Reactivación de agregados proteicos por chaperonas moleculares

ClpB es una chaperona hexamérica que solubiliza y reactiva agregados proteicos con la colaboración del sistema Hsp70/Dnak. Cada monómero de la proteína contiene dos dominios de unión a nucleótido, NBDs, que unen e hidrolizan ATP. La inserción de subunidades mutantes inactivas, es decir, incapaces de hidrolizar ATP, en el hexámero de ClpB inhibe la actividad replegadora de esta chaperona porque bloquean la comunicación alostérica que se establece entre los NBDs de los protómeros. Con el fin de conocer qué dominios de la proteína se encuentran implicados en dicha comunicación intermonomérica, se preparan híbridos de ClpB que contienen subunidades inactivas sin dominio N-terminal o dominio M. Asimismo, se estudia el efecto de DnaK en la actividad ATPasa de ClpB.

Clonaje y expresión de mutantes de Apg2

La Apg-2 es una chaperona humana que Junto con Hsp70 y Hsp40 rompe agregados proteicos y replega las proteínas liberadas. Comparando con su homólogo en bacterias Sse1p, se observa que el complejo de levaduras requiere la ayuda de la desagregasa Hsp104. Comparando secuencias, Apg-2 tiene inserciones en dos regiones concretas. Mediante mutaciones que eliminen esas regiones se quiere probar como influyen en la función de la proteína. en este trabajo se realiza el clonaje y la expresión de la proteína y los mutantes.

Molecular reconstruction of a genetic code alteration

The genetic code establishes the rules that govern gene translation into proteins. It was established more than 3.5 billion years ago and it is one of the most conserved features of life. Despite this, several alterations to the standard genetic code have been discovered in both prokaryotes and eukaryotes, namely in the fungal CTG clade where a unique seryl transfer RNA (tRNACAG Ser) decodes leucine CUG codons as serine. This tRNACAG Ser appeared 272±25 million years ago through insertion of an adenosine in the middle position of the anticodon of a tRNACGA Ser gene, which changed its anticodon from 5´-CGA-3´ to 5´-CAG-3´. This most dramatic genetic event restructured the proteome of the CTG clade species, but it is not yet clear how and why such deleterious genetic event was selected and became fixed in those fungal genomes. In this study we have attempted to shed new light on the evolution of this fungal genetic code alteration by reconstructing its evolutionary pathway in vivo in the yeast Saccharomyces cerevisiae. For this, we have expressed wild type and mutant versions of the C. albicans tRNACGA Ser gene into S. cerevisiae and evaluated the impact of the mutant tRNACGA Ser on fitness, tRNA stability, translation efficiency and aminoacylation kinetics. Our data demonstrate that these mutants are expressed and misincorporate Ser at CUGs, but their expression is repressed through an unknown molecular mechanism. We further demonstrate, using in vivo forced evolution methodologies, that the tRNACAG Ser can be easily inactivated through natural mutations that prevent its recognition by the seryl-tRNA synthetase. The overall data show that repression of expression of the mistranslating tRNACAG Ser played a critical role on the evolution of CUG reassignment from Leu to Ser. In order to better understand the evolution of natural genetic code alterations, we have also engineered partial reassignment of various codons in yeast. The data confirmed that genetic code ambiguity affects fitness, induces protein aggregation, interferes with the cell cycle and results in nuclear and morphologic alterations, genome instability and gene expression deregulation. Interestingly, it also generates phenotypic variability and phenotypes that confer growth advantages in certain environmental conditions. This study provides strong evidence for direct and critical roles of the environment on the evolution of genetic code alterations.

Characterization of proteotoxic stress in zebrafish

A fidelidade da síntese proteica é fundamental para a estabilidade do proteoma e para a homeostasia celular. Em condições fisiológicas normais as células têm uma taxa de erro basal associada e esta muitas vezes aumenta com o envelhecimento e doença. Problemas na síntese das proteínas estão associados a várias doenças humanas e aos processos de envelhecimento. De facto, a incorporação de erros nas proteínas devido a tRNAs carregados pelas aminoacil-tRNA sintetases com o amino ácido errado causa doenças neurodegenerativas em humanos e ratos. Ainda não é claro como é que estas doenças se desenvolvem e se são uma consequência directa da disrupção do proteoma ou se são o resultado da toxicidade produzida pela acúmulação de proteínas mal traduzidas ao nível do ribossoma. Para elucidar como é que as células eucarióticas lidam com proteínas aberrantes e agregados proteicos (stress proteotóxico) desenvolvemos uma estratégia para destabilizar o proteoma. Para isso estabelecemos um sistema de erros de tradução em embriões de peixe zebra que assenta em tRNAs mutantes capazes de incorporar erradamente serina nas proteínas. As proteínas produzidas neste sistema despoletam as vias de resposta ao stress, nomeadamente a via da ubiquitina-proteassoma (UPP – “ubiquitin protesome pathway”) e a via do retículo endoplasmático (UPR – “unfolded protein response”). O stress proteotóxico gerado pelos erros de tradução altera a expressão génica e perfis de expressão de miRNAs, o desenvolvimento embrionário e viabilidade, aumenta a produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS), leva ainda à acumulação de agregados proteicos e à disfunção mitocondrial. As malformações embrionárias e fenótipos de viabilidade que observámos foram revertidos por antioxidantes, o que sugere que os ROS desempenham papéis importantes nos fenótipos degenerativos celulares induzidos pela produção de proteínas aberrantes e agregação proteica. Estabelecemos ainda uma linha de peixe zebra transgénica para o estudo do stress proteotóxico. Este trabalho mostra que a destabilização do proteoma em embriões de peixe zebra com tRNAs mutantes é uma boa metodologia para estudar a biologia do stress proteotóxico visto que permite a agregação controlada do proteoma, mimetizando os processos de agregação de proteínas que ocorrem naturalmente durante o envelhecimento e em doenças conformacionais humanas.

Autophagy in hypothalamic cells: role of Neuropeptide Y

Dissertação de mest.Ciências Biomédicas. Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Univ. do Algarve, 2011

Molecular bases of classic galactosemia : searching for new therapeutic strategies

Tese de doutoramento, Farmácia (Biologia Celular e Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2014

Modulation of calcitonin amyloid formation by anionic lipid membranes

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2014

Estudo das interações de eIF5A com a maquinaria de tradução e com o complexo Ribosome Quality Control, utilizando modelo de Saccharomyces cerevisiae

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

La reforma de los agregados monetarios en España, 1973-1992

Las dudas que aún se mantienen en pie tras varias décadas de debate teórico, los menores niveles de inflación existentes en la actualidad, las dificultades financieras planteadas por la persistencia de los tipos de interés en niveles altos durante muchos años, la necesidad de tasas mayores de crecimiento para reducir los niveles de desempleo y déficits públicos acumulados son razones que han ido inclinando la balanza hacia un menor peso de la política monetaria restrictiva en la combinación actual de instrumentos de política económica. Aunque no sin reticencias, la política antiinflacionista parece alejarse del planteamiento tradicional y situarse más en otros terrenos. El relevo lo están tomando la política salarial, la reforma del mercado laboral, la disminución del déficit público, la política de competencia y, en menor medida, la política industrial.

Complejos proteicos elipsoidales NP: Octámero y su relación con el ensamblaje de nucleosomas

Se caracterizan los complejos entre la nucleoplasmina, una chaperona nuclear, y el octámero de histonas y se ve su papel en el ensamblaje de nucleosomas.

Estabilidade de agregados em latossolo vermelho-escuro da área experimental da Embrapa Meio Ambiente: subsídios aos estudos de avaliação do comportamento físico do solo na presença de lodo de esgoto.

O presente trabalho tem como objetivo principal avaliar o comportamento de agregados de um Latossolo Vermelho-Escuro da área experimental da Embrapa Meio Ambiente durante três anos, período em que serão aplicados dois tipos de lodo de esgoto em diferentes dosagens.

Estabilidade de agregados em água: análise crítica e padronização.

2010

Índices de agregação e teor de carbono intra-agregados como indicadores de qualidade do solo.

Esse trabalho teve por objetivo avaliar diferentes índices de agregação e teores de carbono em diferentes classes de agregados como ferramenta de diagnóstico de qualidade da estrutura do solo. O estudo foi realizado em uma microbacia localizada no Município de São Francisco de Itabapoana-RJ. Foram estudados três usos da terra: uma sucessão de abacaxi-aipim; um pastoreio-rotacionado e um remanescente de mata (referência), todos sob Latossolo Amarelo. Utilizou-se estatística multivariada (análise discriminante e canônica) para seleção dos índices que melhor indicam as mudanças na estrutura do solo e teste Dunnett para comparação de médias dos índices e do carbono em agregados. A mata e o pastoreio-rotacionado apresentaram os valores mais altos para as variáveis: Diâmetro Médio Ponderado (DMP), Diâmetro Médio Geométrico (DMG) e Índice de Estabilidade de Agregados (IEA), sendo respectivamente 2,94 mm, 2,83 mm, 92% e 2,92 mm, 2,75 mm, 91%. A sucessão de abacaxi-aipim apresentou os menores valores para esses índices, sendo 2,22 mm, 0,95 mm, 58% respectivamente. As variáveis que foram as melhores discriminantes para a estrutura e qualidade do solo foram a relação macro/microagregados e carbono intra-agregado, denotando a sensibilidade do C, tanto do macro quanto do microagregado da sucessão de culturas frente à mata (referência).

Intensificación de las secuencias de cultivos en un molisol y un vertisol : cambios en la estabilidad estructural y en el almacenaje de C en agregados

Los actuales sistemas agrícolas de la Región Pampeana argentina presentan una elevada frecuencia de barbechos en las secuencias de cultivos lo que resulta en el desperdicio de recursos ambientales y en un mayor impacto de los procesos erosivos sobre la agregación y el almacenaje de carbono orgánico del suelo (COS). La intensificación de las secuencias de cultivos, por medio de la reducción de los períodos de barbecho es una alternativa para mejorar la eficiencia y productividad de dichos sistemas, aunque existe escasa información sobre su impacto en la agregación y en el almacenaje de COS en suelos con agentes de agregación contrastantes. El objetivo de esta tesis fue evaluar en un molisol y un vertisol los mecanismos involucrados en la consolidación de la estructura y en el almacenaje de COS ante cambios en el nivel de intensificación y en la composición de la secuencia de cultivos. A través de diferentes escalas de evaluación (lotes de producción, ensayos de campo, incubaciones en laboratorio) se analizó el impacto del tiempo de ocupación con cobertura vegetal viva y el efecto de la calidad y frecuencia de adición de residuos sobre la dinámica de la agregación y el almacenaje de COS. En comparación con el vertisol, el molisol demostró una mayor dependencia de agentes orgánicos de la agregación para la formación de agregados. Además, la agregación y el COS almacenado en los macroagregados se asociaron negativamente con la frecuencia de soja en las secuencias. En ambos tipos de suelo, la adición más frecuente de residuos vegetales permitió mantener elevadas las tasas respiratorias y de agregación en comparación con una única adición de residuos en ensayos de laboratorio. A pesar del menor impacto de las secuencias de cultivos en el vertisol y a la elevada variación temporal en la agregación detectada en los suelos, mantener el suelo ocupado por prolongados períodos de tiempo favoreció el mayor aporte de biomasa, la agregación y las ganancias de COS en macroagregados en ambos tipos de suelo.

Salpicadura y escurrimiento en un suelo argiudol vértico y su interacción con el tamaño de agregados superficiales

p.239-244