树突状细胞体外分化成熟的时程、mi/mRNA 表达谱分析和共生菌影响的研究

树突状细胞（dendritic cells, DC）作为机体天然免疫和获得性免疫反应的桥梁和枢纽，发挥着重要的启动和调控作用。随着体外诱导方法的建立和生物学技术的进步，有关DC 的基础生物学研究得到了快速的发展，在诱导方法、个体发生及基因表达和调控等方面，涌现出很多新的、未解的关键问题。同时，随着对粘膜免疫机理研究的深入，DC 在粘膜生态环境中的功能和影响，渐已成为免疫学研究前沿领域中的热点和要点。在本研究中，为了确定DC 体外分化成熟的最短时程，同时为了研究DC 分化成熟相关的基因表达调控，我们建立了快速的DC 体外诱导方法，分析了体外快速诱导 DC 的mi/mRNA 表达谱。此外，在原始分离的女性生殖道共生乳酸杆菌的基础上，以THP-1作为DC 前体细胞的细胞系模型，开展了女性生殖道共生乳酸杆菌刺激活化 THP-1 的研究，希望能够为乳酸杆菌作为生殖道粘膜免疫疫苗的应用提供理论基础。首先，采用外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）来源的CD14+细胞为DC 前体，经过GM-CSF 和IL-4 的刺激，1-6 天后得到未成熟DC （immature dendritic cells, iDC），并经成熟因子（TNF-α, IL-1β, IL-6 与PGE2）诱导 1-2 天后，获得成熟DC（mature dendritic cells, mDC）。经过比较和分析，明确了完全分化和成熟各2 天，即“2+2”，为DC 诱导分化的最佳和最短时程，从而证实和建立了DC 体外快速诱导的体系和方法。该方法获得的iDC 与mDC，具有与传统的“6+2” 方法获得的DC 相同的形态与表型，而且，利用该方法获得的DC 总数高于“1+1”， “1+2”与“6+2”的方法，为DC 的生物学研究提供了基础数据。我们进而采用芯片技术，对体外快速分化成熟的DC 进行了mi/mRNA 表达谱分析，确定了DC 不同分化发育阶段特征性的mi/mRNA 表达差异。结果发现，与CD14+ 单核细胞即DC 前体相比，iDC 与mDC 之间具有更加相近的mi/mRNA 表达方式。 miRNA 表达谱分析则表明，不同的miRNA 表达与DC 的不同分化和发育阶段相关。而且，位于同一基因簇内的miRNA，呈现协同表达的情况。特别值得注意的是，本研究发现了在DC 的某些发育阶段特异表达的miRNA，它们在DC 发育过程中的功能，还未得到诠释，它们在DC 某些分化阶段的特异表达，提示了DC 各分化阶段的相关性与特异性。结合mRNA 表达谱分析，我们发现miRNA 的表达与其目的基因的表达在mRNA 水平呈现负相关的特性。同时，免疫相关mRNA 与miRNA 在DC 体外不同发育阶段的表达亦呈现差异，其中，miRNA（如hsa-miR-181a, hsa-miR-223, hsa-miR-155, hsa-miR-146, hsa-miR-106a 与hsa-miR-20a 等）与mRNA（如ALM1 等）参与了特定的与免疫相关的GO（Gene Ontology）与通路（Pathway），提示这些miRNA 与mRNA 可能通过不同的方式调节控制着DC 的体外诱导过程。在有关粘膜生态环境中DC 的分化、成熟及其功能影响的研究中，我们首先通过各种乳酸杆菌鉴定方法的综合应用，确定了6 种原始分离的女性生殖道主要共生乳酸杆菌：发酵乳酸杆菌（L.Fermentum）、约氏乳酸杆菌（L.Johnsonni）、卷曲乳酸杆菌（L.Crispatus）、革氏乳酸杆菌（L.Gasseri）、詹氏乳酸杆菌（L.Jensenii）与德氏乳酸杆菌（L.Delbrueckii ）。其中，德氏乳酸杆菌（L.Delbrueckii）和发酵乳酸杆菌（L.Fermentum）具有较高的产H2O2 的能力。在此基础上，我们在与THP-1 的共同培养体系中，将乳酸杆菌对DC 前体的作用和影响进行了比较和研究。结果发现，L.Crispatus 在分离的各原始菌株中，具有最强的刺激THP-1 活化的能力，而且，在相同刺激比例下，L.Crispatus 活菌具有比死菌更强的免疫刺激能力，表现为明显上调THP-1 细胞表面标志CD40、CD80、CD86、 CD1a、CCR6 与CD324 的表达水平，同时可诱导活化THP-1 上调表达Th1 型细胞因子。通过FITC-Dextran 吞噬实验，我们发现，经过L.Crispatus 刺激的THP-1 细胞，其吞噬外来抗原的能力明显下降，但尚未检测到经过活化的THP-1 细胞刺激T 细胞增殖的能力。通过流式细胞术分析的方法，我们检测了TLR1、TLR2、TLR4 与TLR6 在不同的刺激分化阶段的表达水平，结果表明，THP-1 主要通过TLR2 与TLR6 识别女性生殖道L.Crispatus。综上所述，本研究首先通过对DC 体外分化成熟的最短时程的分析，确立了快速诱导DC 的最佳方法，进而利用芯片技术，研究了快速诱导DC 的mi/mRNA 表达谱，揭示了DC 体外分化发育过程中可能的调控途径，为进一步研究DC 的基础生物学提供了恰当的模型和具有指向性的线索。同时，通过与DC 前体THP-1 的共同培养体系，证实了生殖道共生乳酸杆菌的免疫调节作用，为以乳酸杆菌为载体的生殖道粘膜免疫疫苗的研究和应用提供了实验依据

云南中部无量山大寨子黑长臂猿（Nomascus concolorjingdongensis）生态与行为研究

从2003年3月到2006年5月期间，在云南中部无量山大寨子（24°21′N, 100°42′E）对一个黑长臂猿种群进行了研究。2003年3月至2004年3月主要研究了 3个群体的鸣叫行为。2005年3月一个群体被习惯化，随后对其进行了14个月的连 续观察。在此期间，主要对食性、时间分配、栖息地选择和利用、过夜地及过夜 树的选择等方面进行了研究。这些资料将有助于了解黑长臂猿对其高海拔、高纬 度、季节性变化明显栖息地的适应性，并且对了解长臂猿独特的社会结构具有重 要意义。另外，本研究结合获得的行为生态方面的数据，通过漩涡模型（VORTEX） 对该种群未来动态进行了模拟，对大寨子种群的保护和发展提出了保护建议。 黑长臂猿叫声在所有长臂猿中频率最高。成年雄性能发出boom、简单重复 音节和调节音节；成年雌性只能发出成功的激动鸣叫和失败的激动鸣叫。两者互 相配合组成结构复杂的二重唱，配对个体很少单独鸣叫，青年个体经常会加入二 重唱。同一群内两个成年雌性多数时候一起鸣叫。配对个体平均两天鸣叫一次 （53%），每次鸣叫平均持续时间12.9 分钟，雌性激动鸣叫4.6 次，激动鸣叫的 平均时间间隔为115 秒，91.5%的鸣叫发生在日出前半小时和日出后3 小时之间。 通过对相邻群体间鸣叫行为的分析，结果发现相邻群体倾向于不在同一天鸣叫， 如果同一天鸣叫，鸣叫的时间间隔显著长于不在同一天鸣叫的时间间隔，这些结 果不支持鸣叫具有调节群体空间距离的功能（inter-group spacing）的假说。雄性 倾向选择一个区域内最高的树进行鸣叫，这可能是为了声音的远距离传播。另外 雄性对鸣叫树的选择也兼顾了安全因素。通过比较鸣叫前后个体间的距离，黑长 臂猿的鸣叫具有群内通讯的功能，鸣叫后个体间的距离显著短于鸣叫前的距离。 虽然鸣叫树的分布与食物斑块的分布在不同海拔段和不同网格内都呈现出了高 度的相关性，但不能确定黑长臂猿在食物斑块附近进行鸣叫就是为了对食物资源 进行防御。 利用扫描法对研究群体的食性和时间分配进行了研究。结果显示研究群体共 取食77 种植物和至少6 种动物，其中10 种重要食物占到取食比例的76.7%。在 10396 次确定食物类别的记录中，除无花果外的其它果实占25.5%，藤子叶和芽占21.0%，树叶和芽占19.2%，无花果占18.6%，花占9.1%，寄生植物的叶占6.3%， 另外其它食物占0.3%。黑长臂猿的食性具有明显的日变化和季节性变化。与其 它长臂猿相比，黑长臂猿的食性更加广泛。虽然黑长臂猿进食叶（藤子的叶和芽、 树叶和芽、寄生植物的叶）的比例稍多于进食果实（无花果和其它果实）的比例， 但当果实丰富时，它们仍然优先选择果实。 黑长臂猿平均在日出后33 分钟离开过夜树，在日落前128 分钟进入过夜树， 平均每天活动518 分钟。活动期间，黑长臂猿用于休息的时间最多，达到40.0%， 其次是取食28.7%，排在第三的是移动19.8%，排在第四的是觅食占到6.1%，鸣 叫占2.6%，玩耍和其它活动一共占活动时间的2.8%。时间分配具有明显的日变 化和季节性变化。食物和温度因素是影响黑长臂猿时间分配季节性变化的最主要 的原因。 群体一共利用129 个1 公顷的网格，如果包含在活动路线内的空隙，活动范 围达到151 公顷，主要由3 个大的山沟组成。黑长臂猿平均每天移动1391 米， 进入9 个网格，连续两天倾向于利用家域中的同一条山沟。群体平均每月仅利用 家域的19%~50%，集中利用家域中的小部分区域，除2 月份外群体总是选择利 用原始常绿阔叶林。形成这种现象的原因主要与食物的分布及其季节性变化有 关、并且与该群生活地区的地形有关。 黑长臂猿喜欢选择高大的，生长在陡坡上的树过夜，群体一般形成4 个不同 的小单元过夜（青年个体与成年雄性睡在一起，两个成年雌性与未独立的婴猿分 别睡在一起，亚成年雄性单独过夜），过夜时总是快速进入过夜树，然后立即安 静下来，利用很多棵不同的过夜树，并且间隔很长时间后才重复利用，这些行为 都是为了避免被捕食者发现和攻击。群体喜欢在山坡上过夜，并且在冬天喜欢选 择在长有寄生植物的大树枝上过夜，这些行为可能与研究地点冬天的低气温有 关。此外，过夜树的选择可能兼顾舒适和方便寻找食物的功能。 通过获得的生态学资料，结合近缘种生态学参数，利用漩涡模型（VORTEX） 对该种群未来动态进行了模拟。结果显示：大寨子亚种群是一个具有很强的潜在 繁殖力的种群，如果没有偷猎，亚种群在100a 之内不会灭绝，并且能迅速达到 环境容纳量。但是每年如果有1 只成年雄性和1 只成年雌性被猎杀，该种群将会在第78a 灭绝，且灭绝概率为100%。不同程度的死亡率对种群影响不大，但高 死亡率显著延缓了种群到达环境容纳量的时间。环境容纳量对种群遗传多样性损 失具有重要的影响，在没有猎杀的情况下，种群的长期存活需要一个较大的环境 容纳量。因此，在黑长臂猿受到严格保护、且栖息地主要在保护区内的今天，严 密监控火灾的发生，限制牲畜进入林区等人为干扰的影响，保护好黑长臂猿栖息 地是首要工作之一。但如果能使其栖息地周围的森林植被得到恢复，增加其栖息 范围，将有利于该地区黑长臂猿的发展。

黑颈鹤 Grus nigricollis 东部种群的生态及迁徙研究

2003 年3 月到2006 年3 月，我们对世界上了解最少的鹤类，也是唯一一种越冬和繁 殖都在高原湿地内进行的鹤类——黑颈鹤(Grus nigrcollis)东部种群的野外繁殖生态、越冬 生态和迁徙路线等方面作了重点研究。研究时间分为三个阶段：2003 年3 月到2005 年6 月，在黑颈鹤的繁殖地点四川省若尔盖湿地国家级自然保护区内(102°29′－102°59′E, 33°25′－34°00′N)进行，对在若尔盖湿地内繁殖和度夏黑颈鹤的种群现状，繁殖习 性，繁殖季节黑颈鹤栖息地选择利用及牛羊放牧活动对黑颈鹤栖息地利用的影响，繁殖黑 颈鹤鸟巢及筑巢栖息地选择的特点等内容进行了研究；第二阶段从2004 年10 月到2006 年3 月，在黑颈鹤东部种群重要的越冬地云南省大山包黑颈鹤国家级自然保护区内 (103o14’55”—103o18’38”E, 27º18’38”—27o28’42”N)进行，对越冬黑颈鹤的越冬习性，栖息 地选择利用，白昼时间行为分配进行了研究；第三阶段2005 年2 月－3 月、2006 年3 月，在云南省大山包保护区和贵州省草海黑颈鹤国家级自然保护区，给8 只黑颈鹤佩戴卫 星发射器，第一次在中国利用卫星技术来跟踪候鸟的迁徙，对东部黑颈鹤越冬种群的迁徙 路线进行求证和新的探索，并利用卫星数据进行黑颈鹤在繁殖地和越冬地活动特点的分 析。 在2004 年5 月围绕整个若尔盖湿地自然保护区内和周边地区繁殖和度夏黑颈鹤的现 状调查中，共统计到黑颈鹤320 只和巢6 个，112 只黑颈鹤(35%)和5 个鸟巢分布在保护 区内，主要集中在保护区内水域和沼泽面积较大的两块核心区内，208 只黑颈鹤(65%)和1 个鸟巢分布在保护区外，主要分布在黄河、白河沿线地区，其中在白河和黄河交界的地 区，记录有163 只黑颈鹤；本次调查中，黑颈鹤利用最多的是在黄河和白河交界处的农 地，其次是沼泽和河岸地带，最少的是草甸和退化草甸；不论是在保护区内还是在保护区 外，湿地生境都体现了黑颈鹤在栖息地选择时的重要性；在花湖繁殖地，黑颈鹤繁殖种群 和巢在3 年内呈现下降和减少的趋势，湿地面积的缩小和退化可能是主要的原因。 繁殖习性：根据繁殖期间产卵，幼鹤出壳等事件行为发生的时间将整个繁殖季节划分 为繁殖前期(到达之日到5 月12 日)，繁殖中期(5 月13 日到6 月18 日)和繁殖后期(6 月19 日到离开)。黑颈鹤3 月下旬即从越冬地返回繁殖地点花湖，首先到达的是带有幼鹤的繁 殖家庭鹤，之后才是集群鹤，这种返回的过程持续到5 月初。在繁殖前期，黑颈鹤种群数 量经历一个增加的过程，在此期间，花湖的黑颈鹤种群数量较低(27)，繁殖黑颈鹤先后经历家庭解体 (Family breakup)，建立繁殖领域，完成交配，筑巢等行为，进入繁殖中期 后，花湖的黑颈鹤种群数量整体呈现下降趋势，并在6 月的第一周达到最低，繁殖中期黑 颈鹤的种群比前期稍高(29)，与繁殖相关的行为在整个繁殖季节达到最高(51%)，进入繁 殖后期，随着幼鹤出壳和成鹤维持领域能力的降低，花湖周围的黑颈鹤种群数量再次增 加，并在以后的2 个月内维持在较高的数量(56)，到9 月中旬，黑颈鹤开始迁徙，4 周 后，所有的鹤都离开繁殖地花湖。在繁殖期间，被驱逐出领域的幼鹤与非繁殖的成鹤形成 集群在繁殖地周围游荡，集群在各个时期都存在，只是在繁殖前期最多(2 群/周)，繁殖中 期和繁殖后期为1 群/周，群内个体数量在繁殖中期最高(26 只/群)，在繁殖前期和中期分 别是6 和8 只/群，不同时期的群体和群体规模都存在显著差异；黑颈鹤的交配发起者是 雌鹤，交配的成功率为60%，雄鹤的无应答和不成熟的交配经验是交配失败的主要原 因，80%的交配发生在上午，交配成功率为58.3%，20%的交配发生在下午，成功率为 66.7%，黑颈鹤的交配主要发生在4 月到5 月上旬之间，66.7%的交配发生在这一时期， 成功率为80%，之后到6 月上旬的交配仅有33.3%，成功率仅有20%，随着时间的推移， 交配的成功率降低(从4 月的100%减少到5 月份的45%和6 月份的0)；黑颈鹤的窝卵数是 2 枚，卵重207 克，卵长径和短径分别是107 和58 毫米，孵卵期为31 天，幼鹤的出壳率 为100%，但二个月后的死亡率达到31.2%，之后的幼鹤未观察到死亡，幼鹤出壳后两个 月内的死亡率可能是制约种群增长的一个原因；繁殖期间黑颈鹤食物以蕨麻(Potentilla anserina)、荸荠(Heleocharis dulcis)、委陵菜属(Comarum)、草地早熟禾(Poa pratensis)、眼 子菜属(Potamageton)、蒲公英(Taraxacum mongolicum)等植物的花、果、茎等为主，但也 取食包括无脊椎动物如蝗虫(Chorthippus hsiai)，粪金龟(Geotrupes sp.)，椭圆萝卜螺(Radix swinboi)和耳萝卜螺(Radix ouricuaria)，以及脊椎动物黑唇鼠兔(Ochotona curizoniae)、红 脚鹬(Tringa totanus)、黑水鸡(Callinula chloropus)、小..(Tachgbaptus ruficollis)、黄河裸 鲤(Gymnocypris pylzovi)等，取食动物性食物可能是补充繁殖所耗费的巨大能量和为迁徙 储备能量；繁殖季节黑颈鹤的主要时间分配在取食和繁殖上，分别占45%和28%，其余 依次为运动10%、护理9%、警戒6%、静息1%和其它1%，不同的繁殖阶段，除了运动 和其它行为外，其余各种行为的时间分配存在显著差异，各行为频次以警戒最高(43 次/小 时)，其余依次为取食(31 次/小时)、护理(17 次/小时)、运动(11 次/小时)、繁殖(5 次/小 时)、其它(1 次/小时)和静息(1 次/小时)，除了其它行为外，各繁殖阶段行为发生频次差异 显著，各行为的持续时间以繁殖最多(189 秒/次)，其次为取食(53 秒/次)、静息(50 秒/次)、 运动(33 秒/次)、其它(22 秒/次)和护理(19 秒/次)，在一天中，黑颈鹤各行为分配随时间的历家庭解体 (Family breakup)，建立繁殖领域，完成交配，筑巢等行为，进入繁殖中期 后，花湖的黑颈鹤种群数量整体呈现下降趋势，并在6 月的第一周达到最低，繁殖中期黑 颈鹤的种群比前期稍高(29)，与繁殖相关的行为在整个繁殖季节达到最高(51%)，进入繁 殖后期，随着幼鹤出壳和成鹤维持领域能力的降低，花湖周围的黑颈鹤种群数量再次增 加，并在以后的2 个月内维持在较高的数量(56)，到9 月中旬，黑颈鹤开始迁徙，4 周 后，所有的鹤都离开繁殖地花湖。在繁殖期间，被驱逐出领域的幼鹤与非繁殖的成鹤形成 集群在繁殖地周围游荡，集群在各个时期都存在，只是在繁殖前期最多(2 群/周)，繁殖中 期和繁殖后期为1 群/周，群内个体数量在繁殖中期最高(26 只/群)，在繁殖前期和中期分 别是6 和8 只/群，不同时期的群体和群体规模都存在显著差异；黑颈鹤的交配发起者是 雌鹤，交配的成功率为60%，雄鹤的无应答和不成熟的交配经验是交配失败的主要原 因，80%的交配发生在上午，交配成功率为58.3%，20%的交配发生在下午，成功率为 66.7%，黑颈鹤的交配主要发生在4 月到5 月上旬之间，66.7%的交配发生在这一时期， 成功率为80%，之后到6 月上旬的交配仅有33.3%，成功率仅有20%，随着时间的推移， 交配的成功率降低(从4 月的100%减少到5 月份的45%和6 月份的0)；黑颈鹤的窝卵数是 2 枚，卵重207 克，卵长径和短径分别是107 和58 毫米，孵卵期为31 天，幼鹤的出壳率 为100%，但二个月后的死亡率达到31.2%，之后的幼鹤未观察到死亡，幼鹤出壳后两个 月内的死亡率可能是制约种群增长的一个原因；繁殖期间黑颈鹤食物以蕨麻(Potentilla anserina)、荸荠(Heleocharis dulcis)、委陵菜属(Comarum)、草地早熟禾(Poa pratensis)、眼 子菜属(Potamageton)、蒲公英(Taraxacum mongolicum)等植物的花、果、茎等为主，但也 取食包括无脊椎动物如蝗虫(Chorthippus hsiai)，粪金龟(Geotrupes sp.)，椭圆萝卜螺(Radix swinboi)和耳萝卜螺(Radix ouricuaria)，以及脊椎动物黑唇鼠兔(Ochotona curizoniae)、红 脚鹬(Tringa totanus)、黑水鸡(Callinula chloropus)、小..(Tachgbaptus ruficollis)、黄河裸 鲤(Gymnocypris pylzovi)等，取食动物性食物可能是补充繁殖所耗费的巨大能量和为迁徙 储备能量；繁殖季节黑颈鹤的主要时间分配在取食和繁殖上，分别占45%和28%，其余 依次为运动10%、护理9%、警戒6%、静息1%和其它1%，不同的繁殖阶段，除了运动 和其它行为外，其余各种行为的时间分配存在显著差异，各行为频次以警戒最高(43 次/小 时)，其余依次为取食(31 次/小时)、护理(17 次/小时)、运动(11 次/小时)、繁殖(5 次/小 时)、其它(1 次/小时)和静息(1 次/小时)，除了其它行为外，各繁殖阶段行为发生频次差异 显著，各行为的持续时间以繁殖最多(189 秒/次)，其次为取食(53 秒/次)、静息(50 秒/次)、 运动(33 秒/次)、其它(22 秒/次)和护理(19 秒/次)，在一天中，黑颈鹤各行为分配随时间的历家庭解体 (Family breakup)，建立繁殖领域，完成交配，筑巢等行为，进入繁殖中期 后，花湖的黑颈鹤种群数量整体呈现下降趋势，并在6 月的第一周达到最低，繁殖中期黑 颈鹤的种群比前期稍高(29)，与繁殖相关的行为在整个繁殖季节达到最高(51%)，进入繁 殖后期，随着幼鹤出壳和成鹤维持领域能力的降低，花湖周围的黑颈鹤种群数量再次增 加，并在以后的2 个月内维持在较高的数量(56)，到9 月中旬，黑颈鹤开始迁徙，4 周 后，所有的鹤都离开繁殖地花湖。在繁殖期间，被驱逐出领域的幼鹤与非繁殖的成鹤形成 集群在繁殖地周围游荡，集群在各个时期都存在，只是在繁殖前期最多(2 群/周)，繁殖中 期和繁殖后期为1 群/周，群内个体数量在繁殖中期最高(26 只/群)，在繁殖前期和中期分 别是6 和8 只/群，不同时期的群体和群体规模都存在显著差异；黑颈鹤的交配发起者是 雌鹤，交配的成功率为60%，雄鹤的无应答和不成熟的交配经验是交配失败的主要原 因，80%的交配发生在上午，交配成功率为58.3%，20%的交配发生在下午，成功率为 66.7%，黑颈鹤的交配主要发生在4 月到5 月上旬之间，66.7%的交配发生在这一时期， 成功率为80%，之后到6 月上旬的交配仅有33.3%，成功率仅有20%，随着时间的推移， 交配的成功率降低(从4 月的100%减少到5 月份的45%和6 月份的0)；黑颈鹤的窝卵数是 2 枚，卵重207 克，卵长径和短径分别是107 和58 毫米，孵卵期为31 天，幼鹤的出壳率 为100%，但二个月后的死亡率达到31.2%，之后的幼鹤未观察到死亡，幼鹤出壳后两个 月内的死亡率可能是制约种群增长的一个原因；繁殖期间黑颈鹤食物以蕨麻(Potentilla anserina)、荸荠(Heleocharis dulcis)、委陵菜属(Comarum)、草地早熟禾(Poa pratensis)、眼 子菜属(Potamageton)、蒲公英(Taraxacum mongolicum)等植物的花、果、茎等为主，但也 取食包括无脊椎动物如蝗虫(Chorthippus hsiai)，粪金龟(Geotrupes sp.)，椭圆萝卜螺(Radix swinboi)和耳萝卜螺(Radix ouricuaria)，以及脊椎动物黑唇鼠兔(Ochotona curizoniae)、红 脚鹬(Tringa totanus)、黑水鸡(Callinula chloropus)、小..(Tachgbaptus ruficollis)、黄河裸 鲤(Gymnocypris pylzovi)等，取食动物性食物可能是补充繁殖所耗费的巨大能量和为迁徙 储备能量；繁殖季节黑颈鹤的主要时间分配在取食和繁殖上，分别占45%和28%，其余 依次为运动10%、护理9%、警戒6%、静息1%和其它1%，不同的繁殖阶段，除了运动 和其它行为外，其余各种行为的时间分配存在显著差异，各行为频次以警戒最高(43 次/小 时)，其余依次为取食(31 次/小时)、护理(17 次/小时)、运动(11 次/小时)、繁殖(5 次/小 时)、其它(1 次/小时)和静息(1 次/小时)，除了其它行为外，各繁殖阶段行为发生频次差异 显著，各行为的持续时间以繁殖最多(189 秒/次)，其次为取食(53 秒/次)、静息(50 秒/次)、 运动(33 秒/次)、其它(22 秒/次)和护理(19 秒/次)，在一天中，黑颈鹤各行为分配随时间的历家庭解体 (Family breakup)，建立繁殖领域，完成交配，筑巢等行为，进入繁殖中期 后，花湖的黑颈鹤种群数量整体呈现下降趋势，并在6 月的第一周达到最低，繁殖中期黑 颈鹤的种群比前期稍高(29)，与繁殖相关的行为在整个繁殖季节达到最高(51%)，进入繁 殖后期，随着幼鹤出壳和成鹤维持领域能力的降低，花湖周围的黑颈鹤种群数量再次增 加，并在以后的2 个月内维持在较高的数量(56)，到9 月中旬，黑颈鹤开始迁徙，4 周 后，所有的鹤都离开繁殖地花湖。在繁殖期间，被驱逐出领域的幼鹤与非繁殖的成鹤形成 集群在繁殖地周围游荡，集群在各个时期都存在，只是在繁殖前期最多(2 群/周)，繁殖中 期和繁殖后期为1 群/周，群内个体数量在繁殖中期最高(26 只/群)，在繁殖前期和中期分 别是6 和8 只/群，不同时期的群体和群体规模都存在显著差异；黑颈鹤的交配发起者是 雌鹤，交配的成功率为60%，雄鹤的无应答和不成熟的交配经验是交配失败的主要原 因，80%的交配发生在上午，交配成功率为58.3%，20%的交配发生在下午，成功率为 66.7%，黑颈鹤的交配主要发生在4 月到5 月上旬之间，66.7%的交配发生在这一时期， 成功率为80%，之后到6 月上旬的交配仅有33.3%，成功率仅有20%，随着时间的推移， 交配的成功率降低(从4 月的100%减少到5 月份的45%和6 月份的0)；黑颈鹤的窝卵数是 2 枚，卵重207 克，卵长径和短径分别是107 和58 毫米，孵卵期为31 天，幼鹤的出壳率 为100%，但二个月后的死亡率达到31.2%，之后的幼鹤未观察到死亡，幼鹤出壳后两个 月内的死亡率可能是制约种群增长的一个原因；繁殖期间黑颈鹤食物以蕨麻(Potentilla anserina)、荸荠(Heleocharis dulcis)、委陵菜属(Comarum)、草地早熟禾(Poa pratensis)、眼 子菜属(Potamageton)、蒲公英(Taraxacum mongolicum)等植物的花、果、茎等为主，但也 取食包括无脊椎动物如蝗虫(Chorthippus hsiai)，粪金龟(Geotrupes sp.)，椭圆萝卜螺(Radix swinboi)和耳萝卜螺(Radix ouricuaria)，以及脊椎动物黑唇鼠兔(Ochotona curizoniae)、红 脚鹬(Tringa totanus)、黑水鸡(Callinula chloropus)、小..(Tachgbaptus ruficollis)、黄河裸 鲤(Gymnocypris pylzovi)等，取食动物性食物可能是补充繁殖所耗费的巨大能量和为迁徙 储备能量；繁殖季节黑颈鹤的主要时间分配在取食和繁殖上，分别占45%和28%，其余 依次为运动10%、护理9%、警戒6%、静息1%和其它1%，不同的繁殖阶段，除了运动 和其它行为外，其余各种行为的时间分配存在显著差异，各行为频次以警戒最高(43 次/小 时)，其余依次为取食(31 次/小时)、护理(17 次/小时)、运动(11 次/小时)、繁殖(5 次/小 时)、其它(1 次/小时)和静息(1 次/小时)，除了其它行为外，各繁殖阶段行为发生频次差异 显著，各行为的持续时间以繁殖最多(189 秒/次)，其次为取食(53 秒/次)、静息(50 秒/次)、 运动(33 秒/次)、其它(22 秒/次)和护理(19 秒/次)，在一天中，黑颈鹤各行为分配随时间的历家庭解体 (Family breakup)，建立繁殖领域，完成交配，筑巢等行为，进入繁殖中期 后，花湖的黑颈鹤种群数量整体呈现下降趋势，并在6 月的第一周达到最低，繁殖中期黑 颈鹤的种群比前期稍高(29)，与繁殖相关的行为在整个繁殖季节达到最高(51%)，进入繁 殖后期，随着幼鹤出壳和成鹤维持领域能力的降低，花湖周围的黑颈鹤种群数量再次增 加，并在以后的2 个月内维持在较高的数量(56)，到9 月中旬，黑颈鹤开始迁徙，4 周 后，所有的鹤都离开繁殖地花湖。在繁殖期间，被驱逐出领域的幼鹤与非繁殖的成鹤形成 集群在繁殖地周围游荡，集群在各个时期都存在，只是在繁殖前期最多(2 群/周)，繁殖中 期和繁殖后期为1 群/周，群内个体数量在繁殖中期最高(26 只/群)，在繁殖前期和中期分 别是6 和8 只/群，不同时期的群体和群体规模都存在显著差异；黑颈鹤的交配发起者是 雌鹤，交配的成功率为60%，雄鹤的无应答和不成熟的交配经验是交配失败的主要原 因，80%的交配发生在上午，交配成功率为58.3%，20%的交配发生在下午，成功率为 66.7%，黑颈鹤的交配主要发生在4 月到5 月上旬之间，66.7%的交配发生在这一时期， 成功率为80%，之后到6 月上旬的交配仅有33.3%，成功率仅有20%，随着时间的推移， 交配的成功率降低(从4 月的100%减少到5 月份的45%和6 月份的0)；黑颈鹤的窝卵数是 2 枚，卵重207 克，卵长径和短径分别是107 和58 毫米，孵卵期为31 天，幼鹤的出壳率 为100%，但二个月后的死亡率达到31.2%，之后的幼鹤未观察到死亡，幼鹤出壳后两个 月内的死亡率可能是制约种群增长的一个原因；繁殖期间黑颈鹤食物以蕨麻(Potentilla anserina)、荸荠(Heleocharis dulcis)、委陵菜属(Comarum)、草地早熟禾(Poa pratensis)、眼 子菜属(Potamageton)、蒲公英(Taraxacum mongolicum)等植物的花、果、茎等为主，但也 取食包括无脊椎动物如蝗虫(Chorthippus hsiai)，粪金龟(Geotrupes sp.)，椭圆萝卜螺(Radix swinboi)和耳萝卜螺(Radix ouricuaria)，以及脊椎动物黑唇鼠兔(Ochotona curizoniae)、红 脚鹬(Tringa totanus)、黑水鸡(Callinula chloropus)、小..(Tachgbaptus ruficollis)、黄河裸 鲤(Gymnocypris pylzovi)等，取食动物性食物可能是补充繁殖所耗费的巨大能量和为迁徙 储备能量；繁殖季节黑颈鹤的主要时间分配在取食和繁殖上，分别占45%和28%，其余 依次为运动10%、护理9%、警戒6%、静息1%和其它1%，不同的繁殖阶段，除了运动 和其它行为外，其余各种行为的时间分配存在显著差异，各行为频次以警戒最高(43 次/小 时)，其余依次为取食(31 次/小时)、护理(17 次/小时)、运动(11 次/小时)、繁殖(5 次/小 时)、其它(1 次/小时)和静息(1 次/小时)，除了其它行为外，各繁殖阶段行为发生频次差异 显著，各行为的持续时间以繁殖最多(189 秒/次)，其次为取食(53 秒/次)、静息(50 秒/次)、 运动(33 秒/次)、其它(22 秒/次)和护理(19 秒/次)，在一天中，黑颈鹤各行为分配随时间的变化而体现较为明显的节律性，这可能与青藏高原恶劣的自然环境（如高辐射和热量的不 均匀分布）有关。 2003 年4 月1 日到10 月13 日，在花湖对黑颈鹤繁殖栖息地选择和放牧活动对黑颈鹤 取食栖息地选择的影响进行研究。研究区域内，按照从湖心向外的方向，将黑颈鹤繁殖期 间所使用的生境划分为4 种类型，即：湖心沼泽，浅水沼泽，草甸和退化草甸。繁殖期 间，黑颈鹤对各种栖息地利用的强度并非一致。湖心沼泽和湖岸沼泽是整个繁殖季节黑颈 鹤青睐的栖息地，是黑颈鹤筑巢和休息的地点，草甸和退化草甸是黑颈鹤主要的取食地 点，但在整个季节内都不是黑颈鹤青睐的栖息地类型，虽然在繁殖后期，在草甸和退化草 甸上活动的黑颈鹤明显增加。在有牛羊放牧时，大多数的繁殖鹤(49.7%)选择在距离湖边 100m 内的区域活动，而非繁殖鹤则主要在0－100m 区域(33.3%)和>400m 的区域(28.1%) 活动，在牛羊集中活动的200－400m 区域，两种鹤都选择避开，牛羊离开繁殖地点后， 黑颈鹤有向远离湖边方向扩散的趋势，多数的繁殖鹤(54.9%)和非繁殖鹤(52.3%)都在 >400m 的区域活动，虽然距离水面的距离在繁殖鹤活动地点的选择上有一定的影响，但 过度放牧的牛羊的确压缩了繁殖鹤和非繁殖鹤的活动空间。因此，在繁殖地来说，减少沼 泽区域的开发，对特定区域放牧活动的控制，加强沼泽生境的恢复，是保证黑颈鹤成功繁 殖的关键。 2003 年5 月到2005 年6 月，在若尔盖湿地内找到黑颈鹤的巢21 个。黑颈鹤的巢有3 种，分别是芦苇巢(3 个)、地上巢(14 个)和泥堆巢(4 个)，地上巢巢参数最小，芦苇巢的巢 参数最大；所有的巢都分布在湿地环境中，包括湖泊，沼泽和河流三种栖息地，巢在这些 栖息地中的分布也不是均匀的，湖泊中分布的巢最多，湖泊是黑颈鹤筑巢首选的栖息地， 但每年在此类生境中筑巢的黑颈鹤正在减少，黑颈鹤选择避开利用沼泽区域作为筑巢的栖 息地，黑颈鹤对河流区域的利用按照获得性进行；筑巢栖息地周围1 米外的草高和巢的暴 露与否、巢距离水面的距离和巢所在草岛的面积、巢周围的水深成为影响巢址选择的三个 主要生态因子，反映了隐蔽度、筑巢栖息地的质量和到达巢的难易程度是黑颈鹤选择巢址 的主要因素；在不同的微生境中，巢的参数不同，湖泊中的巢参数最大，湖泊中的巢比沼 泽中的巢更长、更宽和更高，而巢周围的水深差距不明显，湖泊中的巢要比河流中的巢短 径大，巢周的水深要比河流中的巢要稍浅，但巢长径和巢高差异不显著，沼泽和河流环境 中的巢参数没有明显的差异；巢周围有一定的水深是巢址选择时最为基本的条件；与其他 地区黑颈鹤的巢比较，若尔盖湿地中的巢要更小，但巢周围的水深要更深，这可能与不同 地点的植被、地理环境以及不同的人为干扰强度有关；若尔盖湿地内黑颈鹤巢栖息地的选择是黑颈鹤对正在变化中栖息地的妥协结果，保留有适宜于繁殖的小面积沼泽区域对黑颈 鹤的繁殖也很重要。 2004 年10 月到2006 年3 月，在大山包保护区对越冬黑颈鹤的生态进行研究。我们 将整个越冬季节划分为越冬早期(10 月－12 月)，越冬中期(1 月－2 月)和越冬后期(3 月－4 月)。保护区内黑颈鹤利用的栖息地划分为4 种类型，即：浅水生境，沼泽区域，草甸和 耕地。首先到达越冬地的仍然是家庭鹤，其次是集群鹤。大山包是黑颈鹤春季迁徙和秋季 迁徙的迁徙中转站，迁徙的高峰在12 月和3 月出现，在草海越冬的黑颈鹤在春季迁徙时 经过大山包，并在此停留8 天。大山包也是黑颈鹤的越冬地点，有大约900 只的黑颈鹤在 此越冬。黑颈鹤的配对主要发生在越冬中期，黑颈鹤家庭的解体(Family breakup)发生在繁 殖后期的3 月和4 月间，成鹤以放弃幼鹤离开越冬地而达到家庭的解体。整个越冬季节， 黑颈鹤对各种栖息地的利用强度并不是一致的。湿地(浅水区域和沼泽)是黑颈鹤整个冬天 青睐的生境(除了越冬后期对水域区域利用低外)，而耕地是越冬早期和越冬中期黑颈鹤的 主要取食地点，在越冬后期，草甸则成为黑颈鹤的主要取食地点。在整个冬天，幼鹤将 72.2%的时间用在取食，将6.8%的时间用在警戒，将18.6%的时间用在修整行为上，用在 其它行为上的时间为2.4%，而成鹤用在这些行为上的时间分配是63.9%，11%，22.8%和 2.3%。随着时间的推移，成鹤减少取食的时间，与之对应而增加了修整行为的比例，而 幼鹤的各行为变化没有规律性。是否具有越冬经验和不同的生态需求导致了成鹤和幼鹤的 不同时间分配。正是由于具有越冬经验，成鹤能够有效地调整不同行为的分配，幼鹤虽然 没有越冬经验，但在成鹤的照顾下，幼鹤有足够长的时间去取食，成鹤和幼鹤采取了不同 的越冬策略。正是具有越冬经验，成鹤的白昼行为分配呈现出一定的规律性，如取食行为 在早晚各自有一个取食峰值，而修整行为在中午最高等，而由于缺乏越冬经验和行为受到 成鹤的影响较大，幼鹤的行为节律规律性不是很强。 2005 年2－3 月和2006 年3 月，在大山包和贵州草海给8 只黑颈鹤放置了卫星发射器 以确定这两个地点的黑颈鹤的迁徙路线和新的繁殖地点。东部越冬种群的黑颈鹤迁徙时间 2－4 天，中途停歇3－4 个点，迁徙平均距离为622 公里，黑颈鹤迁徙时首先飞越金沙 江，向北偏西方向穿过和停歇于四川省的凉山山脉，到达凉山、邛崃山和大雪山脉交界的 地方，然后沿着大渡河河谷向北迁徙，到达包括四川省的若尔盖县、红原县、阿坝县、松 潘县，以及甘肃省玛曲县的若尔盖湿地内。与1993 年环志证实的迁徙路线比较，黑颈鹤 迁徙时明显避开了海拔较低、人口稠密的四川盆地，选择了沿着青藏高原东缘向四川盆地 过渡的高山峡谷地带飞行，沿着大渡河河谷进行迁徙。2 只黑颈鹤的信号在大渡河河谷区域消失，这个地点对于黑颈鹤的迁徙和保护有重要的意义。到达繁殖地后，黑颈鹤的活动 范围在5 月达到最大，此后逐渐减小，在8 月份活动范围减小到最小，之后，活动面积又 逐渐增大，并在迁徙前达到最高。在繁殖地，黑颈鹤每天的活动范围只有不到2km，隔 日的活动范围也不超过3km，结果提示在若尔盖湿地内可能还有更多的黑颈鹤活动。编 号为55984 的黑颈鹤在2005 年11 月和2006 年3 月分别完成从繁殖地返回越冬地和从越 冬地再次到达繁殖地的迁徙过程，在草海环志的64311 在繁殖地若尔盖湿地度过繁殖季节 后又成功返回草海越冬，而64310 在大山包越冬，在若尔盖湿地内度过夏季，在2006 年 11 月又返回草海越冬，其余两只黑颈鹤返回大山包越冬，结果证实1、黑颈鹤迁徙路线、 繁殖地和越冬地选择的稳定性，2、东部黑颈鹤越冬种群存在交流。

几类处在关键进化地位藻类的TIM基因和糖酵解途径的研究

糖酵解作为细胞的重要的基本代谢途径广泛存在于各类生物中。但参与该途径的tim基因／酶和整个途径在细胞中的区室定位情况在一些处在关键进化地位的藻类中还存在许多未知或争议。本文首先对参与该途径的一个重要酶――磷酸丙糖异构酶（TIM）在两种不同营养方式的眼虫上进行了鉴定和序列结构分析，并结合了包括绿藻、红藻和动基体类等在内的其它生物的数据进行了分子系统分析；其次，对该途径在绿藻类的衣藻细胞中的区室定位情况进行了研究，并对该特殊的区室定位途径的进化进行了探讨。得到了如下结果和结论： 1）通过3’与5’-RACE实验，在光合型眼虫Euglena gracilis和Euglena intermedia和腐生型眼虫Astasia longa中各获得了一长一短两个TIM的全长cDNA序列，同时通过基因组DNA-PCR和序列搜索，还获得了两种绿藻和红藻的tim基因序列。前导序列分析显示眼虫的两个cDNA分别编码定位到胞质的cTIM和定位到叶绿体的cpTIM或质体的pTIM。腐生眼虫A. longa的pTIM与光合型眼虫E. gracilis的cpTIM高度相似，其前导序列也具有眼虫典型的核编码叶绿体蛋白质的典型特征；两类不同营养型眼虫的成熟TIM间的同源性达91.6％，并且具有其它TIM所共有的活性中心氨基酸和保守的序列motifs。这表明A. longa的pTIM确实是定位于质体、具有生物活性的cpTIM的同工酶，并提示A. longa的质体还具有与TIM相关的代谢功能（例如脂肪酸的合成），而不仅仅是一个叶绿体的“残迹”。 TIM的序列比对和分子系统分析结果显示：眼虫类和红藻类的TIM共有一个由两个氨基酸组成的插入；更重要的是，眼虫类TIM既没有与被认为与它共祖的动基体类的TIM聚在一起，又没有与被认为为其提供叶绿体（经二次内共生）的绿藻的TIM聚在一起，而是与红藻TIM聚为一枝。这提示眼虫与红藻间在进化历史上可能曾经有过基因交流。 2）采用生物信息学手段结合分子生物学实验，对衣藻基因组和转录组中参与糖酵解相关基因／酶进行了鉴定、定位预测和表达水平分析，结果表明：与其它极大多数的真核生物不同，衣藻细胞质中不具有完整的糖酵解途径，尽管该途径的后三步主要发生在胞质中，但前七步则是发生在叶绿体中的。 分子系统分析表明衣藻叶绿体中参与前6步和细胞质中参与最后2步的糖酵解酶都是胞质型起源，其中参与第4步的FBA更像是由很早时期的胞质型基因重复而来的；而第7步的PGK是由内共生形成叶绿体的蓝细菌的水平基因转移而来。这表明衣藻胞质中所缺少的糖酵解酶是一种次生性丢失的结果，而非原始的特征；其叶绿体中的糖酵解步骤应该是由于原有胞质型糖酵解酶的基因重复之后重新定位或者直接重新定位到叶绿体中，以及内共生产生叶绿体时由蓝细菌的水平基因转移所致。

西藏红拉雪山自然保护区黑白仰鼻猴 Rhinopithecus bieti 的生态与行为研究，中国及其邻近地区兽类动物地理区划数量分析

从 2002 年11 月至2005 年4 月，在西藏红拉雪山自然保护区（98°20' ~ 98°59'E，28°48' ~ 29°40'N）对小昌都黑白仰鼻猴（Rhinopithecus bieti）群（98°35'00" ~ 98°40'00"E，29°14'24" ~ 29°16'42"N）（210 只左右）的生境及其利用形式、食 性、活动时间分配、过夜树及过夜地选择、雄－婴照料和繁殖季节作了重点研究， 并对保护区内的猴群分布、种群数量、保护状态以及潜在的威胁因素等作了一般 性的考查研究。 红拉雪山自然保护区存在3 个黑白仰鼻猴群，数量至少有300 只。从北到南 分别是执娜群、小昌都群和米拉卡群，其中执娜群（29°22'，98°28'），是黑白仰 鼻猴最北分布群。猴群栖息范围中，人类的经济活动频繁。由于活动范围位于或 接近藏传佛教的神山，小昌都和执娜猴群保护最好，这两群之间存在生境走廊。 米拉卡猴群保护状态较差，主要是偷猎现象还没有杜绝。对过去20 年的农牧业 统计资料及藏族风俗习惯和民族传统综合分析发现：在红拉雪山自然保护区，尽 管人类经济活动频繁，但猴群与人类和谐共存是可能的。 小昌都猴群全年白天用49％的时间取食，20％的时间移动，18％的时间休 息，13％的时间作其他的活动。在6-8 月，猴群日间表现出明显的三个取食高峰， 两个休息高峰。在11-1 月，猴群有两个取食高峰，一个休息高峰，或者休息高 峰根本不明显（12 月）。尽管环境温度和食物组成等也会影响时间预算，但造成 这种现象的主要原因可能是白天长度的季节性变化。 小昌都猴群年家域为21.25 km2，且主要在3800 – 4250 米的针叶林中活动。 食物好的季节，猴群日移动距离长，日活动范围大；食物差的季节，则相反。秋 －冬季（10-12 月）由于取食川滇高山栎（Quercus aquifolioides），活动的海拔高 度高于其它季节；冬季（1-4 月）活动范围最低。猴群并不避免在人类间伐过的 次生针叶林中活动。小生境的使用强度与在此生境中过夜的次数有关。 小昌都猴群的食物以松萝为主。全年的食物组成：用单筒望远镜观察，松萝 82.1％，芽和叶12.1%，花、果实或种子占1.1%，无脊椎动物占0.6%，树皮、 树根、树胶，草等占4.2%；接近猴群用肉眼或双筒望远镜观察，松萝50.8％， 芽和叶28.5%，花、果实或种子占7.1%，无脊椎动物占6.5%，树皮、树根、树胶，草等占7.1%。根据动物在不同林层分布百分比整合后得到接近真实的食物 构成：松萝75.4％，芽和叶15.7%，花、果实或种子占2.9%，无脊椎动物占2.4%， 树皮、树根、树胶，草等占3.9%。猴群在夏季（6-8 月）会下地翻开小石块，取 食无脊椎动物。冬季（1-4 月）会取食至少6 种树皮和2-3 种干草。 基于避免捕食、安全、舒适、体温调节的考虑，小昌都猴群选择高大、底枝 高、底枝长以及层数多的树过夜，并在背风、阳坡和海拔低的过夜地过夜。在过 夜地的选择中，存在着阳坡和海拔高度的权衡决策。 小昌都猴群个体不同林层的分布：77.5％在树上，6.0％在灌丛，16.5％在地 上。成年雄猴和青年猴倾向于在地上活动。在地上活动时又倾向于移动，休息和 其他活动少。获得高质量的食物和避免被捕食是出现这种格局的原因。 在小昌都猴群中，婴猴受到雄猴照料时间百分比（percent time of infant care, PTIC）为17.2±3.3，其中身体接触（BC）、接近（IP）和监护（G）照料的时 间百分比分别为0.6±0.5、5.8±1.2 和10.8±3.8。G 照料的最低值和最高值分别 在8 月和3 月。雌猴总PTIC 为69.3±6.9，其中BC、IP 和G 的时间分别为42.0 ±8.6、21.6±5.3 和5.7±3.8。最低BC 和最高G 照料同时出现在3 月。对雄猴， （1）总PTIC 在能量压力高的季节明显高于能量压力低的季节；（2）G 照料PTIC 在能量压力高的季节也要比能量压力低的季节高；（3）BC 和IP 照料在两个季节 之间没有区别。对于雌猴，（1）总PTIC 在高能量压力季节要比低能量压力季节 低；（2）G 照料在高能量压力季节要比低能量压力季节高，而BC 照料在高能量 压力季节要比低能量压力季节低；（3）IP 照料在两个季节之间没有区别。这种 高强度的雄婴照料，特别是托儿所的照料方式，是由这种环境下过高的能量压力 所引起的。 小昌都群为严格季节性出生且出生季节在2 月初到3 月中旬之间，时间跨度 45 天，属脉冲型。这种格局是光周期、温度、食物等环境因子综合调控的结果。 综合以上结果我们认为小昌都群的行为和生态特点，除具备疣猴一般特点 外，还具有地点特殊性，是自然环境如光照、温度、食物供给季节变化和生物环 境如捕食压和人类活动相互作用的结果，或者可以看成是能量摄入和损耗之间以 及它们和安全之间的权衡结果，体现了猴群对极端环境的适应。

雨蛙皮肤分泌液中两种活性蛋白结构和功能的研究

在本研究中我们首次从雨蛙皮肤分泌液中分离得到了一种神经毒素（命名为Anntoxin）和一种干细胞自我更新支持因子（命名为AnSF）。随后，我们通过构建雨蛙皮肤cDNA 文库，利用特异引物筛选到Anntoxin 和AnSF 的cDNA 编码序列，前者的Gene Bank 登录号为FJ598043，后者还在等待分配登录号。Anntoxin 具有60 个氨基酸，是一种Kunitz 类型的丝氨酸蛋白酶抑制剂，构建Anntoxin 的3D-NMR 溶液结构，证实Anntoxin 不同于有三对二硫键（键组合模式：1-6，2-4，3-5）的Kunitz 类型丝氨酸蛋白酶抑制剂，它只有两对二硫键（组合模式：1-4，2-3）。AnSF 具有123 个氨基酸，在C 端具有和Calmadolin 同源的两个EF 手指结构，能够支持人类胚胎干细胞（hESC）和猴神经干细胞（rNSC）的自我更新。为了进行Anntoxin 的生物活性和结构分析，我们在体外成功表达了 Anntoxin，获得了大量的重组Anntoxin（rAnntoxin）。经过生物活性分析， rAnntoxin 和天然分离到的Anntoxin 生物活性相当，都具有很强的胰蛋白酶抑制剂活性。Anntoxin 是一种Kunitz 类型的丝氨酸蛋白酶抑制剂，和来源于芋螺（Cone Snail）的神经毒素Conkunitzin-S1，黑色眼镜蛇毒液（black cobra, Dendroaspis polylepis polylepis）的树突毒素δ-DaTX 或蛋白酶抑制剂K 分别具有32.8%和36.7%的相同序列，和鱼类（fish）来源的Stonustoxin 也有一定的同源性。利用膜片钳技术分别检测Anntoxin 对大鼠背根神经节（rat DRG）上Na+通道，K+通道，Ca2+通道的作用，结果证明Anntoxin 对河豚毒素敏感（TTX-S）的钠离子通道（Nav）有较强的抑制活性，对 K+通道，Ca2+通道作用不明显。随后我们在非洲爪蟾卵母细胞上表达几种典型和常用于测试对亚型K+通道作用的Kv1.1，Kv1.2，Kv1.3，Kv2.1 和 Kv4.2，Kv4.3，Anntoxin 对这些亚型K+通道上的K+电流都没有明显影响。我们成功构建了Anntoxin 的3D-NMR 溶液结构（NMR 号：PDB ID 2KCR， BMRB ID 16094），证实Anntoxin 具有典型的Kunitz 结构，由反向平行的 β–折叠片和α–螺旋及转角组成梨形结构。利用RT-PCR，WesternBlot 以及 ELISA 技术，发现在皮肤、脑、肝、胃和肠中都能检测Anntoxin mRNA 转录，但只在皮肤、脑、肝和胃中有蛋白表达，表达量分别为29.5、5.39、 4.80 和2.02 微克/克鲜重，可以看出Anntoxin 在皮肤中大量表达，是皮肤分泌液中非常重要的组成部分。因为皮肤是雨蛙接触外界的第一屏障，雨蛙的生存环境中存在很多潜在威胁，比如微生物、吸血昆虫、鸟类、爬行动物、哺乳动物等，所以Anntoxin 有可能是雨蛙适应环境的重要化学武器，于是我们测试了Anntoxin 对甜菜夜蛾幼虫（Laphygma exigua Hubner）、水蛇（Enhydris plumbea）、鹌鹑（Coturnix coturnix）、昆明小鼠（Kunming mice）的急性毒性，其LD50 分别为50，450，2500 和3000 微克/千克体重，说明在华西雨蛙皮肤中大量表达的Anntoxin 对几类潜在天敌确实有较强的杀灭作用。为了检测AnSF 的生物学活性，我们在体外成功表达了AnSF，获得了大量rAnSF。设计三个浓度梯度10、100 和500ng/ml，把AnSF 和hESC 共培养，发现在10~100 ng/ml 浓度时对hESC 的自我更新有支持作用；设计三个浓度梯度10、100 和500ng/ml，把AnSF 和rNSC 共培养，发现在 10ng/ml 时对rNSC 的自我更新有较强的支持作用。在超过500ng/ml 高浓度时，AnSF 对hESC 和rNSC 都有明显的细胞毒性作用，对rNSC 的毒性作用更明显。利用RT-PCR 技术，我们检测了雨蛙的皮肤、肌肉、肝脏、胰脏、胃、肠、心脏和脑，AnSF 只在皮肤中有少量表达。这表明AnSF 可能只参与雨蛙皮肤干细胞库的维持，保持皮肤内环境稳定，因为蛙类的皮肤细胞要负责产生大量活性物质参与先天免疫和抗氧化等重要的生理活动，需要经常更新，而AnSF 的存在可能保证雨蛙皮肤干细胞库容量稳定，不断分化出各种成熟的皮肤细胞来使皮肤能够得到足够和及时的更新，保证其功能的正常行使。所以AnSF 是维持华西雨蛙皮肤内环境稳定的重要物质。

低温漂高电源抑制的CMOS片上电流源

设计了一种用于驱动电路和模数转换器的片上电流源,该结构利用带隙基准的方法产生了一个与温度无关的参考电平,同时为了满足高电源抑制的要求,电流源中采用了运算放大器的负反馈环路来抑制电源到输出的增益,从而使输出电平与电源电压无关,然后通过电阻把电压转化为电流.该电路在0.35,μm、3.3 V的工艺下实现,芯片面积为0.03 mm~2.仿真和测试结果表明,该电流源的温度系数为8.7×10~(-6)/℃,在2.6～4 V的电源电压下均能正常工作,达到了系统要求.