Deteção eletroquímica da norfloxacina e trimetoprim em amostras de urina utilizando polímero molecularmente impresso modificado e grafeno

A norfloxacina e o trimetoprim são dois antibióticos antibacterianos usados para o tratamento de infeções urinárias, intestinais e respiratórias. A maioria dos fármacos exige uma dosagem que garanta os níveis de segurança e eficácia de atuação. A necessidade de dosear os medicamentos e os seus metabolitos é assim um controlo imperioso e em muitos casos regular no tratamento de um paciente. Neste trabalho desenvolveram-se dois sensores eletroquímicos para a deteção da norfloxacina (NFX) e do trimetoprim (TMP), usando como superfície de suporte o carbono vítreo. A busca de novos materiais que conferiram maior seletividade e sensibilidade aos sistemas de deteção e por outro lado apresentem menores riscos para o paciente quando usados em dispositivos que permitam uma análise point-of-care, é especialmente importante e pode ser uma parte crucial do processo de decisão clínica. Assim, os polímeros molecularmente impresos enquadram-se nesse perfil e o seu uso tem vindo a ser cada vez mais avaliado. A impressão molecular é uma tecnologia capaz de produzir polímeros que incorporam as moléculas do analito e que após remoção por solventes específicos, permitem dotá-los de locais específicos de reconhecimento estereoquímico. A seleção do pirrol como polímero molecularmente impresso (MIP) permitiu construir com sucesso os sensores para doseamento dos antibióticos. A fim de aumentar a sensibilidade do método incorporou-se grafeno na superfície do elétrodo. Este material tem vindo a ser largamente utilizado devido às suas propriedades: estrutura molecular, condutividade elétrica e aumento da superfície são algumas das características que mais despertam o interesse para a sua aplicação neste projeto. Os sensores desenvolvidos foram incorporados em sistemas eletroquímicos. Os métodos voltamétricos aplicados foram a voltametria cíclica, a voltametria de onda quadrada e ainda a impedância. As condições de análise foram otimizadas no que respeita à polimerização do pirrol (concentração do polímero, número de ciclos de eletropolimerização e respetivos potenciais aplicados, tempo de incubação, solvente de remoção do analito), ao pH da solução do fármaco, à gama de concentrações dos antibióticos e aos parâmetros voltamétricos dos métodos de análise. Para cada um dos antibióticos um elétrodo não-impresso foi também preparado, usando o procedimento de polimerização mas sem a presença da molécula do analito, e foi usado como controlo. O sensor desenvolvido para o trimetoprim foi usado no doseamento do fármaco em amostras de urina. As amostras foram analisadas sem qualquer diluição, apenas foram centrifugadas para remoção de proteínas e algum interferente. Os sensores construídos apresentaram comportamento linear na gama de concentrações entre 102 e 107 mol/L. Os resultados mostram boa precisão (desvios padrão inferiores a 11%) e os limites de deteção foram de 8,317 e 1,307 mol/L para a norfloxacina e o trimetoprim, respetivamente. Para validação do método foram ainda efetuados ensaios de recuperação tendo obtido valores superiores a 94%.

Clonagem funcional como metodologia na identificação de marcadores de virulência de Leishmania (Viannia) braziliensis

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Biotecnologia.

Tratamento da esquistossomose mansônica hepatesplênica com praziquantel

Noventa e quatro pacientes, 22 do sexo masculino e 72 do feminino, com idades variando de 11 a 71 anos, média de 25, apresentando a forma hepatesplênica da esquistossomose mansônica, foram tratados com uma nova droga antiesquistossomótica — praziquantel — objetivando-se investigar sua eficácia e tolerância. Duas doses orais — 1 x 30 e 2 x 25 mg/kg — foram comparadas. Efeitos colaterais foram verificados durante os primeiros dois dias seguintes à administração da droga, mas usualmente de média intensidade e curta duração. Os mais freqüentes e, por vezes, mais severos foram: dor ou desconforto abdominal, diarréia, tontura, cefaléia e náusea. Febre esteve presente em 19,2% dos casos e urticaria e prurido em dois pacientes. A investigação laboratorial mostrou, em alguns casos, ligeiras alterações enzimáticas (AST, ALT, γ-GT) 24 horas após a medicação. Nenhuma modificação da urinálise, da glicose sangüínea e dos dados hematológicos foi detectada, exceto o aumento comumente observado dos eosinófilos nos 7." e 30.° dias, relacionado à morte dos parasitas dentro do organismo. Da mesma forma, nenhuma anormalidade foi verificada no estudo eletroencefalográfico. Na eletrocardiografia, observou-se, em duas pacientes, uma ligeira e transitória alteração na repolarização ventricular. No que diz respeito à cura parasitológica, constatou-se, em 62 pacientes que concluíram seis meses de controle, um porcentual global de cura de 80,6%, sendo de 76,7% com a dose de 30 mg/lkg e de 84,4% com a de 2 x 25 mg/kg. Os pacientes não curados tiveram, por outro lado, uma acentuada redução no número de ovos do S. mansoni eliminados nas fezes. Além disso, cinco pacientes não curados, foram retratados seis ou mais meses depois, com a mesma dose inicial, obtendo-se 100°/o de negatividade nos exames de fezes. Os Autores acreditam que com a administração de doses um pouco mais altas como, por exemplo, 60 mg/kg, se possa obter um maior porcentual de cura, sem prejuízo da boa tolerância. A melhora clínica e laboratorial a longo prazo, isto é, seis ou mais meses após a medicação, foi marcante em todos os parâmetros estudados.

Placentite chagásica apresentação de um caso com estudo à microscopia óptica e eletrônica

Novo caso de placentite chagásica no Triângulo Mineiro, observou-se, à mioroscopia óptica, o parasitismo de miócitos das paredes vasculares, fato não descrito anteriormente na literatura. O estudo à microscopia eletrônica revelou. (1) abundantes amastigotas do Trypanosoma cruzi em células de Hofbauer; (2) proliferação fibroblástica e colágena na parede de pequenas artérias e arteríolas, ocluindo-lhes, por vezes, o lume; (3) parasitas em células musculares degeneradas e fibroblastos da parede vascular. Este é o primeiro relato de placentite chagásica humana com análise ultra-estrutural.

Interação entre Trypanosoma cruzi e macrófagos: diferenças entre tripomastigotas sangüí-colas e de cultivo de tecidos

Macrófagos obtidos do peritoneo de camundongos após estímulo, com peptona, foram cultivados em lamínulas, infectados com tripomastigotas das cepas F e Y de T. cruzi, obtidos de cultivo de tecidos ou do sangue de camundongos infectados. Os parasitas, obtidos de cultivo de tecidos, tanto da cepa Y como os da cepa F, são interiorizados por macrófagos em proporção muito mais elevada do que os sanguícolas. Parasitas de cultivo de tecidos incubados com soro de camundongos normais, ou soro híperimune específico em diluição sub-aglutinante, comportam-se essencialmente como parasitas não opsonizados. Foram observadas diferenças a nível ultraestrutural na fase inicial de interação entre macrófagos e tripomastigotas das duas origens. Após 30 minutos, tripomastigotas de cultivo de tecidos localizam-se em agrupamentos na área de contato com os macrófagos. Enquanto os tripomastigotas sanguícolas estão na maioria das vezes no interior de vacúolos fagocíticos largos, após 3 horas de interação os tripomastigotas de cultura situam-se em um único vacúolo estreito. Tanto as formas de cultivo de tecidos quanto os tripomastigotas sanguícolas da cepa Y multiplicam-se em macrófagos; os tripomastigotas sanguícolas da cepa F são destruídos no interior da célula hospedeira, enquanto os tripomastigotas de cultivo de tecidos desta cepa são capazes de multiplicar-se.

Holochilus brasiliensis nanus Thomas, 1897: sugestão de modelo experimental para filariose, leishmaniose e esquistossomose

Roedores silvestres, classificados como Holochilus brasiliensis nanus Thomas,1897, foram capturados na cidade de São Bento, pertencente à Região da Baixada, do Estado do Maranhão, Brasil, naturalmente infectados com formas adultas de filaria, na cavidade peritoneal, e microfilárias sangüíneas, assim como, com esquistossoma mansoni (vermes adultos e granulomas peri-ovulares hepáticos; intestinais; pulmonares; esplênicos e pancreáticos). Animais nascidos em Biotério, descendentes de Holochilus da Região da Baixada, foram infectados experimentalmente com Leishmania m. amazonensis e Schistosoma mansoni. Em observações semanais, foram encontradas lesões teciduais, semelhantes às que se desenvolvem em hamsters infectados com Leishmania, e hipergamaglobulinemia. Nos esquistossomóticos, foram constatadas hipergamaglobulinemia e reações granulomatosas similares às encontradas nos animais infectados naturalmente. Foram observadas, também, lesões hepática graves, semelhantes às encontradas na esquistossomose humana. Estes achados sugerem a utilização do Holochilus b. nanus como modelo experimental destas três doenças tropicais.

Suscetibilidade de "híbridos" de Biomphalaria tenagophila à cepa LE (BH) do Schistosoma mansoni

"Híbridos" de Biomphalaria tenagophila provenientes dos cruzamentos de linhagens albinas de Belo Horizonte (BH) ou de Joinvile (SC), com melânicos de Cabo Frio (CF), do Taim (Ta) ou de Curitiba (PR), submetidos à infecção pela cepa do Schistosoma mansoni de Belo Horizonte (=LE), apresentaram os seguintes resultados: em F1, os "híbridos" TaSC, PRSC e CFTa exibiram taxas de 4,5%, 12,5% e 11,2% de suscetibilidade; em F2, todos os "híbridos" foram negativos e em F3, um exemplar albino, filho de (CFBH) ². TaBH se infectou com a LE. Dentre os controles, a B. glabrata apresentou taxas de 66,7 a 93,6% de suscetibilidade à LE e a B. tenagophila de Joinvile exibiu taxas de infecção de 17,1 e 33,3% pela cepa SJ; e os "híbridos" BHTa e BHCF, taxas de 6,0 a 53,8% também pela cepa SJ. Houve grande influência da linhagem materna nas taxas de suscetibilidade. Devido ao fato de descendentes do cruzamento de linhagens refratárias a LE (CF, Ta e BH), terem se infectado, é recomendado o uso de "híbridos" para a detecção de gens de suscetibilidade em tais linhagens. São ainda discutidas, a necessidade do uso de maior número de miracídios nos testes de infecção e a falta de relação entre a freqüência de contatos parasitas-hospedeiros e as taxas de infectividade. Considerando que estas dependem de características genéticas preexistentes na população, a cepa LE seria uma variedade genética (ou raça) distinta da cepa SJ, dotada de pouca aptidão em infectar as diversas populações de B. tenagophila, exceto a de Joinvile (SC).

Demarcação da atividade anti-helmíntica do albendazol. Estudo referente à estrongiloidíase humana

Os Autores utilizaram novo anti-helmíntico, o albendazol, no tratamento de 32 pessoas com estrongiloidíase. A casuística foi composta por adultos, de ambos os sexos, que receberam, pela via oral, dose cotidiana única de 400 mg, repetida em três oportunidades intervaladas por períodos de 24 horas. O controle da terapêutica sucedeu através de exames das fezes realizados sete, 14 e 21 dias após o término da administração, tendo sido empregado o método de Rugai, Mattos e Brisola. A porcentagem de curas verificada correspondeu a 28,1% e, ao lado da boa tolerância observada, essa constatação demonstrou baixa eficácia do medicamento em apreço no combate à infecção causada pelo Strongyloldes stercoralis, a despeito de méritos comprovados em investigações anteriores e concernentes a outras parasitoses intestinais.

Schistosoma mansoni: infecção experimental de camundongos através da orelha e quantificação do parasitismo na pele

No presente trabalho, desenvolveu-se método de infecção de camundongos através da orelha e de recuperação de esquistossômulos resultantes dessas infecções. Cerca de 80% das cercarías postas em contacto com orelhas de camundongos penetraram. Destas, 30% foram recuperadas. como vermes adultos, do sistema porta. Da pele (das orelhas) as maiores recuperações de esquistossômulos ocorreram nos dois primeiros dias após a infecção. Os parasitas permaneceram nesse sítio por dois dias. No terceiro dia, os parasitas foram recuperados tanto da pele como dos pulmões. A partir do 4.° dia, foi predominante a recuperação de esquistossômulos ao nível dos pulmões. Do total de parasitas que potencialmente atingiriam o sistema porta, proporção elevada (73-80%) pode ser recuperada da pele, no segundo dia após a infecção, como esquistossômulos. Revelando-se apropriadas ao acesso, à migração no hospedeiro e às técnicas de recuperação de parasitas, sugere-se que orelhas de camundongos podem ser utilizadas como sítio de infecção para estudos que visem a análise parasitológica dos eventos iniciais da infecção em animais normais ou imunes.

Caracterização de cepas de plasmodium falciparum do Estado de Rondônia, Brasil, utilizando microtestes de sensibilidade aos antimaláricos, tipificação enzimática e anticorpos monoclonais

Nove amostras de Plasmodium falciparum foram coletadas de migrantes infectados no Estado de Rondônia. Estas amostras foram mantidas em cultivo para caracterização por tipificação enzimática em acetato de celulose, sensibilidade á cloroquina, amodiaquina, mefloquina e quinino e análise da diversidade antigê-nica através de anticorpos monoclonais específicos. Os resultados obtidos mostraram variação entre todas as amostras estudadas: encontrou-se resistência crescente à cloroquina, resistência intermediária à amodiaquina e quinino e sensibilidade a baixos níveis de mefloquina; apenas dois isolados mostraram sensibilidade a todas as drogas. A tipificação enzimática mostrou presença de parasitas GPI 1 e 2 e ADA 1 e 2, enquanto que para PEP e LDH todas as amostras foram do tipo 1. Sorotipagem com anticorpos monoclonais PSA mostrou presença de três sorotipos diferentes (II, III e IV). Estes resultados mostraram: a) variação entre as amostras para os marcadores analisados; b) nesta região, para o pequeno número de amostras analisadas, não foram observadas diferenças significativas ou novos tipos de parasitas.

Schistosoma mansoni: resistência cutânea em camundongos portadores de infecção primária

No presente trabalho avaliou-se a resistência cutânea de camundongos ao Schistosoma mansoni, usándose a orelha como sítio de infecção e de recuperação de esquistossômulos através da incubação de seus fragmentos em recipiente posto em contacto com Elac tamponado com Hepes. Essa técnica mostrou-se eficiente na discriminação do número de esquistossômulos recuperados de camundongos normais e de camundongos previamente infectados (camundongos imunes), quando comparada à técnica de recuperação de parasitas através da digestão da pele em meio contendo colagenase. Através dessa técnica, verificou-se que camundongos imunes reduzem o parasitismo do primeiro ao sétimo dia após a reinfecção (42 a 46%). Essa resistência foi observada em portadores de infecção bissexuada (6.* a 15.ª semanas) e unissexuada (33.* e 34.ª semanas) e em linhagens isogênicas (C57 BL/10, CBA e Fj do cruzamento CBA x DBA/2) e não isogênica (Swiss). Revelándose apropriadas ao estudo da resistência anti-esquistossomótica que se manifesta ao nível da pele, sugere-se que orelhas possam ser utilizadas como via de infecção em experimentos que visem analisar os fatores que participam da imunidade de camundongos ao S. mansoni.

Avaliação da atividade terapêutica do albendazol sobre infecções experimental e humana pela Hymenolepis nana

Com o intuito de demarcar convenientemente o espectro de atividade do albendazol, no que diz respeito às helmintíases intestinais, foram efetuadas observações referentes à himenolepíase causada por Hymenolepis nana. Nesse contexto, duas ordens de investigações tiveram lugar: a) tratamento de camundongos, renovado depois de transcorridos dez dias, por meio de doses únicas de 25 mg/kg ou 50 mg/kg, sendo que 25 mg/kg de praziquantel e animais que não receberam os antiparasitários, serviram como controles; b) tratamento de crianças e adultos mediante uso de 400 mg cotidianamente, em três oportunidades consecutivas, com repetição após intervalo com duração de dez dias. O estudo concernente aos animais revelou ineficácia do albendazol, pois sistematicamente houve verificação da persistência de vermes vivos no intestino. Por seu turno, só 10% dos indivíduos medicados puderam ser considerados curados. Portanto, pelo menos de acordo com a maneira como procedemos, o albendazol não se afigurou capaz de debelar satisfatoriamente a himenolepíase.

Leishmaniose cutânea experimental. III- Aspectos histopatológicos do comportamento evolutivo da lesão cutânea produzida em Cebus apella (Primates: Cebidae) por Leishmania (Viannia) lainsoni, L. (V.) braziliensis e L. (Leishmania) amazonensis

Estudaram-se os aspectos histopatológicos relativos à evolução da infecção experimental produzida em Cebus apella (Primates: Cebidae) por Leishmania (V.) lainsoni, L. (V.) braziliensis e L. (L.) amazonensis. O exame microscópico de biópsias seqüênciais, obtidas dos animais a intervalos definidos de tempo (a primeira, às 48 ou 72 horas após a inoculação, e as seguintes, a cada 30 dias), mostrou que o desenvolvimento das lesões, independentemente da espécie de Leishmania inoculada, passa por uma seqüência de etapas a nível tecidual - 1) infiltrado inespecífico crônico; 2) nódulo macrofágico (com numerosos parasitas); 3) necrose das células parasitadas; 4) granuloma epitelióide; 5) absorção da área necrosada (às vezes formando granuloma de corpo estranho); 6) infiltrado inespecífico crônico residual); e 7) cicatrização - que representaria a formação e a resolução das lesões. Discutiram-se também os prováveis mecanismos imunopatológicos que determinam esta seqüência de eventos e sua possível semelhança com a evolução das lesões na leishmaniose tegumentar humana.

Ação do sal de cozinha sobre o Toxoplasma gondii

O baixo resultado encontrado por nós no isolamento do Toxoplasma gondii de embutidos de carne de porco procedentes de Erechim (RS) (uma positiva em 40 amostras) levou-nos a pesquisar a ação do sal de cozinha, presente nesses embutidos, sobre taquizoitas e cistos do parasita. Foram obtidos exsudatos peritoneais (taquizoitas) e macerados de cérebros (cistos) de camundongos previamente inoculados com cepas de Toxoplasma gondii isoladas do material de Erechim. A este inóculo foi acrescentado sal de cozinha refinado, comum, nas concentrações de 2,2%, 2,5% e 3,0% habitualmente usadas no preparo dos embutidos. O tempo de exposição ao sal foi de 24 e 48 horas, 3-5 e 7 dias, a 4ºC, após o qual, camundongos albinos, machos, foram inoculados, por via intraperitoneal, com 0,5 ml desses inóculos, padronizados quanto ao número de parasitas. Os resultados mostraram que, nas concentrações de sal a 2,2%, 2,5% e 3,0% e exposições de 24 e 48 horas, todos os camundongos inoculados com taquizoitas mais sal morreram, menos um, provavelmente não infectado, (um sobrevivente em 28 inoculados). Na concentração de 3,0% e exposição durante 3-5 e 7 dias houve 10 sobreviventes em 37 animais inoculados (27%), sendo que com 5 e 7 dias, 7 de 15 camundongos sobreviveram (46,6%). Nos camundongos inoculados com cistos mais sal a 3,0% e exposições de 24, 48 e 72 horas, faltam anotações dos resultados; com exposições de 5 e 7 dias houve 17 sobreviventes e 3 mortos (85%). Camundongos-controles para cada grupo foram inoculados nas mesmas condições, porem sem o sal. A morte destes ocorreu em 100%, sempre, mais cedo do que a dos camundongos-testes. O toxoplasma foi recuperado do exsudato peritoneal e do cérebro dos camundongos recém-mortos e moribundos, mas nunca dos sobreviventes. Estes resultados evidenciam a ação inativante do sal de cozinha sobre o Toxoplasma gondii, na concentração de 3%, durante um mínimo de 3 dias e, possivelmente, explicam a raridade do isolamento do parasita nos embutidos de carne de porco salgada do inquérito de Erechim.

Avaliação do teste de imunofluorescência indireta para diagnóstico da filariose bancroftiana usando a microfilária de W. bancrofti como antígeno, em Recife-PE, Brasil

Analisou-se o teste de imunofluorescência indireta com microfilárias de W. bancrofti tratadas pela papaína, como antígeno, amplamente utilizado em Recife para o imunodiagnóstico da filariose linfática. Foram testados soros de 50 pacientes portadores das diversas formas clínicas da doença, incluindo microfilaremia assintomática, eosinofilia pulmonar tropical, elefantíase de membros inferiores, linfagite aguda e quilúria. Para o grupo controle, foram selecionados 50 indivíduos vivendo pelo menos há 5 anos em área endêmica, sem nenhuma evidencia clínica e/ou laboratorial da doença, constituindo os chamados endêmicos normais. A sensibilidade e especificidade do teste, segundo diferentes pontos de corte, mostraram a impossibilidade de diferenciação entre o grupo controle e o grupo sabidamente infectado. Também não foi possível estabelecer correlação entre os títulos encontrados e as diferentes formas clínicas. Foi considerada a existência de reações cruzadas relacionadas a helmintíases intestinais, porém nenhuma relação direta foi encontrada.