Clonagem funcional como metodologia na identificação de marcadores de virulência de Leishmania (Viannia) braziliensis

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Biotecnologia.

Leishmania (Viannia) braziliensis e L. (V.) peruviana são duas espécies de Leishmania pertencentes ao complexo braziliensis, caracterizadas por causar diferentes quadros clínicos. Em estudos anteriores de infecção experimental em hamsters dourados (Mesocricetus auratus), os parasitas de L. braziliensis causaram o aparecimento de lesões ulcerativas logo após a inoculação, enquanto que, os parasitas de L. peruviana apresentaram ligeiros sinais de infecção numa fase mais tardia da infecção. As infecções provocadas pelas estirpes híbridas de L.braziliensis e L. peruviana mostraram sinais evidentes de infecção sugerindo que a virulência é uma característica dominante. Diversas tecnologias têm sido utilizadas na identificação dos caracteres genéticos da virulência em Leishmania. No nosso estudo, pesquisámos características no genoma de L. braziliensis que poderão estar associadas à virulência da estirpe, recorrendo ao método de clonagem funcional. Construiu-se uma população híbrida artificial, transfectando-se uma biblioteca de DNA genómico de L. braziliensis em parasitas de L. peruviana. A população de parasitas recombinantes de L.peruviana, possuindo vários fragmentos diferentes do DNA genómico de L. braziliensis foi sujeita a selecção in vivo, sendo inoculada em hamsters dourados e monitorizada semanalmente a evolução clínica dos animais até às 24 semanas. As populações de parasitas recombinantes isoladas dos hamsters, três e 24 semanas após a infecção revelaram grande homogeneidade, observando-se a presença de dois clones cosmídicos em grande parte das populações (56% na população isolada às três semanas após a infecção a partir do gânglio e 65,2 e 86% nas populações isoladas às 24 semanas após a infecção a partir do tecido cutâneo do local de inoculação e dos gânglios, respectivamente). Os clones cosmídicos identificados possuem segmentos comuns aos cromossomas seis e 26 de L. braziliensis. Dos segmentos identificados, apenas um gene possui informação na base de dados de L. braziliensis como codificante para uma ATP-NAD-cinase. Estes resultados sugerem que os possíveis genes identificados poderão desempenhar um importante papel na virulência e patogenicidade de Leishmania, podendo constituir novos alvos de pesquisa no desenvolvimento de candidatos terapêuticos e vacinas anti-Leishmania.