61 resultados para Célula TCD4
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Dissertao apresentada para obteno do Grau de Doutor em Qumica, especialidade Qumica Inorgnica, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Cincias e Tecnologia.
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Dissertao apresentada na Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obteno do Grau de Mestre em Gentica Molecular e Biomedicina
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Dissertao apresentada para a obteno do grau de Doutor em Biologia,especialidade Gentica Molecular pela Universidade Nova de Lisboa,Faculdade de Cincias e Tecnologia
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Dissertao apresentada na Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obteno do grau de Mestre em engenharia dos materiais
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A resistncia aos antibiticos em bactrias Gram-negativas pode ser aumentada pela extruso de antibiticos atravs de sistemas de efluxo. Em Escherichia coli, o principal sistema de efluxo o AcrAB-TolC o qual tem como principal fonte energtica a fora proto-motriz. Este trabalho pretendeu estudar alguns aspectos essenciais da bioenergtica na actividade de efluxo de E. coli usando trs estirpes bem caracterizadas genotipica e fenotipicamente. Foi utilizado um mtodo fluorimtrico semi-automtico no qual a fluorescncia do fluorocromo brometo de etdeo, substrato de bombas de efluxo foi seguida, permitindo a medio em tempo real da actividade de efluxo e acumulao de fluorocromo (inibio do efluxo). A utilizao de brometo de etdeo particularmente vantajosa pois emite baixa fluorescncia no exterior da célula bacteriana tornando-se extremamente fluorescente no seu interior. Este mtodo uma nova aplicao do termociclador em tempo real RotorGeneTM 3000 que permite o clculo da cintica de transporte reflectindo o balano entre acumulao de substrato por difuso passiva atravs da membrana e a sua extruso/efluxo, proporcionando uma deteco rpida e econmica de inibidores de efluxo. Os resultados obtidos mostram, para todas as estirpes, que a GLU e o pH afectam a acumulao e o efluxo do brometo de etdeo. De todos os inibidores de vias biossintticas testados, o ortovanadato de sdio, foi o que demonstrou maior actividade inibitria, a qual revertida na presena de GLU. Em concluso, este estudo mostra que a actividade de efluxo de E. coli depende no s da fosforilao oxidativa por via da fora proto-motriz mas tambm da energia proveniente da hidrlise de ATP pelas ATPases. O ortovanadato de sdio tem potencial para ser um novo inibidor de bombas de efluxo de largo espectro. A tecnologia utilizada neste trabalho demonstrou ser apropriada para a caracterizao bioenergtica da actividade de bombas de efluxo e permite a seleco de novos inibidores de bombas de efluxo em bactrias.
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Dissertao apresentada na Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obteno do grau Mestre em Engenharia Civil Perfil de Construo
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Dissertao apresentada na Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obteno do Grau de Mestre em Energias Renovveis Converso Elctrica e Utilizao Sustentvel
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Dissertao apresentada na Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obteno do grau de Mestre em Engenharia Electrotcnica e de Computadores
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Dissertao apresentada na Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obteno do grau de Mestre em Engenharia Electrotcnica e de Computadores
Caracterizao do efeito anti-tumoral de complexos organometlicos contendo 1,10-fenantrolina-5,6-diona
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Dissertao apresentada para a obteno do Grau de Mestre em Gentica Molecular e Biomedicina, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Cincias e Tecnologia
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Resumo A tumorignese um processo de transformao celular que se desenrola tipicamente em vrias etapas. Os diferentes nveis de evoluo tumoral resultam da acumulao sucessiva de mutaes genticas numa célula normal que lhe conferem uma vantagem selectiva no respectivo meio tecidular. As mutaes podem manifestar-se sob a forma de alteraes nucleotdicas pontuais ao nvel da sequncia de DNA, levando a uma desregulao da funo proteca ou formao de protenas no-funcionais, ou atravs de alteraes cromossmicas numricas ou estruturais. Na leucemia, por exemplo, os genes hbridos que resultam de translocaes cromossmicas desempenham um importante papel no processo tumorignico. Estes genes so transcritos sob a forma de um RNA mensageiro de fuso, o qual traduzido numa protena hbrida com funo oncognica. Frequentemente, os subtipos de doena leucmica esto associados com translocaes cromossmicas que envolvem 2 pontos de quebra recorrentes e especficos. disto exemplo a leucemia mielide crnica, em que uma translocao recproca entre os cromossomas 9 e 22 conduz formao de um gene de fuso BCR-ABL1. Em diferentes subtipos de doena, existe tambm uma pequena proporo de casos que apresenta translocaes cromossmicas complexas, que envolvem um ou mais pontos de quebra adicionais em outras localizaes genmicas alm das que esto implicadas na formao dos genes de fuso. Por vezes, os pontos de quebra esto tambm associados a deleces extensas de material gentico que se pensa terem uma funo importante na tumorignese. No entanto, o papel destas regies genmicas no desenvolvimento tumoral no tem sido um motivo recorrente de estudo. Neste contexto, o objectivo desta dissertao foi o de determinar o potencial papel tumorignico de alteraes gnicas adicionais ocorridas nos pontos de quebra de translocaes cromossmicas complexas. Para a prossecuo do objectivo proposto, foram estudados 5 rearranjos cromossmicos distintos associados com diferentes tipos de doena hematolgica maligna, nomeadamente a leucemia linfoblstica aguda de células B (2 casos), leucemia mielide aguda, neoplasma mieloproliferativo e sndrome mielodisplsico/neoplasma ieloproliferativo, no classificvel. O mapeamento dos pontos de quebra foi efectuado utilizando a hibridao fluorescente in situ e diferentes metodologias de biologia molecular, tendo como base a informao inicial da anlise citogentica. Em casos seleccionados, o papel dos novos genes candidatos foi avaliado in vitro utilizando modelos de linhas celulares, nomeadamente no que respeita s funes de controlo da proliferao celular e de regulao transcricional. De entre os 5 casos estudados, quatro deles evidenciaram translocaes complexas envolvendo 3 cromossomas, nomeadamente t(12;21;5)(p13;q22;q13), t(12;6;15)(p13;p24~25;q22), t(9;11;19)(p22;q23;p13) e t(X;20;16)(p11;q13;q23). No caso remanescente, foi observada uma translocao dicntrica dic(9;12)(p11;p11) acompanhada de deleces extensas em ambos os pontos de quebra. Nos casos com t(12;21;5) e t(9;11;19) as translocaes estavam associadas com a presena de genes de fuso recorrentes, nomeadamente TV6(12p13)-RUNX1(21q22) e TLL(11q23)-MLLT3(9p22), indicando que se tratavam de rearranjos complexos das translocaes t(12;21) e t(9;11) associadas com a leucemia linfoblstica aguda de células B e a leucemia mielide aguda, respectivamente. O papel dos pontos de quebra adicionais foi estudado em detalhe no caso com t(9;11;19). Atravs da metodologia de long distance inverse-polymerase chain reaction, foram identificados os pontos de quebra na sequncia de DNA dos 3 cromossomas envolvidos na translocao. Alm dos pontos de quebra nos genes MLL e MLLT3, foi observado que o local de quebra no cromossoma 19 interrompeu a sequncia de um novo gene, designado CCDC94,conduzindo sua haplo-insuficincia nas células com t(9;11;19). Atravs de ensaios de reverse transcription-polymerase chain reaction verificmos que o gene CCDC94 expresso ubiquitariamente em tecidos humanos normais. A anlise informtica da sequncia prevista da protena CCDC94 indicou uma elevada identidade de aminocidos com a protena cwf16, envolvida na regulao do ciclo celular da levedura Schizosaccharomyces pombe. Atravs da clonagem do DNA complementar de CCDC94 em vectores de expresso, e aps a transfeco destes em culturas de linhas celulares in vitro, observmos que este gene codifica uma protena de localizao exclusivamente nuclear. A expresso ectpica da protena CCDC94 diminuiu a progresso do ciclo celular e a proliferao das células em cultura. Inversamente, a supresso do transcrito do gene CCDC94 atravs de interferncia de RNA conduziu a um aumento significativo da proliferao celular, confirmando que CCDC94 regula negativamente a proliferao e a progresso do ciclo celular. Estes resultados mostram que os pontos de quebra adicionais, presentes em translocaes cromossmicas complexas em leucemia, podem resultar na haplo-insuficincia de genes controladores dos mecanismos proliferativos, cooperando desta forma com a aco das protenas de fuso para proporcionar ao clone leucmico uma proliferao celular descontrolada. Nos restantes 3 casos estudados no foram identificados genes de fuso. Ao invs, todos aqueles apresentaram deleces de extenso varivel associadas com os pontos de quebra cromossmicos. No caso com t(12;6;15), identificmos uma deleco de 1.2 megabases de DNA na banda 12p13 que resultou na eliminao de 9 genes incluindo ETV6 e CDKN1B. O gene ETV6 codifica um factor de transcrio que essencial para a formao das diferentes linhagens hematopoiticas na medula ssea, enquanto CDKN1B traduzido numa protena responsvel por bloquear a entrada das células na fase G1 do ciclo celular e,consequentemente, por travar a proliferao celular. Neste contexto, os resultados obtidos indicam que a perda simultnea de ETV6 e de CDKN1B, atravs de uma translocao cromossmica complexa, constituiu uma aco cooperativa na leucemognese. A mesma noo pode aplicar-se ao caso com dic(9;12), no qual pelo menos 2 genes que codificam para factores de transcrio importantes na linhagem hematopoitica, PAX5 no cromossoma 9 e ETV6 no cromossoma 12, estavam deleccionados como resultado do rearranjo cromossmico. Dado que o factor de transcrio PAX5 regula negativamente a expresso do gene FLT3, que desempenha uma funo pr-proliferativa, expectvel que a haplo-insuficincia de PAX5 no caso com dic(9;12) ter tido como consequncia uma elevao dos nveis de expresso de FLT3, contribuindo deste modo para uma proliferao celular aumentada. A t(X;20;16) foi identificada num doente com trombocitmia essencial (TE), uma doena que est intimamente relacionada com alteraes de vias intracelulares reguladas por citocinas. Neste caso, atravs da utilizao de um array genmico, identificmos a presena de pequenas deleces associadas com os pontos de quebra nos cromossomas 16 e 20. No cromossoma 16 apenas um gene, MAF, estava deleccionado, enquanto no cromossoma 20 a deleco tinha abrangido 3 genes. Dos genes deleccionados, dois deles, NFATC2 (20q13) e MAF (16q23), codificam protenas que operam como reguladores transcricionais de citocinas hematopoiticas. Dado que NFATC2 se localiza numa regio que constitui um alvo frequente de deleces em neoplasmas ieloproliferativos, incluindo a trombocitmia essencial,efectumos um estudo detalhado do papel deste gene na proliferao megacarioctica e na regulao da expresso de uma citocina hematopoitica (GM-CSF), implicada na maturao das diferentes linhagens mielides. Utilizando um modelo de linha celular de trombocitmia essencial, verificmos que a supresso do transcrito do gene NFATC2 in vitro, por interferncia de RNA, estava associada com um aumento da proliferao celular. Em concordncia, o bloqueio da activao da protena NFATC2 atravs de um inibidor especfico da sua interaco com a calcineurina, conduziu a um aumento da proliferao celular in vitro. Utilizando a PCR quantitativa em tempo real, detectou-se um aumento da produo do RNA de GM-CSF em ambos os ensaios celulares, indicando que o factor de transcrio NFATC2 pode regular negativamente a expresso de GM-CSF em células de trombocitmia essencial. No geral, estes resultados mostram que a reduo dos nveis fisiolgicos do transcrito NFATC2, ou a reduo da respectiva actividade proteica, esto relacionados com a proliferao de megacariocitos atravs do aumento da produo de GM-CSF. De acordo com estes resultados, verificmos que as células dos doentes com TE apresentam nveis mais baixos do transcrito NFATC2 do que a populao normal. Dado que o factor de transcrio MAF desempenha igualmente um papel como regular transcricional de citocinas, plausvel que a haplo-insuficincia dos genes NFATC2 e MAF, resultante do rearranjo cromossmico complexo t(X;20;16), teve um efeito cooperativo importante na patognese da trombocitmia essencial atravs da alterao do padro normal de expresso das citocinas hematopoiticas. Em sntese, efectumos nesta dissertao um estudo citogentico de 4 translocaes cromossmicas complexas incluindo t(12;21;5), t(12;6;15), t(9;11;19) e t(X;20;16), e de uma translocao dicntrica dic(9;12), associadas com diferentes neoplasmas hematolgicos. Em casos seleccionados efectumos tambm um estudo molecular detalhado das regies dos pontos de quebra. Esta anlise permitiu-nos identificar 2 genes, CCDC94 no cromossoma 19 e NFATC2 no cromossoma 20, cuja haplo-insuficincia pode promover o aumento da proliferao celular das células leucmicas. A partir destes estudos podem ser retiradas 2 noes principais: (i) Os pontos de quebra adicionais, que ocorrem em translocaes complexas associadas com a formao de genes de fuso, podem ter como consequncia a desregulao de genes controladores da proliferao celular (e.g., CCDC94); (ii) As translocaes complexas caracterizadas pela ausncia de genes de fuso recorrentes podero estar preferencialmente associadas com a presena de deleces, envolvendo um ou mais genes, nos pontos de quebra; nestas situaes, sero necessrios pelo menos 2 genes com funes celulares semelhantes (e.g., NFATC2 e MAF) ou complementares (e.g., ETV6 e CDKN1B) para, quando deleccionados, promoverem de forma cooperativa a leucemognese. Nestes termos, o modelo de alteraes genticas sequenciais que caracteriza o desenvolvimento do cancro pode ser substitudo por um modelo em que vrios genes-alvo so simultaneamente desregulados pela formao de uma translocao cromossmica complexa, evitando deste modo a necessidade de ocorrncia de alteraes genticas subsequentes.----------------------ABSTRACT: Tumourigenesis is a multistep process which results from the accumulation of successive genetic mutations in a normal cell. In leukemia for instance, recurrent translocations play a part in this process by generating fusion genes which lead to the production of hybrid proteins with an oncogenic role. However, a minor subset of chromosomal translocations referred to as complex or variant involves extra breakpoints at variable genome locations in addition to those implicated in the formation of fusion genes. We aimed to describe in this work the role, if any, of genes located at extra breakpoint locations or which are affected by breakpoint-adjacent deletions through the study of 5 leukemia patients.Two of the patients presented with TV6(12p13)-RUNX1(21q22) and MLL(11q23)- MLLT3(9p22) fusion genes as a result of a t(12;21;5) and a t(9;11;19), respectively. Detailed molecular characterization of the extra breakpoint at chromosome 19 in the latter case revealed that a novel ubiquitously expressed gene, CCDC94, with a potential role in cell cycle regulation, was disrupted by the breakpoint. We demonstrated using in vitro cellular assays that this gene codifies for a nuclear protein which negatively regulates cell cycle progression. These data shows that extra breakpoint locations of complex translocations may result in haplo-insufficiency of critical proliferation genes, thereby cooperating with the generation of hybrid proteins to provide unrestrained cell proliferation. In the other 3 patients there were reakpoint-associated deletions which precluded the formation of putative fusion genes. In a case with a t(12;6;15) we characterized a deletion at 12p13 which eliminated ETV6 and 8 other genes including CDKN1B. These findings indicate that concomitant loss of ETV6 and CDKN1B, which encodes a cyclin-dependent kinase inhibitor responsible for blocking entry of cells into the G1 phase of the cell cycle, acted cooperatively to promote leukemogenic proliferation. The same notion applied to a case with a dic(9;12) in which 2 genes encoding hematopoietic transcription factors - ETV6 and PAX5 (9p13)- were deleted as a result of breakpoint-adjacent deletions. Similarly, we found that 2 transcription factor genes involved in the regulation of cytokine expression, NFATC2 (20q13) and MAF (16q23), were involved in deletions contiguous to the breakpoints in a patient with a t(X;20;16). In vitro suppression of NFATC2 mRNA or inhibiton of NFATC2 protein activity enhanced cell proliferation as a result of an increase in the production of a myeloid-lineage stimulating hematopoietic cytokine, GM-CSF. These results suggest that haplo-insufficiency of NFATC2 and MAF genes had a cooperative effect in inducing cell proliferation as a result of a disregulation of cytokine production. Two main conclusions may be drawn from our studies: (i) In complex translocations associated with the production of fusion genes, additional breakpoints may cooperate in tumourigenesis by targeting genes that control cell proliferation; (ii) In complex translocations associated with small breakpoint-adjacent deletions, at least 2 genes with similar or complementary functions need to be deregulated to promote tumourigenesis.
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Dissertao para obteno do Grau de Mestre em Biotecnologia
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Dissertao para obteno do Grau de Mestre em Engenharia de Materiais
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Dissertao para obteno do Grau de Mestre em Gentica Molecular e Biomedicina
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RESUMO: A esporulao em Bacillus subtilis controlada por uma cascata de factores sigma da polimerase do RNA. F e E controlam os estgios precoces do desenvolvimento no pr-esporo e na célula me, respectivamente. Numa fase intermdia da diferenciao, quando a célula me acaba por envolver o pr-esporo, F substitudo por G e E substitudo por K. Vrios mecanismos asseguram que a actividade dos diferentes factores sigma seja confinada a uma janela temporal precisa na célula adequada. Neste estudo, investigmos a funo de um factor anti-G, designado por CsfB. Mostramos que para alm da sua funo de inibio da actividade do factor G em células pr-divisionais, CsfB tambm necessrio na célula me num estgio tardio do desenvolvimento. Mostramos que a expresso de csfB activada na célula me a partir de um promotor dependente de K. Contudo, demonstramos que CsfB interage directamente com E e no com K, e que CsfB suficiente para inibir a actividade transcricional dependente de E em células vegetativas de B. subtilis. Propomos que CsfB contribui para reduzir o perodo dependente de E, na linha de expresso gentica da célula me, desse modo reduzindo a sobreposio entre os regules E e K e aumentado a fidelidade do processo de desenvolvimento. Uma segunda protena, YabK, partilha semelhana estrutural com CsfB. YabK produzida no pr-esporo sob o comando de F, e necessria para a esporulao. YabK contribui para a transio F/G no programa gentico do pr-esporo, porque uma mutao que torna F sensvel a CsfB ultrapassa parcialmente a funo de YabK na esporulao. No entanto, YabK e CsfB funcionam por mecanismos diferentes, uma vez que YabK no liga directamente a F.---------ABSTRACT: Gene expression during spore development in Bacillus subtilis is governed by a cascade of RNA polymerase sigma factors. F and E control the early stages of development in the forespore and in the mother cell, respectively. At an intermediate stage in the differentiation process, when the larger mother cell finishes engulfment of the smaller forespore, F is replaced by G and E is replaced by K. Several mechanisms ensure the proper timing of activation of the cell type-specific sigma factors. Here, we have investigated the funtion of an anti-sigma G factor, called CsfB. We show here that in addition to its role in inhibiting G in pre-divisional cells, CsfB is also required in the mother cell at a late stage in development. We show that the expression of csfB is activated in the mother cell from a K-specific promoter. However, we demonstrate that CsfB binds directly to E but not to K in a yeast two-hybrid assay, and that CsfB is sufficient to inhibit E-dependent transcriptional activity in vegetative cells of B. subtilis. We posit that CsfB contributes to shutting off the early, E-controlled period in the mother cell line of gene expression, thus reducing the overlap between deployment of the E and K regulons and increasing the fidelity of the developmental process. A second protein, YabK, shares structural similarity with CsfB. YabK is produced in the forespore under F control, and is required for efficient sporulation. YabK contributes to the transition from the F- to the G-dependent period of gene expression, because a mutation that renders F sensitive to CsfB partially bypasses the need for YabK. Yet, YabK and CsfB must function in the control of sigma factor activity by different mechanisms because YabK does not bind directly to F.
