Molecular bases of classic galactosemia : searching for new therapeutic strategies

Tese de doutoramento, Farmácia (Biologia Celular e Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2014

Classic galactosemia is a potentially lethal disease of the galactose metabolism caused by a severe deficiency of GALT, the second enzyme of the Leloir pathway. This disorder is associated with mutations in the GALT gene, and displays an autosomal recessive pattern of inheritance. Although apparently asymptomatic at birth, affected infants start developing escalating symptoms after 1 to 2 weeks of galactose ingestion due to milk feeding. Upon implementation of a galactose-restricted diet, infants show rapid clinical improvement and seem to be almost miraculously cured; however, the long-term outcome is often disappointing, as most patients go on to develop severe complications notwithstanding strict compliance with the dietary therapy. Despite decades of intensive research, classic galactosemia pathophysiology is still largely unknown, resulting in a limited and poorly effective therapy. A comprehensive understanding of the molecular mechanisms underlying classic galactosemia potentially opens new therapeutic avenues, and prompted us to develop the present work. The first part of this thesis (chapter 1) comprises a general introduction with a review of the literature concerning the molecular and biochemical basis of classic galactosemia, followed by an overview of the current therapeutic approaches in genetic disorders – with a special focus on inherited metabolic disorders – and finally the objectives of the present work. Our studies initiated with the molecular characterization of all patients currently followed by the Portuguese metabolic centers (chapter 2). The rationale for this study was the previous description that GALT genotype represents a valuable prognostic tool for the outcome of galactosemic patients. Accordingly, after genotyping 42 Portuguese galactosemic patients, we searched for genotype-phenotype correlations by a 3-fold evaluation. Firstly, we employed in silico strategies to assess the structural-functional impact of previously uncharacterized mutations; secondly, we evaluated the biochemical phenotype at both the metabolite and enzymatic levels, represented by Gal-1-P values and GALT activity in erythrocytes; and finally, evaluated the resulting clinical outcome. Establishment of correlations between genotype and biochemical or clinical phenotypes, however, was poorly attained, reiterating the complexity of this disease and emphasizing the idea that other modifiers – possibly genetic, epigenetic and environmental – contribute to the pathophysiology of classic galactosemia. The update of the Portuguese GALT mutational spectrum revealed the intronic mutation c.820+13A>G (IVS8+13A>G) as the second most prevalent variation, strongly suggesting its pathogenicity, which set the basis for the study described in chapter 3. We functionally characterized the c.820+13A>G variation by ex vivo and in vivo analyses, which were in full agreement with the previous in silico predictions. Indeed, we confirmed this variation is a disease-causing mutation, whose mechanism of action involves the activation of a cryptic donor site, which, in turn, induces an aberrant splicing of the GALT pre-mRNA, thus causing a frameshift with inclusion of a premature stop codon. Structural-functional studies of the recombinant truncated GALT showed it was devoid of enzymatic activity and prone to aggregation. Finally, antisense oligonucleotides were designed to specifically recognize the mutation, and successfully restored the constitutive splicing. Molecular studies in several inherited metabolic disorders have led to the realization that only a minor part of the mutations directly disrupt functional sites of the proteins. Accordingly, in chapter 4, we described the structural and functional characterization of the most prevalent mutations in the GALT gene – p.Q188R, p.S135L, p.K285N and p.N314D – and of other five clinically relevant mutations – p.R148Q, p.G175D, p.P185S, p.R231C and p.R231H. Interestingly, the analyzed mutations did not affect the global conformational stability of the GALT enzyme; rather, most mutations, notwithstanding their impact on the enzyme functionality, increased the propensity for aggregation, which at the cellular level reflects in a decrease of the enzyme’s effective concentration. These results are in agreement with previous studies in classic galactosemia models, and suggest that GALT aggregation might be a major pathogenic mechanism underlying this disorder. Previous studies have reported a yeast galactosemia model allowing the evaluation of human GALT mutations severity, by assaying the sensitivity of transformed yeast cultures to galactose addition to the medium. Thus, in chapter 5, we developed a prokaryotic model of galactose sensitivity to evaluate the ability of the above referred human GALT mutants in alleviating the galactose-induced toxicity. This model presents the inherent advantage of being assayed in vivo, thus providing valuable insights on mutations’ impact on human GALT function. Additionally, arginine ability to ameliorate the galactose-induced toxicity was also evaluated for each human GALT mutant. The rationale for this approach was, not only the long-recognized anti-aggregation properties of arginine, but also its important therapeutic effect described in previous studies. In effect, arginine appears to exert a mutation-specific mode of action, alleviating the galactose toxicity in the p.Q188R, p.K285N, and p.G175D mutants, which suggests that might be of some benefit in classic galactosemia. Nonetheless, further studies are underway to ascertain arginine’s potential therapeutic effect in this inherited disorder of the galactose metabolism. Chapter 6 presents a general discussion and major conclusions disclosed by this work, framing them in the current state of the art, proving also some perspectives for future studies. Taken together, our results provide important insights on classic galactosemia, namely by shedding light on the underlying pathogenic molecular mechanisms, thus contributing for a better understanding of this enigmatic disorder. Finally, and importantly, these studies paved the way to the search, development and improvement of novel and alternative therapeutic strategies, so needed to overcome the overwhelming and burdensome long-term complications presented by most classic galactosemic patients.

Após a sua internalização celular, a galactose é rapidamente metabolizada a glucose-1- fosfato pela acção sequencial de três enzimas: galactocinase (GALK), galactose-1-fosfato uridililtransferase (GALT) e uridina difosfogalactose 4’-epimerase (GALE). Estas enzimas permitem, respectivamente, a fosforilação da galactose em galactose-1-fosfato (GALK), a conversão de galactose-1-fosfato e uridina difosfoglucose em glucose-1-fosfato e uridina difosfogalactose (GALT), e a interconversão de uridina difosfoglucose em uridina difosfogalactose (GALE). Estas enzimas constituem a via de Leloir e, apesar de o fígado ser o principal órgão envolvido no metabolismo da galactose, encontram-se na maioria das células e dos tecidos. Uma deficiência enzimática em qualquer uma das três enzimas da via de Leloir resulta numa diminuição ou ausência de capacidade de metabolizar a galactose e, consequentemente, conduz à sua acumulação no sangue – hipergalactosémia. A Galactosémia Clássica (OMIM #230400), a forma mais comum de hipergalactosémia primária, é uma doença genética de transmissão autossómica recessiva, que afecta 1 em cada 30.000 a 60.000 nados-vivos, apresentando uma prevalência variável entre populações, nomeadamente na Irlanda e Turquia onde atinge valores de 1/23.500 - 1/23.775 e no Japão onde a sua prevalência atinge o valor mais baixo (1/1.000.000). A ausência ou diminuição de actividade da GALT é causada por mutações no gene GALT, e encontram-se descritas mais de 250 variações, reflectindo a elevada heterogeneidade alélica desta doença metabólica. Para além disso, a maioria dos doentes são heterozigóticos compostos, um dos factores determinantes da ampla variabilidade fenotípica observada. Aquando do nascimento, a criança aparenta ser assintomática. Os sintomas tornam-se evidentes após o início da ingestão de leite, e consistem inicialmente em dificuldades alimentares e de desenvolvimento, vómitos, diarreia, letargia e hipotonia, podendo evoluir para cataratas e septicémia, e eventualmente conduzir à morte. Após implementação de uma dieta restrita em galactose – o tratamento padrão – as crianças mostram notáveis melhorias em apenas 24 horas, e em apenas uma a duas semanas as disfunções hepática e renal desaparecem completamente. Esta resposta dramática à terapia dietética levou ao conceito da Galactosémia Clássica como uma doença relativamente benigna e fácil de tratar. No entanto, os doentes com Galactosémia Clássica desenvolvem complicações a longo prazo e a diversos níveis, como neurológico e psiconeurológico, crescimento e densidade óssea, e disfunção ovárica nas mulheres, os quais parecem ser independentes de um diagnóstico precoce e de uma adesão do doente à terapia. Apesar de a primeira descrição datar de 1908, a Galactosémia Clássica continua a ser um enigma, quer ao nível do conhecimento aprofundado da sua fisiopatologia, quer ao nível do desenvolvimento de alternativas terapêuticas que permitam, sobretudo, mitigar as complicações a longo prazo. O presente trabalho pretende, assim, contribuir para a elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes à patogénese das mutações GALT prevalentes na população galactosémica Portuguesa, assim como explorar novas estratégias terapêuticas direccionadas para cada tipo específico de mutação. O primeiro capítulo da tese apresenta uma revisão geral da literatura sobre vários aspectos relacionados com a Galactosémia Clássica: as bases bioquímicas e moleculares, a fisiopatologia e as actuais abordagens terapêuticas. Em seguida, descrevem-se em pormenor os mecanismos moleculares subjacentes à maioria das mutações que originam Erros Hereditários do Metabolismo (onde se inclui a Galactosémia Clássica) e que causam perca de função, nomeadamente as mutações missense e as que afectam o splicing, mecanismos esses que condicionam as novas terapias desenhadas de acordo com o tipo de mutação. Por fim, são descritos os objectivos delineados para o presente trabalho. O trabalho experimental teve início com a caracterização molecular de todos os doentes actualmente seguidos nos centros metabólicos nacionais de Lisboa, Porto e Coimbra, sendo o objectivo final averiguar se, como sugerido na literatura, o genótipo GALT pode ter um valor prognóstico sobre a evolução fenotípica dos doentes galactosémicos (capítulo 2). Os dados obtidos permitiram estabelecer o espectro mutacional da Galactosémia Clássica em Portugal e compará-lo com o de outras populações. O estudo de 42 doentes revelou a presença de 14 substituições nucleotídicas, sendo 10 missense, 2 nonsense e 2 de splicing. Identificaram-se 16 genótipos diferentes, mas metade dos doentes são homozigóticos para p.Q188R, a mutação prevalente não só em Portugal como a nível mundial. Surpreendentemente, a segunda mutação mais frequente é uma mutação de splicing, descrita até então como benigna. Em seguida, e recorrendo a programas bioinformáticos adequados, procedeu-se à análise da potencial patogenicidade das mutações ainda não caracterizadas na literatura. Os resultados sugeriram que a maioria destas mutações missense afectará a estabilidade e a funcionalidade da proteína mutada, enquanto que a mutação de splicing mais frequente deverá induzir um mecanismo de splicing alternativo. Por fim, este estudo revelou, na maioria dos casos, a ausência de uma correlação clara entre a gravidade das mutações prevista pela análise in silico e o fenótipo bioquímico dos doentes, determinado pelos níveis eritrocitários de galactose-1-fosfato, assim como com o fenótipo clínico e a evolução desfavorável manifestada pelos doentes. No entanto, tal resultado não surpreende dado a Galactosémia Clássica, apesar de ser uma doença monogénica, não originar fenótipos claros. Este facto prende-se com a falta de informação estrutural sobre os componentes enzimáticos da via de Leloir, colocando-se a hipótese de uma alteração na GALT poder afectar toda a via metabólica. Por outro lado, os metabolitos da galactose estão envolvidos em diversas reacções fisiológicas, nomeadamente as de glicosilação que se reflectem aos mais variados níveis. Finalmente, a influência de outros genes modificadores, de alterações epigenéticas e de factores ambientais também não pode ser ignorada. Os capítulos seguintes são dedicados ao estudo dos mecanismos moleculares subjacentes às mutações prevalentes na população Portuguesa e ao desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas. No capítulo 3 descreve-se o estudo da mutação de splicing IVS8+13A>G, até então considerada como benigna, mas que revelou ser a segunda mais frequente na nossa população galactosémica. A caracterização funcional do mecanismo patogénico foi efectuada por transfeção de um minigene contendo a sequência mutada em duas linhas diferentes de células eucarióticas. A análise dos produtos de transcrição revelou que a mutação activa um sítio críptico de splicing, causando um splicing anómalo do pré-mRNA GALT, o qual induz um frameshift com inclusão de um codão de terminação prematuro (p.D274GfsX291). Por outro lado, dado ter-se observado a presença do mensageiro mutado nas amostras biológicas dos doentes portadores desta mutação, colocou-se a hipótese de a proteína truncada ser produzida in vivo, o que levou à produção da proteína recombinante. Os estudos estruturais e funcionais subsequentes revelaram que esta proteína é propensa à formação de agregados e é destituída de actividade enzimática. Finalmente, e utilizando oligonucleótidos antisense que hibridam especificamente com o local da mutação, impedindo assim a ligação do spliceossoma e forçando a sua ligação ao sítio canónico dador de splicing, foi possível corrigir o splicing alternativo induzido pela mutação e obter o mensageiro selvagem. Estas experiências constituíram a prova de conceito sobre a aplicabilidade da terapia antisense como alternativa estratégica para a claramente insuficiente dieta restrita em galactose. ! O espectro mutacional da maioria dos erros hereditários do metabolismo é dominado por mutações do tipo missense. O capítulo 4 aborda a caracterização estrutural e funcional das quatro variantes GALT prevalentes a nível mundial, assim como outras cinco variantes com relevância clínica, nomeadamente na população galactosémica Portuguesa. Diversas metodologias foram empregues para determinação da actividade enzimática e do perfil de inactivação térmica, bem como métodos biofísicos para avaliação das estruturas secundária, terciária e quaternária das proteínas mutadas. Os resultados revelaram que as mutações pontuais não afectam nenhuma das estruturas acima mencionadas, mas sim a propensão para uma agregação precoce destas variantes. Este resultado constitui na realidade a principal novidade, dado que um estudo recente postulou que algumas mutações no gene GALT afectam o correcto folding das proteínas mutadas. Esta conclusão é extremamente relevante na medida em que, para além da diminuição da actividade uridililtransferásica, a acumulação de agregados proteicos interfere com a homeostase celular. Efectivamente, diversos estudos relataram a presença, em doentes galactosémicos, do aumento de actividade dos sistemas ligados ao stress do retículo endoplasmático e da unfolded protein response, assim como de níveis elevados de stress oxidativo, fenómenos característico de uma proteotoxicidade. Estes dados levam-nos então a colocar como potencial e nova hipótese terapêutica a utilização de moduladores da proteostase, os quais prolongam a semi-vida celular das variantes GALT, compensando assim parcialmente a diminuição de actividade enzimática e simultaneamente prevenindo a acumulação de agregados proteicos. No capítulo 5 desenvolvemos um modelo procariótico de sensibilidade à galactose que permitisse avaliar, não só o impacto causado pelas diversas mutações missense, mas também o efeito de compostos com potencial acção terapêutica. Utilizámos uma estirpe de E. coli com o gene galT endógeno deletado, de modo que toda a actividade GALT detectada é proveniente do mutante nela transformado. Os resultados, embora ainda preliminares, confirmaram a validade do modelo delineado e permitiram obter dados a dois níveis. Por um lado, replicámos in vivo os resultados previamente obtidos in vitro quanto à capacidade de aliviar a toxicidade induzida pela galactose, por comparação com a enzima selvagem. Por outro lado, e muito relevante, verificámos que o modelo é válido para testar moléculas com potencial terapêutico. Efectivamente, algumas destas enzimas mutadas revelaram-se sensíveis à arginina, um composto amplamente reconhecido como estabilizador de proteínas e anti-agregante, aliviando desse modo a toxicidade da galactose para a bactéria. A presente tese termina com o capítulo 6 no qual se apresenta uma discussão dos resultados obtidos, incluindo uma análise integrada de todo o trabalho e respectivas conclusões, bem como algumas perspectivas de trabalho futuro. Em suma, este trabalho contribuiu para um melhor conhecimento da Galactosémia Clássica em Portugal e para a elucidação dos mecanismos patogénicos subjacentes às mutações prevalentes, bem como para a descoberta e desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas, tão necessárias para minorar as graves sequelas que a maioria dos doentes galactosémicos apresenta a longo termo.

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