Rylenfarbstoffe in nanoskopischen Systemen

ZusammenfassungDurch die Funktionalisierung des Chromophors Tetraphenoxyperylendiimid mit vier Ethinylgruppen stand ein Farbstoff zur Verfügung, welcher sich als Kernmolekül für den Aufbau von Polyphenylendendrimeren eignet. Ausgehend von dem Farbstoffkern wurden drei Dendrimergenerationen synthetisiert. Durch die Dendronisierung wird die Aggregation des zentralen Farbstoffs im Festkörper verhindert, weshalb das G1-Dendrimer als aktive Schicht in LED´s eingesetzt wurde und zur Verbesserung dieser Bauelemente führte. Weiterhin wurde auch die Oberfläche der Polyphenylendendrimere mit 4, 8 bzw. 16 Perylenmonoimidfarbstoffen funktionalisiert. Durch zeitaufgelöste Absorptions- und Emissionsmessungen und Einzelmolekülspektroskopie des G2-Dendrimers wurde ein photophysikalisches Modell des multichromophoren Systems entwickelt.Neben Polyphenylendendrimeren dienten auch Emulsionspolymerisate, Miniemulsionspolymerisate und Halbleiterkristalle als nanoskopische Trägermaterialien für Rylenfarbstoffe. Für die Anknüpfung an Lartices wurden amino- und styrylfunktionalisierte Perylen- und Terrylenchromophore dargestellt, was zu einer statistischen Verteilung der Farbstoffe auf der Oberfläche bzw. im Inneren führte. Außerdem wurden Rylenfarbstoffe als stabile Fluoreszenzmarkierung von Metallocenkatalysatoren eingesetzt. Silica- und polymergeträgerte markierte Katalysatoren wurden zur Polymerisation von Ethylen verwendet und lieferten fluoreszente PE-Produkte, ohne Einfluß auf die Polymerisation zu nehmen. Zum Einen wurde mit Hilfe der Dotierung der heterogenen Polymerisationskatalysatoren der Verbleib des fragmentierten Trägermaterials in den PE-Produktpartikeln detektiert. Zum Anderen erlaubt der Einsatz unterschiedlich fluoreszierender Markierungsgruppen die Durchführung eines kombinatorischen Verfahrens zum Testen von Polymerisationskatalysatoren.

Biomimetisches Modell eines Photosystems aus dem pflanzlichen Photosyntheseapparat

In dieser Arbeit wurde ein biomimetisches Modell für ein pflanzliches Photosystem bestehend aus dem rekombinanten Hauptlichtsammlerkomplex (LHCII) als Absorptions- und Energietransfereinheit und einem N-terminal an das Protein gebundenen Farbstoff als Energieakzeptor hergestellt. Mehrere LHCII-Farbstoff-Konstrukte wurden getestet, die höchste Energietransfereffizienz von komplexgebundenem Chlorophyll-a zum Energieakzeptor konnte an einem LHCII-Benzoylterrylendicarboximid-Konstrukt gemessen werden. Bei Raumtemperatur wurde hier 70% der Chlorophyll-a-Anregungsenergie auf den Farbstoff übertragen, bei 77 K sogar 85%. LHCII-Farbstoffkonstrukte können helfen, strukturelle und funktionelle Eigenschaften des LHCII näher zu beleuchten. So konnte bereits in dieser Arbeit gezeigt werden, daß der N-Terminus des Komplexes im zeitlichen Mittel in eine größere Annäherung zum pigmentierten Teil des LHCII kommen muß, sonst sind Energietransfereffizienzen obiger Größenordnung nicht möglich. Weitere Erkenntnisse werden von einzelmolekülspektroskopischen Untersuchungen erwartet. Voraussetzung hierfür ist jedoch eine orientierte Immobilisierung des LHCII auf einer Glasoberfläche. Es gelang, den Komplex über eine auf molekularer Ebene eingeführte Aminosäuresequenz aus sechs Histidinen an die Nickelchelatgruppe einer auf Glas immobilisierten Meerrettich-Peroxidase zu binden. Einzelmolekülspektroskopisch konnte eine LHCII-Immobilisation senkrecht zur Proteinsymmetrieachse nachgewiesen werden. Mittelfristig wird angestrebt, LHCII-Farbstoffkonstrukte auch für photovoltaische Anwendungen nutzbar zu machen. Ein erster Meilenstein wurde in dieser Arbeit erreicht, indem es gelang, LHCII an Titandioxid, Halbleiter der sog. Grätzelzelle, zu binden.

Zur Kooperativität des Vogelspinnen-Hämocyanins

Zusammenfassung Kooperativität bei Atmungsproteinen bedeutet eine Änderung der O2-Affinität während der Beladung mit O2 und läßt sich durch die Wechselbeziehung zwischen O2-Beladung und Konformation beschreiben. In dieser Arbeit wurde das 24-mere Hämocyanin der Vogelspinne Eurypelma californicum bzgl. Beladung und Konformationen sowohl auf der Ensemble- wie auch auf der Einzel-Molekül-Ebene charakterisiert. EnsembleDie Bindung von O2 an Hämocyanine ist mit einer drastischen Abnahme der Fluoreszenz-Quantenausbeute verbunden. Durch Vergleich von theoretisch und experimentell bestimmten Quantenausbeuten konnte gezeigt werden, daß die Löschung auf Förster-Transfer zurückzuführen ist, und daß kein Einfluß der Oligomerisierung, Protein-Konformation, Beweglichkeit oder Tierart besteht. Die Konformation von Hämocyaninen konnte mit Crosslinkern im oxy- und deoxy-Zustand fixiert werden. Die Charakterisierung der Produkte führte zu einer neuen Vorstellung, wie unterschiedliche Affinitäten realisiert sein können. Hierbei kommt der Dynamik der Protein-Matrix eine entscheidende Rolle zu. Einzel-MoleküleMittels Zwei-Photonen-Anregung konnten erstmalig einzelne Proteine über ihre intrinsische Tryptophan-Fluoreszenz nachgewiesen werden. Zum einen gelang es, Modellsysteme mit nur 340 Trp abzubilden, andererseits konnte die Diffusion einzelner Hämocyanine (148 Trp) mit Hilfe der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie nachgewiesen werden.Einzelne Hämocyanine konnten durch Adsorption und mildes Eintrocknen an verschiedenen Oberflächen immobilisiert werden. Mittels Atomarer Kraft-Mikroskopie (AFM) ließen sich individuelle Hämocyanine abgebilden, wobei Details der Quarärstruktur aufgelöst werden konnten.

Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie und -Spektroskopie von Sauerstofftransportproteinen

In dieser Arbeit wurde die intrinsische Tryptophanfluoreszenz von Proteinen nach Zwei-Photonen-Anregung untersucht. Als interessantes Modellsystem wurde das Sauerstofftransportprotein der Vogelspinne Eurypelma californicum gewählt. Zum einen besitzt das Protein 148 Tryptophan-Seitenketten, so daß deren geringer Absorptionsquerschnitt kompensiert werden kann und eventuell einzelne Proteine aufgrund ihrer Tryptophanfluoreszenz detektiert werden können. Zum anderen signalisiert diese Fluoreszenz die Sauerstoffbeladung, so daß die kooperative Sauerstoffbindung auf Einzelmolekülebene untersucht werden könnte. Als limitierender Faktor hat sich die Photostabilität der Tryptophane nach Zwei-Photonen-Anregung herausgestellt. Im Mittel können von einem Hämocyanin-Molekül drei Photonen detektiert werden, bevor alle 148 Tryptophan-Seitenketten geblichen sind. Dies ist ein für Einzelmolekülspektroskopie äußerst niedriger Wert. Trotz dieser geringen Photostabilität ist es zum erstem Mal gelungen, die Diffusion einzelner Proteine mit Hilfe ihrer intrinsischen Tryptophanfluoreszenz zu beobachten. Wenn in einer geeigneten Umgebung die Photostabilität der Tryptophane höher ist, so reicht die Zahl der detektierten Photonen aus, um einzelne Teilchen abzubilden. Überraschend hat sich ergeben, daß es möglich ist, durch Lichteinstrahlung von außen in das Sauerstoffbindungsgleichgewicht einzugreifen und die Reaktion des Proteins auf die Auslenkung aus dem Gleichgewichtszustand zu beobachten. Das intensitätsabhängige Sauerstoffbindungsverhalten wurde modelliert und an die Messungen angepaßt. Die lichtinduzierte Sauerstoffabgabe führt anscheinend nicht zu einem Konformationswechsel.

Einzelmolekülspektroskopische Studien an Farbstoff-markierten Chlorophyll-a/b-Lichtsammlerkomplexen und Untersuchungen zur Integration der Komplexe in elektrochemische Solarzellen

Die zentrale Funktion des Hauptlichtsammlerkomplexes des Photosystems II, LHCII, besteht in der Absorption von Sonnenlicht und der Bereitstellung von Energie für die photosynthetische Ladungstrennung im Reaktionszentrum des Photosystems. Auch in der Regulation der Photosynthese spielt der LHCII eine wichtige Rolle, da die Energieverteilung zwischen Photosystem I und Photosystem II im Rahmen des sog. „State Transition“-Prozesses über die Verteilung der Lichtsammlerkomplexe zwischen den beiden Photosystemen gesteuert wird. Im Blickfeld des ersten Teils dieser Arbeit stand die konformative Dynamik der N-terminalen Domäne des LHCII, die wahrscheinlich in die Regulation der Lichtsammlung involviert ist. Gemeinsam mit Mitarbeitern des 3. Physikalischen Instituts der Universität Stuttgart wurde an der Etablierung einer Methode zur einzelmolekülspektroskopischen Untersuchung der Dynamik des N-Terminus gearbeitet. Als Messgröße diente der Energietransfer zwischen einem Fluoreszenzfarbstoff, der an die N-terminale Domäne gekoppelt war, und den Chlorophyllen des Komplexes. Die Funktion des LHCII als effiziente Lichtantenne bildete die Grundlage für den zweiten Teil dieser Arbeit. Hier wurde untersucht, in wie weit LHCII als Lichtsammler in eine elektrochemische Solarzelle integriert werden kann. In der potentiellen Solarzelle sollte die Anregungsenergie des LHCII auf Akzeptorfarbstoffe übertragen werden, die in der Folge Elektronen in das Leitungsband einer aus Titandioxid oder Zinndioxid bestehenden porösen Halbleiterelektrode injizierten, auf der Komplexe und Farbstoffe immobilisiert waren.

Core-shell macromolecules with dendritic polyphenylene core and polymer shells

Core-shell macromolecules with dendritic polyphenylene core and polymer shell Zusammenfassung / Abstract Core-shell macromolecular structures have become of great interest in materials science because they gave an opportunity to combine a large variety of chemical and physical properties in the single molecule, by combination of different (in terms of chemistry and physics) cores and shells. The interest in such complex structures was provoked by their potential applications in the coating and painting industry (latexes), as supports for catalysts in polymer industry, or as nano-containers and transporters for genes or drug delivery. The aim of this study was the synthesis, characterization and further application of core-shell macromolecules possessing a hydrophobic stiff core (polyphenylene dendrimers) surrounded with a hydrophilic, soft, covalently bonded polymer shell (poly(ethylene oxide) and its copolymers). The requirements for such complex substances were that they should be well-defined in terms of molecular weight (narrow molecular weight distribution) and in molecular structure. The preparation of core-shell molecules containing dendrimer as a core was possible via two synthetic routs: “grafting-onto” and “grafting-from”. The resulting core-shell macromolecules possessed narrow polydispersity as guaranteed by the excellent structural and functional definition of the dendrimer and the narrow polydispersity of the PEO, PS-b-PEO and PI-b-PEO attached to the dendrimer surface. Additional investigation of the size of the particles indicated a relation between both the length and the number of the polymer chains and the hydrodynamic radius determined by Dynamic Light Scattering and Fluorescent Correlation Spectroscopy. Core-shell nano-particles were applied as metallocene supports in heterogeneous olefin polymerizations. Our results indicate that such catalyst systems, that have a size of at least one order of magnitude smaller than the used by now organic supports, could be very useful as model compounds for investigations on catalyst fragmentation and its influence on the product parameters.

Visualization, manipulation and force spectroscopy of cylindrical polymer brushes

The Ph.D. thesis deals with the conformational study of individual cylindrical polymer brush molecules using atomic force microscopy (AFM). Imaging combined with single molecule manipulation has been used to unravel questions concerning conformational changes, desorption behavior and mechanical properties of individual macromolecules and supramolecular structures. In the first part of the thesis (chapter 5) molecular conformations of cylindrical polymer brushes with poly-(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) side chains were studied in various environmental conditions. Also micelle formation of cylindrical brush-coil blockcopolymers with polyacrylic acid side chains and polystyrene coil have been visualized. In chapter 6 the mechanical properties of single cylindrical polymer brushes with (PNIPAM) side chains were investigated. Assuming that the brushes adopt equilibrium conformation on the surface, an average persistence length of lp= (29 ± 3) nm was determined by the end-to-end distance vs. contour length analysis in terms of the wormlike chain (WLC) model. Stretching experiments suggest that an exact determination of the persistence length using force extension curves is impeded by the contribution of the side chains. Modeling the stretching of the bottle brush molecule as extension of a dual spring (side chain and main chain) explains the frequently observed very low persistence length arising from a dominant contribution of the side chain elasticity at small overall contour lengths. It has been shown that it is possible to estimate the “true” persistence length of the bottle brush molecule from the intercept of a linear extrapolation of the inverse square root of the apparent persistence length vs. the inverse contour length plot. By virtue of this procedure a “true” persistence length of 140 nm for the PNIPAM brush molecules is predicted. Chapter 7 and 8 deal with the force-extension behavior of PNIPAM cylindrical brushes studied in poor solvent conditions. The behavior is shown to be qualitatively different from that in a good solvent. Force induced globule-cylinder conformational changes are monitored using “molecule specific force spectroscopy” which is a combined AFM imaging and SMFS technique. An interesting behavior of the unfolding-folding transitions of single collapsed PNIPAM brush molecules has been observed by force spectroscopy using the so called “fly-fishing” mode. A plateau force is observed upon unfolding the collapsed molecule, which is attributed to a phase transition from a collapsed brush to a stretched conformation. Chapter 9 describes the desorption behavior of single cylindrical polyelectrolyte brushes with poly-L-lysine side chains deposited on a mica surface using the “molecule specific force spectroscopy” technique to resolve statistical discrepancies usually observed in SMFS experiments. Imaging of the brushes and inferring the persistence length from a end-to-end distance vs. contour length analysis results in an average persistence length of lp = (25 ± 5) nm assuming that the chains adopt their equilibrium conformation on the surface. Stretching experiments carried out on individual poly-L-lysine brush molecules by force spectroscopy using the “fly-fishing” mode provide a persistence length in the range of 7-23 nm in reasonable accordance with the imaging results. In chapter 10 the conformational behavior of cylindrical poly-L-lysine brush-sodium dodecyl sulfate complexes was studied using AFM imaging. Surfactant induced cylinder to helix like to globule conformational transitions were observed.

Statistical mechanics of protein complexed and condensed DNA

In this thesis I treat various biophysical questions arising in the context of complexed / ”protein-packed” DNA and DNA in confined geometries (like in viruses or toroidal DNA condensates). Using diverse theoretical methods I consider the statistical mechanics as well as the dynamics of DNA under these conditions. In the first part of the thesis (chapter 2) I derive for the first time the single molecule ”equation of state”, i.e. the force-extension relation of a looped DNA (Eq. 2.94) by using the path integral formalism. Generalizing these results I show that the presence of elastic substructures like loops or deflections caused by anchoring boundary conditions (e.g. at the AFM tip or the mica substrate) gives rise to a significant renormalization of the apparent persistence length as extracted from single molecule experiments (Eqs. 2.39 and 2.98). As I show the experimentally observed apparent persistence length reduction by a factor of 10 or more is naturally explained by this theory. In chapter 3 I theoretically consider the thermal motion of nucleosomes along a DNA template. After an extensive analysis of available experimental data and theoretical modelling of two possible mechanisms I conclude that the ”corkscrew-motion” mechanism most consistently explains this biologically important process. In chapter 4 I demonstrate that DNA-spools (architectures in which DNA circumferentially winds on a cylindrical surface, or onto itself) show a remarkable ”kinetic inertness” that protects them from tension-induced disruption on experimentally and biologically relevant timescales (cf. Fig. 4.1 and Eq. 4.18). I show that the underlying model establishes a connection between the seemingly unrelated and previously unexplained force peaks in single molecule nucleosome and DNA-toroid stretching experiments. Finally in chapter 5 I show that toroidally confined DNA (found in viruses, DNAcondensates or sperm chromatin) undergoes a transition to a twisted, highly entangled state provided that the aspect ratio of the underlying torus crosses a certain critical value (cf. Eq. 5.6 and the phase diagram in Fig. 5.4). The presented mechanism could rationalize several experimental mysteries, ranging from entangled and supercoiled toroids released from virus capsids to the unexpectedly short cholesteric pitch in the (toroidaly wound) sperm chromatin. I propose that the ”topological encapsulation” resulting from our model may have some practical implications for the gene-therapeutic DNA delivery process.

Multichromophore Systeme auf Basis von Rylencarbonsäureimiden

Die Leistung multichromophorer Systeme geht oftmals über die der einzelnen Chromophor-Einheiten hinaus. Ziel der vorliegenden Dissertation mit dem Titel „Multichromophore Systeme auf Basis von Rylencarbonsäureimiden“ war daher die Synthese und Charakterisierung multichromophorer Molekülarchitekturen. Die verwendeten Rylenfarbstoffe zeichnen sich durch hohe photochemische Stabilitäten sowie nahezu quantitative Fluoreszenzquantenausbeuten aus. Die optischen und elektronischen Eigenschaften multichromophorer Systeme hängen stark von der geometrischen Ordnung ab, in der die Farbstoffe zueinander stehen. Daher wurden für den Einbau formpersistente Gerüststrukturen gewählt. Der erste Teil der Arbeit beschäftigt sich mit dem Einbau ein und desselben Chromophortyps und hat neben dem Verständnis von Chromophor-Wechselwirkungen vor allem die Erhöhung des Absorptionsquerschnitts und der Fluoreszenzintensität zum Ziel. Als Gerüststruktur dienen dabei Polyphenylen-Dendrimere, Ethinyl-verbrückte Dendrimere sowie Übergangsmetall-vermittelte supramolekulare Strukturen. Aufgrund der hohen Farbstoffanzahl, des ortsdefinierten Einbaus und den hohen Fluoreszenzquantenausbeuten eignen sich diese multichromophoren Systeme als Fluoreszenzsonden und als Einzelphotonenemitter. Im zweiten Teil der Arbeit werden verschiedene Chromophortypen zu multichromophoren Systemen verknüpft, mit deren Hilfe ein vektorieller Energietransfer möglich ist. Mit Hinsicht auf die Verwendung in photovoltaischen Zellen wurde eine dendritische Triade dargestellt. Eine lineare Variante einer Rylen-Triade stellt einen molekularen Draht dar, deren Brückenelement durch eine geeignete Syntheseführung verlängert und der Energietransport daher abstandsabhängig untersucht werden kann.

Atomic force microscopy of biomimetic systems

This thesis was driven by the ambition to create suitable model systems that mimic complex processes in nature, like intramolecular transitions, such as unfolding and refolding of proteins, or intermolecular interactions between different cell compo-nents. Novel biophysical approaches were adopted by employing atomic force mi-croscopy (AFM) as the main measurement technique due to its broad diversity. Thus, high-resolution imaging, adhesion measurements, and single-molecule force distance experiments were performed on the verge of the instrumental capabilities. As first objective, the interaction between plasma membrane and cytoskeleton, me-diated by the linker protein ezrin, was pursued. Therefore, the adsorption process and the lateral organization of ezrin on PIP2 containing solid-supported membranes were characterized and quantified as a fundament for the establishment of a biomimetic model system. As second component of the model system, actin filaments were coated on functionalized colloidal probes attached on cantilevers, serving as sensor elements. The zealous endeavor of creating this complex biomimetic system was rewarded by successful investigation of the activation process of ezrin. As a result, it can be stated that ezrin is activated by solely binding to PIP2 without any further stimulating agents. Additional cofactors may stabilize and prolong the active conformation but are not essentially required for triggering ezrin’s transformation into an active conformation. In the second project, single-molecule force distance experiments were performed on bis-loop tetra-urea calix[4]arene-catenanes with different loading rates (increase in force per second). These macromolecules were specifically designed to investigate the rupture and rejoining mechanism of hydrogen bonds under external load. The entangled loops of capsule-like molecules locked the unbound state of intramolecular hydrogen bonds mechanically, rendering a rebinding observable on the experimental time scale. In conjunction with Molecular Dynamics simulations, a three-well potential of the bond rupture process was established and all kinetically relevant parameters of the experiments were determined by means of Monte Carlo simulations and stochastic modeling. In summary, it can be stated that atomic force microscopy is an invaluable tool to scrutinize relevant processes in nature, such as investigating activation mechanisms in proteins, as shown by analysis of the interaction between F-actin and ezrin, as well as exploring fundamental properties of single hydrogen bonds that are of paramount interest for the complete understanding of complex supramolecular structures.

Eigenschaften von thermoresponsiven Bürstenpolymeren

In dieser Doktorarbeit werden die Eigenschaften von thermoresponsiven Bürstenpolymeren untersucht. Hierbei konnten erstmalig thermische Konformationsübergänge von zylindrischen Bürstenmolekülen auf Oberflächen beobachtet werden. Der Einfluss der Oberfläche auf die Umkehrbarkeit und die Kinetik der Übergänge wurde untersucht. Die dabei erhaltenen Erkenntnisse konnten verwendet werden, um das Verhalten der Polymere auf anderen Oberflächen vorherzusagen. Im zweiten Projekt wurde gezeigt, dass Einzelmolekül-Kraftspektroskopie eine gute Methode für die Untersuchung der mechanischen Eigenschaften von Bürstenpolymeren in guten Lösungsmitteln ist. Mit kleinen Substanzmengen kann die Persistenzlänge der Polymere bestimmt werden. Es ist möglich zu zeigen, dass die Persistenzlänge der Polymerbürsten von ihrer Seitenkettenlänge abhängt. Überraschenderweise funktioniert das Experiment nicht, wenn man die Bürsten aus einem Polymerfilm zieht anstatt ein Einzelmolekülexperiment durchzuführen. In diesem Fall zeigen die Kraft-Abstands-Kurven zu lange Kontur- und Persistenzlängen. Diese Beobachtung ist für lineare Polymere nicht gültig. Im dritten Teil der Doktorarbeit werden Kraft-Abstands-Experimente an einzelnen kollabierten Polymeren untersucht. In schlechten Lösungsmitteln zeigen die Bürsten ein moleküllängenabhängiges Kraft-Plateau, welches theoretisch vorausgesagt wurde und einen Phasenübergang von einem kollabierten zu einem entspannten Zustand der Polymerkette anzeigt. In Fly-Fishing-Experimenten kann man eine Hysterese zwischen den beiden Messkurven beobachten, welche bei mehrfachem Ziehen kleiner wird. Alle Experimente in schlechten Lösungsmitteln wurden mit linearen Polymeren reproduziert, um den Einfluss der Molekülarchitektur von den generellen Eigenschaften von Polymeren in schlechten Lösungsmitteln unterscheiden zu können. Zum Abschluss wird die Abhängigkeit der Polymerentfaltung von der Laderate des Experiments gemessen.

Design, synthesis and application of ultrastable rylene dyes for fluorescent labeling of biomolecules

Studies of organic fluorescent dyes are experiencing a renaissance related to the increasing demands posed by new microscopy techniques for high resolution and high sensitivity. While in the last decade single molecule equipment and methodology has significantly advanced and in some cases reached theoretical limits (e.g. detectors approaching unity quantum yields) unstable emission from chromophores and photobleaching become more and more the bottleneck of the advancement and spreading of single-molecule fluorescence studies. The main goal of this work was the synthesis of fluorophores that are water-soluble, highly fluorescent in an aqueous environment, have a reactive group for attachment to a biomolecule and posses exceptional photostability. An approach towards highly fluorescent, water-soluble and monofunctional perylene-3,4,9,10-tetracarboxdiimide and terrylene-3,4:11,12-tetra carboxidiimide chromophores was presented. A new synthetic strategy for the desymmetrization of perylenetetracarboximides was elaborated; water-solubility was accomplished by introducing sulfonyl substituents in the phenoxy ring. Two strategies have been followed relying on either non-specific or site specific labeling. For this purpose a series of new water-soluble monofunctional perylene and terrylene dyes, bearing amine or carboxy group were prepared. The reactivity and photophysical properties of these new chromophores were studied in aqueous medium. The most suitable chromophores were further derivatized with amine or thiol reactive groups, suitable for chemical modification of proteins. The performance of the new fluorescent probes was assessed by single molecule enzyme tracking, in this case phospholipase acting on phospholipid supported layers. Phospholipase-1 (PLA-1) was labeled with N-hydroxysuccinimide ester functionalized perylene and terrylene derivatives. The purification of the conjugates was accomplished by novel convenient procedure for the removal of unreacted dye from labeled enzymes, which involves capturing excess dye with a solid support. This novel strategy for purification of bioconjugates allows convenient and fast separation of labeled proteins without the need for performing time consuming chromatographic or electrophoretic purification steps. The outstanding photostability of the dyes and, associated therewith, the extended survival times under strong illumination conditions allow a complete characterization of enzyme action on its natural substrates and even connecting enzyme mobility to catalytic activity. For site-specific attachment of the rylene dyes to proteins the chromophores were functionalized with thioesters or nitrilotriacetic acid groups. This allowed attachment of the emitters to the N-terminus of proteins by native chemical ligation or complexation with His-tagged polypeptides at the N- or C-termini, respectively. The synthesis of a water-soluble perylenebis (dicarboximide) functionalized with a thioester group was presented. This chromophore exhibits an exceptional photostability and a functional unit for site-specific labeling of proteins. The suitability of the fluorophore as a covalent label was demonstrated via native chemical ligation with protein containing N-terminal cystein residue. We exploited also oligohisitidine sequences as recognition elements for site-selective labeling. The synthesis of a new water-soluble perylene chromophore, containing a nitrilotriacetic acid functional group was demonstrated, using solution-phase and solid-phase approaches. This chromophore combines the exceptional photophysical properties of the rylene dyes and a recognition unit for site-specific labeling of proteins. An important feature of the label is the unchanged emission of the dye upon complexation with nickel ions.

Terrylendiimide als Biolabel und funktionelle Farbstoffe

In dieser Arbeit werden neue Rylenimide und Anwendungsmöglichkeiten für diese Farbstoffklasse beschrieben, die sich durch hohe Photostabilitäten und hohe Fluoreszenzquantenausbeute auszeichnet. Ziel dieser Arbeit war es, durch systematische Wahl der Substituenten in den Imidstrukturen und/oder den bay-Regionen von Rylendiimidfarbstoffen vollkommen neue Produkteigenschaften zu verwirklichen, Reaktionen bzw. Anwendungen zu ermöglichen und den Aufbau von komplexeren Chromophorarchitekturen zu gestatten. Das Strukturmotiv des Terrylendiimids nahm dabei die zentrale Rolle ein. Die Arbeit wurde in vier Kapitel aufgeteilt. Das Ziel des ersten Kapitels war es, wasserlösliche Terrylendiimide zur Untersuchung von biologischen Proben im Wellenlängenbereich über 600 nm einzusetzen. Ein wasserlösliches Terrylendiimid erwies sich dabei als deutlich photostabiler als zwei weitverbreitete Fluoreszenzfarbstoffe. Eine erste Proteinmarkierung mit monofunktionellem Farbstoff wurde an Proteinmolekülen erfolgreich durchgeführt. Durch gezielte Modifikationen konnten zwei Terrylendiimide hergestellt werden, die sich noch deutlich besser zum Abbilden von Zellstrukturen eignen. In dem zweiten Kapitel spielte die Löslichkeit von Rylendiimiden in organischen Lösungsmitteln eine zentrale Rolle. Es wurde eine Rylendiimidserie hergestellt, deren löslichkeitssteigernde Gruppen eine Organisation der Moleküle in ausgedehnten Stapelstrukturen nicht verhindern. Mit dieser Serie konnte das flüssigkristalline Verhalten und die Selbstorganisation in der Rylendiimidreihe untersucht werden. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurde die Selbstorganisation der Diimide in Donor-Akzeptor Gemischen untersucht. In STM-Experimenten konnten für alle drei Diimide selbstorganisierte Monoschichten mit dem Rastertunnelmikroskop mit molekularer Auflösung abgebildet werden. Darüber hinaus wurden in diesem Kapitel die ersten organischen Feldeffekttransistoren (OFET) auf der Basis des synthetisierten Terrylendiimids beschrieben. Im Rahmen eines Projektes in dem die elektronische Energieübertragung in Donor-Akzeptor-Diaden mit Hilfe von Einzelmolekülspektroskopie untersucht wird, wurde eine Perylendiimid-Terrylediimid Diade hergestellt. Die geringere Photostabilität des Donors ermöglichte zeitaufgelöste Einzelmolekül-messungen der Akzeptoremission mit und ohne Energietransfer vom Donor auf den Akzeptor. Durch diese Messungen konnten die Zeitkonstanten des Energietransfers für einzelne Diaden ermittelt werden. Ein weiterer Chromophor aus diesem Donor-Akzeptor-Paar soll die Möglichkeit eröffnen, den Energiefluß im Molekül gezielt zu manipulieren. Dazu wurde ein Donorchromophor mit zwei Akzeptoren in einem Multichromophor kombiniert. Im Rahmen der Synthesen dieser Arbeit wurden Terrylendiimide hergestellt, die in einer Imidstruktur eine Halogenfunktion trugen. Diese waren wichtige Synthesebausteine zum Aufbau von komplexen Chromophorarchitekturen. Ziel eines weiteren Kapitels war es, ein Terrylendiimid herzustellen, das als Sensibilisatorfarbstoff gemeinsam mit dem Haupt-Antennenkomplex von höheren Pflanzen LHCII in einer photoelektrochemischen Farbstoff-Solarzelle integriert werden konnte. Das hergestellte Terrylendiimid mit Carbonsäuregruppe eignete sich für Farbstoffsolarzellen auf Zinndioxidbasis.

The collapse of linear polyelectrolyte chains in a poor solvent: When does a collapsing polyelectrolyte collect its counter ions?

The collapse of linear polyelectrolyte chains in a poor solvent: When does a collapsing polyelectrolyte collect its counter ions? The collapse of polyions in a poor solvent is a complex system and is an active research subject in the theoretical polyelectrolyte community. The complexity is due to the subtle interplay between hydrophobic effects, electrostatic interactions, entropy elasticity, intrinsic excluded volume as well as specific counter-ion and co-ion properties. Long range Coulomb forces can obscure single molecule properties. The here presented approach is to use just a small amount of screening salt in combination with a very high sample dilution in order to screen intermolecular interaction whereas keeping intramolecular interaction as much as possible (polyelectrolyte concentration cp ≤ 12 mg/L, salt concentration; Cs = 10^-5 mol/L). This is so far not described in literature. During collapse, the polyion is subject to a drastic change in size along with strong reduction of free counterions in solution. Therefore light scattering was utilized to obtain the size of the polyion whereas a conductivity setup was developed to monitor the proceeding of counterion collection by the polyion. Partially quaternized PVP’s below and above the Manning limit were investigated and compared to the collapse of their uncharged precursor. The collapses were induced by an isorefractive solvent/non-solvent mixture consisting of 1-propanol and 2-pentanone, with nearly constant dielectric constant. The solvent quality for the uncharged polyion could be quantified which, for the first time, allowed the experimental investigation of the effect of electrostatic interaction prior and during polyion collapse. Given that the Manning parameter M for QPVP4.3 is as low as lB / c = 0.6 (lB the Bjerrum length and c the mean contour distance between two charges), no counterion binding should occur. However the Walden product reduces with first addition of non solvent and accelerates when the structural collapse sets in. Since the dielectric constant of the solvent remains virtually constant during the chain collapse, the counterion binding is entirely caused by the reduction in the polyion chain dimension. The collapse is shifted to lower wns with higher degrees of quaternization as the samples QPVP20 and QPVP35 show (M = 2.8 respectively 4.9). The combination of light scattering and conductivity measurement revealed for the first time that polyion chains already collect their counter ions well above the theta-dimension when the dimensions start to shrink. Due to only small amounts of screening salt, strong electrostatic interactions bias dynamic as well as static light scattering measurements. An extended Zimm formula was derived to account for this interaction and to obtain the real chain dimensions. The effective degree of dissociation g could be obtained semi quantitatively using this extrapolated static in combination with conductivity measurements. One can conclude the expansion factor a and the effective degree of ionization of the polyion to be mutually dependent. In the good solvent regime g of QPVP4.3, QPVP20 and QPVP35 exhibited a decreasing value in the order 1 > g4.3 > g20 > g35. The low values of g for QPVP20 and QPVP35 are assumed to be responsible for the prior collapse of the higher quaternized samples. Collapse theory predicts dipole-dipole attraction to increase accordingly and even predicts a collapse in the good solvent regime. This could be exactly observed for the QPVP35 sample. The experimental results were compared to a newly developed theory of uniform spherical collapse induced by concomitant counterion binding developed by M. Muthukumar and A. Kundagrami. The theory agrees qualitatively with the location of the phase boundary as well as the trend of an increasing expansion with an increase of the degree of quaternization. However experimental determined g for the samples QPVP4.3, QPVP20 and QPVP35 decreases linearly with the degree of quaternization whereas this theory predicts an almost constant value.

Biomimetic bilayer membranes made from polymers and lipids

Amphiphile Blockcopolymere sind in der Lage in Wasser Morphologien auszubilden, die analog sind zur hydrophil-hydrophob-hydrophil-Struktur von natürlichen Lipiddoppelschichten. In dieser Arbeit wird zum ersten Mal die Präparation und Charakterisierung von oberflächengestützten Polymerdoppelschichten aus Polybutadien-b-Polyethylenoxid (PB-PEO) beschrieben. Für die Herstellung dieser Strukturen wurden zwei unterschiedliche Präparationsstrategien verfolgt. Der erste Weg besteht aus einer zweistufigen Methode, bei der im ersten Schritt organisierte Monoschichten mittels Langmuir-Blodgett-Transfer auf Gold übertragen und kovalent angebunden werden. Im zweiten Schritt werden hydrophobe Wechselwirkungen ausgenutzt, um über Langmuir-Schaefer-Transfer eine weitere Schicht aufzubringen. Somit wurden homogene Architekturen erzeugt, die oberflächengestützten Lipiddoppelschichten gleichen. Als alternativer, einstufiger Ansatz zur Herstellung von Polymerdoppelschichten wurde das Spreiten von Polymervesikeln auf Gold verfolgt. Auch hierdurch ließen sich Doppelschichtstrukturen mit einer vollständigen Oberflächenbedeckung erzeugen. Die hergestellten Polymerdoppelschichten besitzen eine Dicke von 11-14 nm, die von der Präparationsmethode abhängt. Die Polymerstrukturen weisen bei Trocknung für 1.5 h eine Stabilität gegenüber Luft auf. Bei längeren Trocknungszeiten von ca. 12 h kommt es zu einer Reorganisation der Oberfläche. Dies deutet darauf hin, dass Wasser dazu notwendig ist die Strukturen auf lange Sicht zu stabilisieren. Um die Biokompatibilität der Polymerschichten nachzuweisen, wurden die Wechselwirkungen mit dem membranaktiven Peptid Polymyxin B und dem Transmembranprotein α-Haemolysin gezeigt. Mobilität ist ein wichtiger Faktor für die korrekte Funktion vieler Transmembranproteine. Um die laterale Diffusionsdynamik innerhalb der künstlichen Strukturen zu untersuchen, wurde die Mobilität eines integralen Modellpeptids und von fluoreszierenden Membransonden gemessen. Es konnte mit einzelmolekülempfindlichen Techniken gezeigt werden, dass das α-helikale Peptid und die kleinen Fluoreszenzfarbstoffe frei im hydrophoben Kern der Polymerdoppelschicht diffundieren können. Die Diffusion von beiden Spezies scheint stark von der Fluidität der Polymermatrix beeinflusst zu sein. Ein weiterer Teil dieser Arbeit widmet sich der Entwicklung eines angemessenen, lipidbasierten Referenzsystems für zukünftige Proteinuntersuchungen. Hierzu wurde eine neue Methode zu Herstellung von peptidgestützten Lipiddoppelschichtmembranen entwickelt. Dies wurde durch kovalente Befestigung eines Thiopeptids an einen Goldfilm und darauffolgende Anbindung eines Lipids erreicht. Zur Ausbildung der Lipiddoppelschicht auf dem Lipopeptidunterbau wurder der Rapid Solvent Exchange verwendet. Die Ausbildung der Lipiddoppelschicht wurde sowohl auf microskopischer als auch auf makroskopischer Ebene nachgewiesen. Im letzten Schritt wurde die Anwendbarkeit des Modelsystems für elektrochemische Messungen durch den funktionalen Einbau des Ionentransporters Valinomycin unter Beweis gestellt.