Estudos estruturais e enzimáticos de proteínas envolvidas no metabolismo do enxofre: caracterização de enzimas isoladas de desulfovibrio sp. e Thiobacillus sp.

Dissertação apresentada para obtenção do Grau de Doutor em Química, especialidade Química Inorgânica, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia.

Ao longo da última década foi evidenciado o papel dos centros ferro-enxofre como constituinte do sítio activo de várias enzimas envolvidas em reacções de transferência electrónica, oxidação-redução de substratos, transferência de grupos não-redox e regulação da actividade enzimática. As proteínas de ferro-enxofre participam, assim, em processos biológicos muito importantes para o bom funcionamento da célula, tais como o ciclo de Krebs, a fotossíntese, a cadeia respiratória ou a síntese e reparação de DNA. Os agregados do tipo [4Fe-4S] são, na realidade, os centros ferro-enxofre que predominam na natureza. Para além do seu importante papel no transporte electrónico, podem desempenhar funções catalíticas. Exemplos de proteínas que possuem este tipo de agregado são a hidrogenase, a redutase do sulfito, a redutase do APS ou as hidratases/desidratases do tipo da aconitase. A catálise envolve a interacção directa do substrato com o agregado [4Fe-4S] originando alterações estruturais nestes. Nesta dissertação, descreve-se o estudo de proteínas de ferro-enxofre isoladas de bactérias envolvidas no metabolismo do enxofre, em particular a redutase do APS e a redutase do sulfito. A redutase do APS é uma das principais enzimas que intervêm na redução dissimilativa do sulfato. Esta enzima catalisa a reacção reversível de conversão do APS(aforma activada do sulfato) a sulfito e AMP. Presente em todas as bactérias redutoras de sulfato, nomeadamente do género Desulfooibrio, foi também isolada de uma arquebactéria Archaeoglobus fulgidus e de algumas bactérias do género Thiobacillus. Neste trabalho, apresenta-se a purificação e caracterização da redutase do APS de Desulfooibrio desulfuricans ATCC 27774, de Thiobacillus denitrificans ATCC 23642 e de uma bactéria redutora de sulfato isolada do interior de tubagens de ferro sob corrosão activa, Desulfooibrio desulfuricans subespécie desulfuricans New Jersey. Verificou-se que, de um modo geral, as redutases do APS são proteínas muito homólogas, em termos da massa molecular, composição do sito activo e propriedades espeetroscópicas dos seus cromóforos. A redutase do APS é uma proteína de elevada massa molecular (160-180 kDa) que contém dois agregados [4Fe-4S] (denominados cento I e centro II) e uma unidade FAD. O espectro de UV/ visível da proteína na forma nativa é caracterizado por uma banda larga com absorção máxima a - 388 nm e dois ombros entre 475 e 445 nm, geralmente observados em flavoproteínas que contêm agregados ferro-enxofre.