Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie und -Spektroskopie von Sauerstofftransportproteinen

In dieser Arbeit wurde die intrinsische Tryptophanfluoreszenz von Proteinen nach Zwei-Photonen-Anregung untersucht. Als interessantes Modellsystem wurde das Sauerstofftransportprotein der Vogelspinne <i>Eurypelma californicum</i> gewählt. Zum einen besitzt das Protein 148 Tryptophan-Seitenketten, so daß deren geringer Absorptionsquerschnitt kompensiert werden kann und eventuell einzelne Proteine aufgrund ihrer Tryptophanfluoreszenz detektiert werden können. Zum anderen signalisiert diese Fluoreszenz die Sauerstoffbeladung, so daß die kooperative Sauerstoffbindung auf Einzelmolekülebene untersucht werden könnte. Als limitierender Faktor hat sich die Photostabilität der Tryptophane nach Zwei-Photonen-Anregung herausgestellt. Im Mittel können von einem Hämocyanin-Molekül drei Photonen detektiert werden, bevor alle 148 Tryptophan-Seitenketten geblichen sind. Dies ist ein für Einzelmolekülspektroskopie äußerst niedriger Wert. Trotz dieser geringen Photostabilität ist es zum erstem Mal gelungen, die Diffusion einzelner Proteine mit Hilfe ihrer intrinsischen Tryptophanfluoreszenz zu beobachten. Wenn in einer geeigneten Umgebung die Photostabilität der Tryptophane höher ist, so reicht die Zahl der detektierten Photonen aus, um einzelne Teilchen abzubilden. Überraschend hat sich ergeben, daß es möglich ist, durch Lichteinstrahlung von außen in das Sauerstoffbindungsgleichgewicht einzugreifen und die Reaktion des Proteins auf die Auslenkung aus dem Gleichgewichtszustand zu beobachten. Das intensitätsabhängige Sauerstoffbindungsverhalten wurde modelliert und an die Messungen angepaßt. Die lichtinduzierte Sauerstoffabgabe führt anscheinend nicht zu einem Konformationswechsel.

In this work the intrinsic tryptophan (Trp) fluorescence of proteins after two photon excitation was examined. As model system the oxygen transport protein of <i>Eurypelma californicum</i> was selected. On the one hand the protein consists of 148 Trp residues, so that their small absorption cross section can be compensated and possibly individual proteins could be detected due to their intrinsic fluorescence. On the other hand this fluorescence signals the oxygen load, so that the cooperative oxygen binding could be examined on the single molecule level. The limiting factor is the photostability of the Trp after two photon excitation. On average three photons can be detected from a Hemocyanin molecule before all 148 Trp bleached. Despite this low photostability for the first time the diffusion of individual proteins was observed due to the intrinsic Trp fluorescence. If in a suitable environment the photostability of the Trp is higher, then imaging of individual particles becomes possible. Surprisingly it resulted that it is possible to change the oxygen binding equilibrium by irradiation of light. The intensity-dependent oxygen binding behavior was modelled and fitted to the measurements. The light-induced oxygen release apparently does not lead to a change in conformation.