charakterisierung ist. PSDR1 wurde außerdem bei höheren Konzentrationen (10-4 und 10-3 mol/L) mit einer Quecksilberlampe mit Pyrex-Filter (lambda > 300 nm) belichtet. Dabei wird, wie erwartet, eine Verbreiterung der NMR-Signale beobachtet. Es bildet sich zunächst cis-Stilben. Außerdem läßt sich bei 4.3 ppm ein Signal beobachten, das von inter- oder intramolekular gebildeten Methinprotonen herrührt. Auch wenn laut MOPAC- und Kraftfeldrechnung die Doppelbindungen ungünstig für eine [pi2s + pi2s]-Cyclodimerisierung zueinander stehen, kann im photochemisch angeregten Zustand eine Geometrie vorherrschen, die die intramolekulare Kopf-Kopf-Cyclobutanbildung ermöglicht. Die massenspektrometrischen Untersuchungen der Belichtungsprodukte (FD, ESI, MALDI-TOF) zeigen als höchste Masse lediglich das Monomer. Allerdings kann dadurch nicht auf eine rein intramolekulare Reaktion geschlossen werden. Die fortschreitende statistische CC-Verknüpfung kann schnell zu vernetzten Nanopartikeln führen, die im Massenspektrometer nicht fliegen. Die NMR-Spektren der mit zunehmender Vernetzung immer schlechter löslich werdenden Teilchen belegen die Oligomerisierung.

Grenzflächenverhalten und Strukturierung von dünnen, amphiphilen Blockcopolymerfilmen

Die Oberfläche von Blockcopolymerfilmen wird aus denjenigen Blöcken gebildet, die gegenüber dem benachbarten Medium die geringste Oberflächenenergie besitzen. Durch eine gezielte Änderung des Mediums kann man Einfluss auf die chemische Zusammensetzung nehmen und einen Wechsel der Oberflächenlamelle erzwingen. Das Ziel dieser Arbeit war es, das Grenzflächenverhalten von dünnen, amphiphilen Blockcopolymerfilmen näher zu untersuchen, die Filmoberflächen in einem lösungsmittelfreien Prozess lateral zu strukturieren und anschließend chemisch zu modifizieren. Zu diesem Zweck wurden zunächst neuartige hydrophile und hydrophobe Styrenderivate mit kurzen Seitenketten dargestellt, die anschließend durch kontrollierte radikalische Polymerisation („stable free radical polymerisation“ SFRP) mit dem TEMPO Unimer zu amphiphilen Diblockcopolymeren polymerisiert wurden. Funktionelle Gruppen in den hydrophilen Blöcken sollen zusätzlich eine chemische Modifizierung der Oberflächen dünner Blockcopolymerfilme ermöglichen. Der Nachweis der Reorientierung der Oberflächenlamelle unter dem Einfluss angrenzender polarer und unpolarer Medien gelang im Folgenden sowohl indirekt durch Kontaktwinkelmessungen, als auch direkt durch „Near edge X-ray Absorption Fine Structure“ Spektroskopie (NEXAFS). Durch Letztere konnten auch kinetische Informationen über den Prozess der Reorientierung gewonnen werden. In AFM Studien konnten weiterhin Zwischenstufen des von Senchu et al. postulierten Mechanismus nachgewiesen werden, der die Reorientierung als eine Art Reißverschlussmechanismus beschreibt, bei dem sich die energetisch günstigere Lamelle über die ungünstigere Oberflächenlamelle stülpt. Die laterale Strukturierung der Oberflächen dünner Blockcopolymerfilme erfolgte abweichend von der bekannten Technik, die auf der Verwendung von hydrophoben PDMS Stempeln und einem polaren Lösungsmittel zurückgreift, durch einen lösungsmittelfreien Prozess mit hydrophilen PDMS Stempeln. Auf die hydrophilen Bereiche der so strukturierten Blockcopolymeroberflächen konnte dann mittels einer Templatstrategie selektiv elementares Kupfer abgeschieden werden. Durch die Erzeugung leitfähiger Strukturen auf Blockcopolymerfilmen konnte exemplarisch die Eignung dieser zum Aufbau von Sensorstrukturen gezeigt werden.

Evaluierung und Quantifizierung von Einflussfaktoren auf die aerodynamischen Eigenschaften inhalativer Pulvermischungen

Die Analyse der Einflussfaktoren Kapselmaterial, Trägerlaktose, Additiv-Anteil, Mischreihenfolge und mechanische Belastung ergibt verschiedene Haupteinflussfaktoren und kombinierte Wechselwirkungen, die einen deutlichen Effekt auf die aerodynamischen Eigenschaften (ausgebrachte Dosis und Verteilung des aerodynamischen Feinanteils) haben. Sowohl das Kapselmaterial als auch die Trägerlaktose werden als primäre Einflussfaktoren identifiziert: Mit „inerten” PE-Kapseln lassen sich höhere Resultate erzielen als mit „adhäsiven” Gelatine-Kapseln, während „feines” Trägermaterial die Ausbringung stärker fördert, als „grobes“ Trägermaterial. Alles Faktoren, die sich in gleicher Weise auf die Verteilung des aerodynamischen Feinanteils auswirken. Der zur binären Mischung zugefügte Additiv-Anteil führt neben einem ausgeprägten kapselmaterialabhängigen Effekt auf die Höhe der ausgebrachten Dosis auch zu einer Steigerung in der Verteilung des aerodynamischen Feinanteils („Umhüllungseffekt”), was durch die Variation der Mischreihenfolge anschaulich nachgewiesen wird. Die anschließende detaillierte Charakterisierung der beobachteten Effekte auf Basis von Partikelmorphologie und Oberflächenstruktur der Kapseln führt zu einer Differenzierung in Partikel-Partikel-Wechselwirkungen (z.B. „Umhüllungseffekt”, „Multiplets“) und Partikel-Kapsel- Wechselwirkungen (z.B. „Auspudereffekt”). Durch Entwicklung von analytischen Verfahren wird eine Quantifizierung der Trägerlaktose möglich, was für den Nachweis einer positiven Korrelation zwischen den aerodynamischen Eigenschaften von Wirkstoff und Trägerlaktose notwendig ist. Sowohl für die ausgebrachte Dosis als auch für die Verteilung des aerodynamischen Feinanteils zeigt sich ein parallel verlaufender Anstieg der Ergebnisse.

Aufbau und Kupplung von Schlüsselintermediaten zur enantioselektiven Steroidsynthese

Steroide sind im Organismus weit verbreitete, vielfältig substituierte Naturstoffe mit einem breiten biologischen Wirkungsspektrum. C/D-cis-verknüpfte Steroide kommen in der Natur zwar selten vor, sie sind aber in ihrer pharmakologischen Aktivität nicht weniger interessant. Total- bzw. Partialsynthesen sind bisher in der Literatur kaum beschrieben worden. Die Arbeit beschäftigt sich mit grundlegenden Reaktionen zur enantioselektiven Synthese eines 13,14-cis-verknüpften Steroids. Als Fernziel wurde C/D-cis-verknüpftes Östradiol ausgewählt mit der Option, das Substitutionsmuster dieses Steroids vielfältig variieren zu können. Der Syntheseplan beinhaltet zunächst den Aufbau des Kohlenstoffgerüsts im Sinne einer konvergenten Synthese, abschließende Cyclisierungen sollten dann das vollständige Molekül ergeben. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst das C/D-Ringfragment als Allylamin hergestellt. Das Amin ist dabei als chirales Auxiliar ausgelegt. Als A,B-Ringfragment wurden eine Reihe 4-Aryl-2,3-ungesättigte Carbonsäurefluoride synthetisiert. Im Verknüpfungsschritt, einer zwitterionischen Aza-Claisen-Umlagerung, konnten nun beide Fragmente mit hoher simpler, aber mäßiger induzierter Diastereoselektivität gekuppelt werden. Das Entfernen der Doppelbindung im Produkt erwies sich als erhebliche Hürde, die jedoch durch die Verwendung eines Enolethers genommen werden konnte. Das im Rahmen der Arbeit hergestellte Material sollte nun in wenigen Stufen zum C/D- cis-verknüpften Steroid umgesetzt werden können.

Bedeutung und Regulation von Apolipoprotein J in atherosklerotischen Läsionen

Apolipoprotein J (ApoJ) ist ein heterodimeres sekretiertes Glycoprotein, welchem sowohl antiapoptotische als auch antiinflammatorische Eigenschaften zugeschrieben werden. Es wird unter vielen pathophysiologischen Zuständen verstärkt exprimiert. Dazu zählen viele Krankheiten wie z.B. Krebs, M. Alzheimer, Creuzfeldt Jakob und Atherosklerose. Die vorliegende Arbeit befasst sich zum Einen mit der Funktion von ApoJ bei Atherosklerose und zum Anderen mit der Regulation von ApoJ durch in atherosklerotischen Läsionen vorkommende Bestandteile. Für die Untersuchungen der Funktion von ApoJ bei der Atherosklerose wurde die „Mainzer Hypothese“ zugrunde gelegt, die davon ausgeht, dass enzymatisch verdautes LDL (high density lipoprotein) (E-LDL) ursächlich für die Entstehung von atherosklerotischen Läsionen ist. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass ApoJ zwar an E-LDL bindet, nicht aber an natives LDL und dass durch diese Bindung die zytotoxische Wirkung von E-LDL auf glatte Muskelzellen der Ratte unterdrückt wird. Mittels Annexinfärbung und Caspase-Messung konnte gezeigt werden, dass ApoJ in diesem Fall eine antiapoptotische Funktion aufweist. Durch immunhistochemische Untersuchungen an humanen Gewebsschnitten aus frühen atherosklerotischen Läsionen konnte eine Kolokalisation von ApoJ und E-LDL nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse unterstreichen die Mainzer Hypothese. Durch eine Behandlung von glatten Muskelzellen der Ratte mit den Lipoproteinen LDL/E-LDL und nekrotischen Zellen sollte die Regulation von ApoJ durch in atherosklerotischen Läsionen vorhandenen Stimuli untersucht werden. Frühere Arbeiten unserer Arbeitsgruppe konnten bereits zeigen, dass eine Behandlung mit nekrotischen Zellen zu einer vermehrten Expression der ApoJ-mRNA führt und dass diese Regulation in Korrelation mit der Expression von Toll-like Rezeptoren (TLR) der verschiedenen Zellen steht. In dieser Arbeit konnte RNA aus nekrotischen Zellen als ApoJ-induzierende Komponente identifiziert werden. Durch Inhibition der TLR3-Signalwege konnten erste Hinweise darüber gewonnen werden, über welche Signaltransduktionswege die ApoJ Regulation erfolgt. Eine Behandlung der Zellen mit E LDL und LDL hingegen führte zu einer Repression der ApoJ-Sekretion. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass in atherosklerotischen Läsionen sowohl ApoJ induzierende wie auch repremierende Stimuli vorhanden sind.

Entwicklung und Tests von Algorithmen für die Impedanztomographie

Die Elektrische Impedanztomographie soll als kostengünstige und nebenwirkungsfreie Tomographiemethode in der medizinischen Diagnostik, z. B. in der Mammographie dienen. Mit der EIT läßt sich Krebsgewebe von gesundem Gewebe unterscheiden, da es eine signifikant erhöhte Leitfähigkeit aufweist. Damit kann die EIT als Ergänzung zu den klassischen Diagnoseverfahren dienen. So ist z.B. bei jungen Frauen mit einem dichteren Fettgewebe die Identifizierung eines Mammakarzinoms mit der Röntgentomographie nicht immer möglich. Ziel dieser Arbeit war es, einen Prototypen für die Impedanztomographie zu entwickeln und mögliche Anwendungen zu testen. Der Tomograph ist in Zusammenarbeit mit Dr. K.H.Georgi gebaut worden. Der Tomograph erlaubt es niederohmige, Wechselströme an Elektroden auf der Körperoberfläche einzuspeisen. Die Potentiale können an diesen Elektroden programmierbar vorgegeben werden. Weitere hochohmige Elektroden dienen zur Potentialmessung. Um den Hautwiderstand zu überbrücken, werden Wechselstromfrequenzen von 20-100 kHz eingesetzt. Mit der Möglichkeit der Messung von Strom und Potential auf unterschiedlichen Elektroden kann man das Problem des nur ungenau bekannten Hautwiderstandes umgehen. Prinzipiell ist es mit dem Mainzer EIT System möglich, 100 Messungen in der Sekunde durchzuführen. Auf der Basis von mit dem Mainzer EIT gewonnenen Daten sollten unterschiedliche Rekonstruktionsalgorithmen getestet und weiterentwickelt werden. In der Vergangenheit sind verschiedene Rekonstruktionsalgorithmen für das mathematisch schlecht gestellte EIT Problem betrachtet worden. Sie beruhen im Wesentlichen auf zwei Strategien: Die Linearisierung und iterative Lösung des Problems und Gebietserkennungsmethoden. Die iterativen Verfahren wurden von mir dahingehend modifiziert, dass Leitfähigkeitserhöhungen und Leitfähigkeitserniedrigungen gleichberechtigt behandelt werden können. Für den modifizierten Algorithmus wurden zwei verschiedene Rekonstruktionsalgorithmen programmiert und mit synthetischen Daten getestet. Zum einen die Rekonstruktion über die approximative Inverse, zum anderen eine Rekonstruktion mit einer Diskretisierung. Speziell für die Rekonstruktion mittels Diskretisierung wurde eine Methode entwickelt, mit der zusätzliche Informationen in der Rekonstruktion berücksichtigt werden können, was zu einer Verbesserung der Rekonstruktion beiträgt. Der Gebietserkennungsalgorithmus kann diese Zusatzinformationen liefern. In der Arbeit wurde ein neueres Verfahren für die Gebietserkennung derart modifiziert, dass eine Rekonstruktion auch für getrennte Strom- und Spannungselektroden möglich wurde. Mit Hilfe von Differenzdaten lassen sich ausgezeichnete Rekonstruktionen erzielen. Für die medizinischen Anwendungen sind aber Absolutmessungen nötig, d.h. ohne Leermessung. Der erwartende Effekt einer Inhomogenität in der Leitfähigkeit ist sehr klein und als Differenz zweier grosser Zahlen sehr schwierig zu bestimmen. Die entwickelten Algorithmen kommen auch gut mit Absolutdaten zurecht.

Entwicklung und Charakterisierung von Gassterilisationsprozessen am Beispiel der Oberflächensterilisation mittels Wasserstoffperoxid und Ethylenoxid

Bei der Auswahl einer Sterilisationsmethode stehen, gemäß den Vorgaben des Europäischen Arzneibuches, die Sterilisation mittels Hitze (Dampf bzw. Heißluft) oder ionisierender Strahlung im Vordergrund. Diese so genannten Referenzverfahren verfügen neben einem breiten Wirkungsspektrum über eine hohe Effektivität und zeichnen sich durch eine gute Reproduzierbarkeit aus. Häufig jedoch verbieten die physikalisch – chemischen Eigenschaften des zu sterilisierenden Gutes eine Anwendung der Referenzverfahren. In derartigen Fällen muss nach geeigneten Alternativverfahren gesucht werden, will man eine aseptische Herstellung vermeiden. Besonders bei thermolabilen Gütern hat sich der Einsatz von gasförmigen Agenzien mit keimtötender Wirkung bewährt. Bei entsprechenden Rahmenbedingungen ist hier eine Sterilisation unterhalb der Raumtemperatur möglich. Die vorliegende Arbeit untersucht die Anwendbarkeit der Ethylenoxidsterilisation bzw. der Sterilisation mittels gasförmigen Wasserstoffperoxids (Vapour Phase Hydrogen Peroxide) auf verschiedene Materialoberflächen am Beispiel zweier aktueller Anwendungen aus der pharmazeutischen Industrie. Dabei werden die Vor- und Nachteile der beiden Verfahren aufgezeigt und in Relation zu den Referenzverfahren gestellt. Im Rahmen der abschließenden mikrobiologischen Leistungsbeurteilung beider Verfahren werden verschiedene methodische Ansätze, wie Halbzyklus und Fraction Negative Analysis zur Anwendung gebracht und bewertet.

Expressions- und Funktionsanalysen von "Tetraspan Vesicle Membrane Proteins" in Caenorhabditis elegans

Tetraspan vesicle membrane proteins (TVPs) sind ubiquitäre Komponenten von Transportvesikeln. Bei den Säugetieren unterscheidet man drei Familien, die Physine, Gyrine und SCAMPs (secretory carrier-associated membrane proteins). Ihre Funktion ist weitgehend unbekannt, es wird jedoch vermutet, dass sie eine Rolle bei der Vesikelbildung und der Vesikelrezirkulierung spielen. In Caenorhabditis elegans existiert von jeder Familie jeweils nur ein einziges Polypeptid: für die Physine Synaptophysin (SPH-1), für die Gyrine Synaptogyrin (SNG-1) und für die SCAMPs SCAMP (SCM-1). Ziel der Arbeit war es die Verteilung der C. elegans TVPs zu untersuchen und ihre Funktion unter besonderer Berücksichtigung der vesikelvermittelten synaptischen Kopplung zu bestimmen. Wenn die C. elegans TVPs in humanen Epithelzellen synthetisiert werden, lokalisieren sie in zytoplasmatischen Vesikeln. In Kotransfektionsexperimenten wurde gezeigt, dass sie größtenteils in den gleichen Strukturen enthalten sind. In C. elegans synthetisierte TVP-Reporterkonstrukte können in unterschiedlichen Geweben nachgewiesen werden. Dabei ist SNG-1 fast ausschließlich in Neuronen zu finden. SPH-1 und SCM-1 hingegen weisen komplexe und teilweise überlappende Verteilungsmuster auf. Während für SPH-1 eine starke Fluoreszenz im Pharynx, auf der apikalen Seite der Darmzellen oberhalb des sog. terminal webs und in adluminalen Regionen von exkretorischen Geweben gefunden wurde, war SCM-1 stark in der Muskulatur und den Coelomozyten vertreten. Die Expression von SCM-1 in Pharynx und Darm war deutlich schwächer. Die C. elegans TVPs werden früh in der Entwicklung ab der Gastrulation (SPH-1 und SCM-1) bzw. ab der Neurulation im sog. Komma-Stadium (SNG-1) produziert. Um die Funktion der TVPs in C. elegans zu untersuchen, wurden TVP-Mutanten analysiert. Durch Kombination aller drei TVP-Gen-Mutanten wurden TVP-Dreifachmutanten generiert. Diese wiesen keinen offensichtlichen Defekt im Bewegungsmuster auf, entwickelten sich normal und bildeten ein normales Nervensystem aus. Auch auf unterschiedliche chemische und physikalische Reize in sensorischen Tests reagierten die TVP-Dreifachmutanten in gleicher Weise wie Wildtyptiere. Ebenso zeigen die TVP-Dreifachmutanten elektrophysiologisch unter normalen Bedingungen keine anormalen Reaktionsmuster. In ultrastrukturellen Untersuchungen wurde lediglich eine signifikant erhöhte Anzahl Clathrin-ummantelter Vesikel in cholinergen Synapsen gefunden. Erst unter Stressbedingungen, hervorgerufen durch den GABA-Antagonisten Pentylentetrazol (PTZ), wiesen sowohl die TVP-Dreifach- als auch die TVP-Einzelmutanten eine deutlich erhöhte Krampfbereitschaft auf. Zusammengenommen zeigen die Analysen, dass TVPs zwar für grundlegende neuronale Prozesse nicht notwendig sind, dass sie aber auf der anderen Seite vermutlich an alternativen redundanten Wegen der Neurotransmitterfreisetzung beteiligt sind.