Generierung und Charakterisierung von rekombinanten Cytomegaloviren mit Punktmutationen in antigenen Peptiden

Die Kontrolle der produktiven Cytomegalovirus- (CMV) Infektion ist von der effizienten Rekonstitution antiviraler CD8 T-Zellen abhängig. Dies führt jedoch nicht zur vollständigen Eliminierung des viralen Genoms aus den Zielorganen, sondern das Virus verbleibt in einem nicht-replikativen Zustand: der Latenz. Es ist bekannt, dass während der Latenz nur ein geringer Anteil latenter mCMV-Genome in der Lunge die Major Immediate Early (MIE) Gene ie1 und ie2 exprimiert, die Latenz aber dennoch bestehen bleibt, weil das differentielle Splicing des primären IE1/3-Transkripts zum Transaktivator-Transkript IE3 nicht erfolgt. Damit war neben der Initiation der IE-Genexpression am MIE-Promotor-Enhancer das IE1/3-Splicing als zweiter molekularer Latenz-Kontrollpunkt identifiziert. Parallel zur Latenz-assoziierten IE1-Genexpression sind in der Lunge aktivierte CD62L-low CD8 T-Zellen mit Spezifität für das immundominante IE1-Peptid 168-YPHFMPTNL-176 angereichert. Dies legte die Hypothese nahe, dass neben der molekularen Kontrolle der Latenz auch eine immunologische Kontrolle, beispielsweise durch IE1-Epitop-spezifische CD8 T-Zellen besteht. Zur Evaluierung dieser Hypothese wurde in der vorliegenden Arbeit mittels BAC-Mutagenese erstmals ein rekombinantes mCMV generiert, in dem das IE1-Peptid durch Punktmutation der C-terminalen MHC-Ankeraminosäure L176A zerstört ist. Dazu musste zunächst die Technik der BAC-Mutagenese herpesviraler Genome (in Anlehnung an die publizierten Arbeiten von Messerle et al., 1997; Borst et al., 1999, 2004; Wagner et al., 1999) in der Arbeitsgruppe etabliert werden. Neben der Funktionsverlust-Mutante (mCMV-IE1-L176A) wurden zur Kontrolle zwei Revertanten (mCMV-IE1-A176L und mCMV-IE1-A176L*) generiert. In letzterer, als Wobble-Revertante bezeichnet, wird wieder die authentische MHC-Ankeraminosäure L eingesetzt, es verbleibt aber ein singulärer Nukleotidaustausch A->T in der Wobble-Position des Codons als Marker zur Unterscheidung zum WT-mCMV zurück. Der immunologische Phänotyp der Funktionsverlust-Mutante, also die funktionelle Auslöschung des antigenen IE1-Peptids im Priming einer CD8 T-Zell-Antwort, entsprach der Erwartung. Entsprechend konnte nach Infektion mit der Funktionsverlust-Mutante keine Reaktivität gegen das IE1-Peptid nachgewiesen werden. In den Revertanten hingegen war die Erkennung des IE1-Peptids wieder hergestellt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen weiter, dass die Funktionsverlust-Mutante sowie die Revertanten ohne signifikante Beeinflussung in vitro in permissiven Fibroblasten und in vivo in verschiedenen Geweben replizieren. Wie aktuelle Daten nach Knochenmarktransplantation und Infektion mit der Funktionsverlust-Mutante im Vergleich zu den Revertanten zeigen, ist die Frequenz Latenz-assoziierter IE1-Transkriptionsereignisse bei der Funktionsverlust-Mutante signifikant erhöht. Damit konnte erstmalig der Beweis für eine Kontrolle der Latenz-assoziierten IE1-Genexpression durch IE1-Epitop-spezifische CD8 T-Zellen und damit für eine Präsentation des IE1-Peptids während der Latenz erbracht werden.

Productive cytomegalovirus (CMV) infection is resolved and fatal disease is prevented by a functional immune system, primarily by CD8 T cells, but a magic hat appears to preserve the virus from being eliminated. The viral genome persists for the lifetime of its host in the presence of a fully developed, protective antiviral immune memory. This phenomenon  known as virus latency , is a hallmark that CMVs share with all other members of the herpesvirus family. The pulmonary latency of murine CMV (mCMV) is characterized by a high viral genome burden and a low incidence of major immediate-early (MIE) gene expression, reflecting a sporadic but selective expression of IE1 and IE2 transcripts in the absence of IE3 splicing that encodes the essential transactivator for early gene expression. Thus splicing appeared to be an important checkpoint for maintenance of latency. Parallel to latency-associated IE1 gene expression we found an accumulation of activated CD62L-low CD8 T cells in the lung specific for the immunodominant IE1 peptide 168-YPHFMPTNL-176. These findings lead us to the following hypothesis: IE1 epitope-specific CD8 T cells recognize latently infected cells at the earliest stage of viral transcriptional reactivation. To evaluate the hypothesis we have constructed a virus mutant by BAC mutagenesis in which the IE1 epitope was deleted by a point mutation at the C-terminal MHC anchor residue (for the first time). In addition, the manipulation technique of mCMV BAC genomes (according to Messerle et al., 1997; Borst et al., 1999, 2004; Wagner et al., 1999) was established in our group. Beside the generation of the loss of function mutant mCMV-IE1-L176A two revertants (mCMV-IE1-A176L and mCMV-IE1-A176L*) were constructed. The genetically marked revertant mCMV-IE1-A176L* contains a single nucleotide point mutation A->T in the wobble position of the L-encoding codon. Functional deletion of the IE1 antigenicity was shown by absence of IE1 peptide-specific CD 8 T cells with cells derived from BALB/c mice infected with the mutant. After infection with the revetants the recognition of the IE1 peptide was reconstituted. In addition the recombinants grow like wild type mCMV in fetal fibroblasts and also in vivo in various tissues. Resent data after bone marrow transplantation and infection with the mutant, indicate that deletion of the IE1 epitope and thus of IE1 epitope-specific CD8 T cells, increases the frequency of latently infected cells that express IE1. This was the first evidence for a control of latency-associated IE1 transcription by IE1 epitope-specific CD8 T cells as well as for presentation of the IE1 peptide during latency.