Modulation of calcitonin amyloid formation by anionic lipid membranes

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2014

A acumulação in vivo de agregados proteicos insolúveis, genericamente designados por fibras amilóides, são o principal fenótipo de várias doenças graves categorizadas como patologias amilóides, onde se incluem a doença de Alzheimer, Parkinson e diabetes Mellitus tipo II. Estas doenças representam um problema de saúde alarmante a nível mundial pelo que há um interesse clínico urgente e significativo em compreender os factores que desencadeiam a formação destas estruturas para se poder desenvolver meios farmacológicos adequados que possam diminuir, ou atenuar, estas patologias. A maioria destas doenças são predominantemente esporádicas e resultam de problemas no folding de proteínas específicas que levam à sua agregação, e consequente formação de depósitos/placas, criando condições patológicas em determinados tecidos humanos. Deste modo, uma das chaves fundamentais para se perceber o desenvolvimento destas doenças reside no estudo dos mecanismos moleculares que levam ao misfolding e agregação destas proteínas in vitro. Estudos recentes mostraram que o estabelecimento de interacções lípido- péptido/proteína podem induzir um decréscimo na barreira de energia associada ao unfolding proteico, conduzindo à destabilização da estrutura nativa das proteínas/péptidos, e consequente misfolding. Com efeito, tem sido demonstrado que as membranas biológicas são capazes de promover a conversão de proteínas/péptidos em agregados tóxicos actuando como catalisadores do seu processo de fibrilhação, dependendo da composição lipídica da membrana (características estruturais dos seus lípidos componentes). No entanto, os mecanismos detalhados através dos quais a acumulação destes agregados compromete a integridade das membranas lipídicas ainda permanecem por esclarecer. Uma importante linha de investigação desenvolvida ao longo dos últimos anos no laboratório de acolhimento tem estado, precisamente, focada no estudo dos mecanismos que podem levar à formação de estruturas amilóides desencadeados pelo estabelecimento de interacções entre proteínas não amiloidogénicas e membranas carregadas negativamente, sob condições próximas das fisiológicas. O objectivo deste trabalho, que visou dar continuidade a este tópico, centrou-se no uso da calcitonina (CT) como polipéptido modelo para se estudar a capacidade das membranas lipídicas aniónicas em modularem a sua via de agregação em solução. Neste estudo foram empregues ambas as variantes humana (hCT) e de salmão (sCT) desta hormona polipeptídica. A CT é uma hormona com 32 resíduos de aminoácidos libertada pela glândula tiróide e que tem um papel importante no metabolismo do cálcio, sendo por isso administrada no tratamento da osteoporose e hipercalcemia. Nos últimos anos, a variante humana da calcitonina (hCT) tem sido cada vez menos utilizada neste tipo de tratamentos devido à sua tendência elevada em formar agregados que podem conduzir, eventualmente, à formação de depósitos de placas amilóides. Recentemente, a calcitonina de salmão (sCT) tem sido usada como uma alternativa clínica à hCT devido à sua maior potência farmacológica e menor tendência em sofrer agregação. Com efeito, a hCT é geralmente considerada um péptido amiloidogénico, o que a torna um modelo peptídico ideal para este tipo de estudo. Por outro lado, a sCT é útil devido ao facto de sua cinética de fibrilhação em solução ser muito mais lenta do que a da hCT permitindo, eventualmente, estudar em detalhe estados intermediários da cinética. Neste trabalho, os polipéptidos sCT e hCT foram utilizados quer na sua forma nativa (não derivatizada), quer conjugados com o fluoróforo HiLyte Fluor 488 (HL488) nos seus resíduos N-terminal (hCT-HL488 e sCT-HL488, respectivamente). A escolha desta posição de derivatização da CT visou minimizar a possibilidade de o fluoróforo conjugado interferir na formação de estruturas , já que é conhecido que esta envolve a sequência C-terminal destes polipéptidos (resíduos 25-32). Deste modo, através da realização de medidas de fluorescência em estado estacionário e resolvidas no tempo, com o fim de caracterizar as propriedades de emissão de fluorescência intrínsecas e extrínsecas destes polipéptidos, procurou-se obter informação sobre (i) o seu estado de agregação em solução, e (ii) sobre o modo como a sua interacção com lipossomas era condicionada pela sua composição lipídica, nomeadamente pelo seu conteúdo em fosfolípidos aniónicos. Os estudos de partição foram realizados utilizando-se vesículas unilamelares grandes (LUVs) como sistema modelo de membranas, preparadas com uma composição lipídica variável, nomeadamente misturas de 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), um fosfolípido zwitteriónico, com 0, 10, 20 ou 30 mol% de 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoserina (POPS), um fosfolípido aniónico. Este tipo de vesiculas têm sido maioritariamente usadas para estudar interacções de péptidos com as membranas devido ao seu tamanho adequado (100 nm) e grau de curvatura, por comparação com outros sistemas vesiculares como, por exemplo, as vesículas unilamelares pequenas (SUVs) e gigantes (GUVs). Numa primeira fase do trabalho, explorou-se a fluorescência intrínseca da sCT e hCT devida à presença de um resíduo de tirosina na estrutura primária de cada uma destas formas de calcitonina (Tyr22 e Tyr12, respectivamente). Foi realizada uma caracterização espectroscópica sumária das suas propriedades de emissão de fluorescência em solução tampão e efectuou-se ainda um estudo da sua partição para LUVs de POPC contendo 20 mol% de POPS através da monitorização da sua anisotropia de fluorescência em estado estacionário. Após se ter minimizado experimentalmente o impacto da dispersão da radiação (scattering) causada pelas suspensões de lipossomas no valor deste parâmetro, recuperou-se um valor de

Recent studies have suggested that biological membranes can stimulate the pathological conversion of amyloidogenic proteins/peptides into toxic aggregates by providing a soft surface that can promote their misfolding and self-assembly. These interactions can be controlled by a range of biophysical features arising from the specific lipid composition of the membrane. In this work, both salmon and human calcitonins (sCT and hCT) were used as model polypeptides to study the role that negatively-charged lipid membranes can play in modulating their aggregation pathway. Specifically, a multi-parametric study based on steady-state and time-resolved fluorescence intensity and anisotropy measurements was carried out to study the interaction of both unlabelled and HiLyte Fluor 488-labelled sCT and hCT polypeptides (sCT-HL488 and hCT-HL488, respectively) with liposomes prepared with a variable anionic lipid content. The influence of a small set of solvents, namely several aliphatic and fluoro alcohols, on the photophysical properties of both the free HL488 dye and both HL488-labeled CT variants was first characterized. The changes in the fluorescence intensity decay kinetics displayed by the fluorescently-labelled peptides with the solvent used were assigned to an intramolecular photon-induced electron transfer mechanism dependent on the conformational dynamics of the polypeptide chain. In the second part of this work, the interaction of sCT-HL488 with lipid membranes was found to be critically dependent on the method used to prepare the samples (direct injection vs solvent evaporation). CT binding to liposomes was also established to be dominantly driven by electrostatic interactions. Furthermore, a coupled partition/oligomerization model was used to describe the biphasic fluorescence intensity data obtained when high sCT-HL488 concentrations were used in the partition studies. The excitonic band detected in the absorption spectra of sCT-HL488 at a high P/L molar ratio (low phospholipid concentrations) revealed the formation of parallel (H-type) dimers between the HL488 chromophores covalently linked to sCT, which were non-fluorescent.