Synthetic biology: a novel approach for the construction of industrial microorganisms

The recent achievement of synthesising a functioning bacterial chromosome marks a coming of age for engineering living organisms. In the future this should allow the construction of novel organisms to help solve the problems facing the human race, including health care, food, energy and environmental protection. In this minireview, the current state of the field is described and the role of synthetic biology in biotechnology in the short and medium term is discussed. It is particularly aimed at the needs of food technologists, nutritionists and other biotechnologists, who might not be aware of the potential significance of synthetic biology to the research and development in their fields. The potential of synthetic biology to produce interesting new polyketide compounds is discussed in detail.

Profilo genomico e di espressione dell'Osteosarcoma. Identificazione dei geni con alto grado di correlazione tra numero di copie ed espressione

To identify the regions of recurrent copy number abnormality in osteosarcoma and their effect on gene expression, we performed an integrated genome-wide high-resolution array CGH (aCGH) and gene expression profiling analysis on 40 human OS tissues and 12 OS cell lines. This analysis identified several recurrent chromosome regions that contain genes that show a gene dosage effect on gene expression. A further search, performed on those genes that were over-expressed and localized in the frequently amplified chromosomal regions, greatly reduced the number of candidate genes while their characterization using gene ontology (GO) analysis suggests the importance of the deregulation of the G1-to-S phase in the development of the disease. We also identified frequent deletions on 3q in the vicinity of LSAMP and performed a fine mapping analysis of the breakpoints. We precisely mapped the breakpoints in several instances and demonstrated that the majority do not involve the LSAMP gene itself, and that they appear to form by a process of non-homologous end joining. In addition, aCGH analysis revealed frequent gains of IGF1R that were highly correlated with its protein level. Blockade of IGF1R in OS cell lines with high copy number gain led to growth inhibition suggesting that IGF1R may be a viable drug target in OS, particularly in patients with copy number driven overexpression of this receptor.

Generation of a NG2-EYFP mouse for studying the properties of NG2-expressing cells

A range of vectors were made in which the EYFP gene or the Cre gene were inserted in the start codon of the NG2 gene. The NG2-EYFP vectors were used to generate NG2-EYFP “knockin” mice by homologous recombination. The F1 generation showed lack of EYFP expression, due to NeoR cassette interference. Excision of the NeoR, by breeding the F1 generation to ELLA-Cre mice allowed proper expression of EYFP. NG2-EYFP heterozygous mice were characterized in detail for astrocytic, neurogenic and oligodendrocytic properties through antibody labeling. NG2-EYFP+ cells did not label for the astrocyte marker GFAP, but some cells did express S100 Beta. The cells did not label with any neuronal markers like Beta III tubulin, Neun, and double cortin, but many of the NG2-EYFP+ cells made intimate contacts to the neurons. These contacts are widespread throughout the grey and white matter of the brain. The NG2-EYFP+ cells did label for oligodendrocyte markers like PDGFα-R, NG2, Olig2, O4, and Sox 10. There were a few cells termed phantom cells that did label for NG2, but had no EYFP expression. This could have been caused by improper excision of the NeoR cassette in the F2 generation. The heterozygous mouse is a tool to allow the characterization of the in vivo properties of the NG2+ cells. Breeding of these mice to homozygosity yielded an NG2-knockout mouse, which was also subjected to initial characterization. The NG2-EYFP homozygous showed equivalent cell labeling results to the NG2-EYFP heterozygous mouse, but the phantom cells disappeared in the knockout. The results show that the NG2 cells are a heterogenous population that does not express astrocytic or neuronal markers. The homozygous mouse is an ideal tool to further dissect the properties of the cells, lacking NG2 in vivo.

Ansatz zur Generierung einer konditionalen, reversiblen Wt1 k.o.-Maus

Ansatz zur Generierung einer konditionalen, reversiblen Wt1 k.o.-Maus Der Wilms-Tumor (WT, Nephroblastom) ist ein embryonaler Nierentumor, der durch die maligne Transformation von undifferenziertem Nierengewebe, sog. nephrogenen Resten, entsteht. WT treten mit einer Inzidenz von 1 in 10.000 Lebendgeburten auf. Das Hauptmanifestationsalter, der normalerweise einseitig und sporadisch auftretenden Tumore, liegt zwischen dem 3. und 4. Lebensjahr. Etwa 10 % der Patienten entwickeln jedoch bilaterale Tumore. In diesen Fällen ist eine Assoziation mit komplexen genetischen Krankheitsbildern (u. a. WAGR-, Denys-Drash-, Frasier- und Beckwith-Wiedemann-Syndrom) festzustellen. In 15 % der sporadischen WT sind Mutationen im WT1 (Wilms-Tumor 1)-Gen beschrieben. WT1 besteht aus zehn Exons und weist typische Merkmale von Transkriptionsfaktoren (z. B. vier Zinkfinger) auf. Zwei alternative Spleißereignisse betreffen Exon 5 (+/−Exon 5) und Exon 9 (Transkripte mit bzw. ohne die codierenden Sequenzen für die AS Lysin-Threonin-Serin; +/−KTS). Die Lage der drei alternativ vorhandenen AS zwischen den Zinkfingern 3 und 4 bestimmt die verschiedenen Funktionen der WT1-Proteine (4 Isoformen) als Transkriptionsfaktor (−KTS) bzw. als RNA-bindendes Protein (+KTS). Das zunächst im Zusammenhang mit WT als Tumorsuppressorgen identifizierte WT1 ist ein Entwicklungsgen mit einem sehr komplexen Expressionsmuster in der Embryonalentwicklung. Dabei ist v. a. die Bedeutung in der Urogenitalentwicklung entscheidend. Konstitutive, homozygote Wt1−/− k.o.-Mäuse sind embryonal (~ E12,5 dpc) letal und bilden u. a. keine Gonaden und keine Nieren. Aus diesem Grund existiert bisher kein Wilms-Tumormodell. Die Herstellung eines konditionalen murinen Tiermodells auf Basis des Tet on/off-Systems zur Untersuchung der Nierenentwicklung bzw. zur Analyse der Wilms-Tumorpathogenese war Ziel dieser Arbeit. Hierfür wurden drei Mauslinien generiert: Zwei transgene sog. Responder-Linien, die eine chimäre spleißbare Wt1-cDNA der Variante musWt1+Exon 5;+/−KTS unter der Kontrolle eines Tet-responsiven Promotors im Genom tragen. Dieses tTA/Dox-abhängig regulierbare Wt1-Transgen (tgWt1) sollte (exogen regulierbar) die Expression des endogenen Wt1-Lokus ausreichend nachahmen, um die kritischen Phasen der Embryogenese zu überwinden und lebensfähige Tiere zu erhalten. Parallel dazu wurde die Wt1-Effektor-Mauslinie (WE2) generiert. Diese trägt einen tetrazyklinabhängigen Transaktivator (tTA) zur Steuerung Tet-regulierbarer Transgene unter der Kontrolle des endogenen Wt1-Promotors. Die durch homologe Rekombination in ES-Zellen erreichte Integration des tTA direkt am Translationsstartpunkt des Wt1-Lokus hat in den Tieren einen heterozygoten Wt1 knock out/tTA knock in zur Folge. Die bisher vorgenommenen Verpaarungen doppelt transgener Wt1-tTA+/−/Resp-Mäuse ergaben keinen Rescue des letalen Wt1 k.o. und es konnten bislang keine Wilms-Tumore induziert werden. Alle im Verlauf der Arbeit generierten Mauslinien wurden umfassend charakterisiert. So konnte für die Tiere der Responder-Linien Wt1-Resp1 (mit zusätzlichen Isolator-Sequenzen zum Schutz des Transgens vor Positionseffekten) und Wt1-Resp2 (ohne Isolatoren) konnte die Tet-induzierbare Expression und die Spleißbarkeit des tgWt1 in MEF-Assays und mittels Effektor-Mäusen auf RNA-Ebene nachgewiesen werden. Die genomische Charakterisierung der WE2-Linie ergab eine ungeklärte etwa 120 kb große Inversion am Wt1-Lokus, die alle 5'-regulatorischen Sequenzen mitsamt des tTA vom Rest von Wt1 trennt. Tiere dieser Linie weisen aber dennoch einen funktionalen Wt1 k.o. auf: Unter den Nachkommen aus Intercross-Verpaarungen von Wt1-tTA+/−-Mäusen lassen sich auf Grund der Letalität keine Wt1−/−-Genotypen nachweisen. Die Charakterisierung der Effektor-Linie auf RNA-Ebene und mittels Reporter-Mäusen liefert ein Wt1-analoges tTA-Expressionsmuster: So findet man eine deutliche tTA-Expression u. a. in Niere (Glomeruli), Uterus, Ovar und Testis. Die hier vorgestellten Experimente ergeben darüber hinaus eindeutige Hinweise einer Beteiligung von Wt1 in der Entstehung der glatten Muskulatur bzw. in der Vaskulogenese.

Konditionale Mutagenese von Desmoglein 2 in der Maus

Desmosomen sind hoch organisierte interzelluläre Verbindungen, die Zellverbänden eine mechanische Stabilität verleihen. Die Intermediärfilamentnetzwerke benachbarter Zellen werden mit Hilfe der desmosomalen Cadherine vom Desmoglein- und Desmocollin-Typ miteinander verknüpft. Diese Glykoproteine interagieren miteinander im Interzellularspalt zwischen benachbarten Zellen und stellen mit ihren zytoplasmatischen Domänen einen Ankerpunkt für desmosomale Brückenproteine dar, an welche wiederum die Proteine des Intermediärfilament-Zytoskeletts binden. Bei der Maus spielt das desmosomale Cadherin Desmoglein 2 (DSG2) bereits in frühen Stadien der Embryogenese eine entscheidende Rolle. Homozygote DSG2-Knockout-Mäuse sterben bereits vor der Implantation des Embryos ab. Im adulten Tier ist Dsg2 die am weitesten verbreitete Isoform, in Darm, Leber und Herzmuskel wird es zudem exklusiv exprimiert. Ziel dieser Arbeit war es, die Bedeutung von Dsg2 in differenzierten Gewebeverbänden adulter Tiere zu untersuchen. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden mehrere transgene Mauslinien hergestellt, in denen mit Hilfe des Cre/loxP-Systems eine Deletion im DSG2-Gen konditional und gewebsspezifisch induziert werden konnte. Dazu wurden zuerst zwei loxP-Sequenzen und eine mit zwei FRT-Stellen flankierte Neomyzinresistenzgen-Kassette in das DSG2-Gen von embryonalen Stammzellen durch homologe Rekombination eines Targeting-Konstrukts inseriert. Diese Zellen wurden in Blastozysten injiziert und Mauslinien hergestellt. Mit Hilfe der Flpe-Rekombinase wurde anschließend die Resistenzenzgen-Kassette entfernt. Diese Stämme wurden mit Mäusen verpaart, die eine induzierbare und gewebsspezifische Synthese der Cre-Rekombinase ermöglichen. Im Darmepithel und der Leber konnte eine gewebsspezifische Rekombination des DSG2-Gens induziert werden. Untersuchungen der DSG2-mRNA zeigten, dass die DSG2-Rekombination in der Darmschleimhaut nahezu vollständig erfolgte. Immunfluoreszenz-Analysen an Gewebsfragmenten induzierter Tiere mit Isotyp-spezifischen Antikörpern, die im Rahmen dieser Arbeit hergestellt worden waren, zeigten jedoch keine signifikanten Unterschiede der Desmosomenzahl und -verteilung. Daher wurden eGFP-Hybride des zu erwartenden mutierten Dsg2-Proteins in Zellen exprimiert und mit wildtypischem Dsg2 verglichen. Es konnte hinsichtlich der Verteilung und Morphologie der Desmosomen keine Unterschiede zwischen beiden Dsg2-Proteinen festgestellt werden. Der Dsg2-Mutante fehlen wichtige Proteinbereiche, die für die trans-Interaktion der extrazellulären Domäne verantwortlich sind, die Haupt-N-Glykosylierungsstelle, sowie eine der insgesamt vier Kalzium-Bindestellen. Dies sind Eigenschaften, von denen man bisher annahm, dass sie eine zentrale Bedeutung für die desmosomale Adhäsion besitzen. Weitere Experimente werden zeigen, inwieweit die hergestellte Dsg2-Mutante in „Stresssituationen“, wie sie z.B. bei Regenerationsvorgängen oder der Tumorgenese auftreten, zu veränderten adhäsiven Eigenschaften führt.

Effetti dell'inibizione di Tanchirasi in linee cellulari di Medulloblastoma umano

Tanchirasi (TNKS) è un membro della superfamiglia delle PARP (Poli ADP-Ribosio Polimerasi). TNKS è coinvolta nella stabilizzazione della subunità catalitca del complesso proteico DNA-PK (protein chinasi DNA-dipendente), la DNA-PKcs. Questa proteina è fondamentale per il corretto funzionamento del meccanismo di riparo del DNA chiamato "Saldatura Non Omologa delle Estremità" (NHEJ). La deplezione di TNKS induce una degradazione della DNA-PKcs e una maggiore sensibilità alle radiazioni ionizzanti (RI). TNKS è inoltre un regolatore negativo di axina e di conseguenza un attivatore del pathway di WNT; l'inibizione quindi di TNKS induce anche una inibizione del pathway di WNT. Alterazioni in questo signalling si riscontrano frequentemente nel Medulloblastoma (MB), il tumore cerebrale embrionale più comune dell'infanzia. La radioterapia post-operatoria risulta essere molto efficacia in questa neoplasia, ma causa gravi effetti collaterali e un terzo dei pazienti presenta radioresistenza intrinseca. Un'importante sfida per la ricerca è quindi l'aumento della radiosensibilità tumorale. In questo lavoro, abbiamo studiato gli effetti dell'inibizione farmacologica di TNKS in linee cellulari di MB umano, mediante la small molecule XAV939, potente e specifico inibitore di TNKS. Il trattamento con XAV939 induce una consistente inibizione della capacità proliferativa e clonogenica, non correlata ad un aumento della mortalità cellulare, indicando una bassa tossicità legata alla molecola. Il co-trattamento di XAV939 e RI (γ-ray, dose 2 Gy) causa una ulteriore inibizione della proliferazione cellulare e della capacità di formare colonie. Abbiamo inoltre constatato, mediante Neutral Comet Assay, una minore efficacia nel riparo del DNA in cellule irradiate trattate con XAV939, indicando un effettivo aumento della radiosensibilità in cellule di MB trattate con l'inibitore di TNKS. L'aumentata mortalità cellulare in cellule tumorali trattate con XAV939 e RI ha confermato la nostra ipotesi. Il nostro studio in vitro indica come TNKS possa essere un utile target terapeutico per rendere più efficace l'attuale terapia contro il MB.

Photokathoden mit internem DBR-Reflektor als Quellen hochintensiver spinpolarisierter Elektronenstrahlen

Die Erzeugung von Elektronenstrahlen hoher Intensität (I$geq$2,mA) und hoher Spinpolarisation (P$geq$85%) ist für die Experimente an den geplanten glqq Linac Ringgrqq Electron--Ion--Collidern (z.B. eRHIC am Brookhaven National Laboratory) unabdingbar, stellt aber zugleich eine enorme Herausforderung dar. Die Photoemission aus ce{GaAs}--basierten Halbleitern wie z.B. den in dieser Arbeit untersuchten GaAlAs/InGaAlAs Quanten--Übergittern zeichnet sich zwar durch eine hohe Brillanz aus, die geringe Quantenausbeute von nur ca. 1% im Bereich maximaler Polarisation erfordert jedoch hohe Laserintensitäten von mehreren Watt pro $text{cm}^{2}$, was erhebliche thermische Probleme verursacht. rnrnIn dieser Arbeit konnte zunächst gezeigt werden, dass die Lebensdauer einer Photokathode mit steigender Laserleistung bzw. Temperatur exponentiell abnimmt. Durch Einbringen eines DBR--Spiegels zwischen die aktive Zone der Photokathode und ihr Substrat wird ein Großteil des ungenutzten Laserlichts wieder aus dem Kristall herausreflektiert und trägt somit nicht zur Erwärmung bei. Gleichzeitig bildet der Spiegel zusammen mit der Grenzfläche zum Vakuum eine Resonator--Struktur aus, die die aktive Zone umschließt. Dadurch kommt es für bestimmte Wellenlängen zu konstruktiver Interferenz und die Absorption in der aktiven Zone erhöht sich. Beide Effekte konnten durch vergleichenden Messungen an Kathoden mit und ohne DBR--Spiegel nachgewiesen werden. Dabei ergibt sich eine gute Übereinstimmung mit der Vorhersage eines Modells, das auf der dielektrischen Funktion der einzelnen Halbleiterstrukturen beruht. Von besonderer praktischer Bedeutung ist, dass die DBR--Kathode für einen gegebenen Photoemissions-strom eine um einen Faktor $geq$,3{,}5 kleinere Erwärmung aufweist. Dies gilt über den gesamten Wellenlängenbereich in dem die Kathode eine hohe Strahlpolarisation (P$>$80%) produzieren kann, auch im Bereich der Resonanz.rnAus zeitaufgelösten Messungen der Ladungsverteilung und Polarisation lassen sich sowohl Rückschlüsse über die Transportmechanismen im Inneren einer Kathode als auch über die Beschaffenheit ihrer Oberfläche ziehen. Im Rahmen dieser Dissertation konnte die Messgeschwindigkeit der verwendeten Apparatur durch den Einbau eines schnelleren Detektors und durch eine Automatisierung der Messprozedur entscheidend vergrößert und die resultierende Zeitauflösung mit jetzt 1{,}2 Pikosekunden annähernd verdoppelt werden.rnrnDie mit diesen Verbesserungen erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass sich der Transport der Elektronen in Superlattice--Strukturen stark vom Transport in den bisher untersuchten Bulk--Kristallen unterscheidet. Der Charakter der Bewegung folgt nicht dem Diffusionsmodell, sondern gibt Hinweise auf lokalisierte Zustände, die nahe der Leitungsbandunterkante liegen und Elektronen für kurze Zeit einfangen können. Dadurch hat die Impulsantwort einer Kathode neben einem schnellen Abfall des Signals auch eine größere Zeitkonstante, die selbst nach 30,ps noch ein Signal in der Größenordnung von ca. 5textperthousand der Maximalintensität erzeugt.

DNA-Reparatur und Zelltod nach gentoxischem Stress in Monozyten, dendritischen Zellen und Makrophagen

Monozyten wie auch dendritische Zellen (DCs) und Makrophagen sind ein wichtiger Bestandteil des angeborenenen unspezifischen Immunsystems. Ein Kennzeichen dieser Zellen ist die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zur Abtötung von Pathogenen. Im Fall von chronischen Entzündungen oder Infekten kann es zu einer explosionsartigen Freisetzung freier Radikale kommen ('Oxidative Burst'). Aus vorangegangenen Untersuchungen war bekannt, dass die Expression der beiden Basen Exziosions Reparatur (BER)-Proteine XRCC1 und Ligase III während der Ausreifung humaner Monozyten zu DCs induziert wird (Briegert and Kaina, 2007). Dies lies vermuten, dass Monozyten aufgrund einer defekten BER eine hohe Sensitivität gegenüber ROS aufweisen. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde die Wirkung von ROS auf humane Monozyten und daraus abgeleiteten DCs und Makrophagen untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Monozyten eine hohe Sensitivität gegenüber oxidativem Stress aufweisen, was auf eine höhere Einzelstrangbruch-Rate zurückzuführen war. Ursache hierfür ist das Fehlen der BER-Proteine XRCC1, Ligase III und PARP-1. Die fehlende Expression dieser Proteine resultierte letztendlich in Monozyten in einem Defekt der BER und DNA-Einzelstrangbruchreparatur. rnDie Proteine XRCC1, Ligase III und PARP-1 sind auch Bestandteil des Apparats des B-NHEJ ('backup-non homologous end joining'), was auf eine Beeinträchtigung der Monozyten hinsichtlich der Prozessierung von Doppelstrangbrüchen (DSBs) schließen lässt. Zur Untersuchung dieser Vermutung, wurde die Wirkung von Ionisierender Strahlung ('ionizing radiation'; IR) auf Monozyten, DCs und Makrophagen bestimmt. Monozyten zeigten eine signifikant höhere Sensitivität gegenüber IR als DCs und Makrophagen, was auf eine erhöhte DSB-Rate in den Monozyten nach IR zurückzuführen war. Expressionsanalysen und ein DNA-PK-Aktivitäts-Assay zeigten zusätzlich, dass Monozyten keine DNA-PKcs, ein bedeutender Faktor des C-NHEJ, exprimieren. Somit haben Monozyten sowohl einen Defekt im B-NHEJ als auch im C-NHEJ und sind demnach nicht in der Lage, DSBs zu reparieren.rnAuch gegenüber dem Alkylanz und Chemotherapeutikum Temozolomid bewirken die Reparaturdefekte eine hohe Sensitivität der Monozyten. Zur Therapie von Hirntumoren werden neben der Operation, die Bestrahlung und Chemotherapie mit Temozolomid angewendet. Die hohe Sensitivität von Monozyten gegenüber IR und Temozolomid könnte eine Erklärung für die starke Immunsuppression bei einer derartigen Therapie sein.rn

A photophysical study of excited state dynamics in donor-acceptor copolymer photovoltaic blends

This thesis deals with the investigation of charge generation and recombination processes in three different polymer:fullerene photovoltaic blends by means of ultrafast time-resolved optical spectroscopy. The first donor polymer, namely poly[N-11"-henicosanyl-2,7-carbazole-alt-5,5-(4',7'-di-2-thienyl-2',1',3'-benzothiadiazole)] (PCDTBT), is a mid-bandgap polymer, the other two materials are the low-bandgap donor polymers poly[2,6-(4,4-bis-(2-ethylhexyl)-4H-cyclopenta[2,1-b;3,4-b']-dithiophene)-alt-4,7-(2,1,3-benzothiadiazole) (PCPDTBT) and poly[(4,4'-bis(2-ethylhexyl)dithieno[3,2-b:2',3'-d]silole)-2,6-diyl-alt-(2,1,3-benzothiadiazole)-4,7-diyl] (PSBTBT). Despite their broader absorption, the low-bandgap polymers do not show enhanced photovoltaic efficiencies compared to the mid-bandgap system.rnrnTransient absorption spectroscopy revealed that energetic disorder plays an important role in the photophysics of PCDTBT, and that in a blend with PCBM geminate losses are small. The photophysics of the low-bandgap system PCPDTBT were strongly altered by adding a high boiling point cosolvent to the polymer:fullerene blend due to a partial demixing of the materials. We observed an increase in device performance together with a reduction of geminate recombination upon addition of the cosolvent. By applying model-free multi-variate curve resolution to the spectroscopic data, we found that fast non-geminate recombination due to polymer triplet state formation is a limiting loss channel in the low-bandgap material system PCPDTBT, whereas in PSBTBT triplet formation has a smaller impact on device performance, and thus higher efficiencies are obtained.rn

Unraveling efficiency-limiting processes in organic solar cells by ultrafast spectroscopy - impact of chemical structure and morphology on photophysics and efficiency

Diese Arbeit widmet sich der Untersuchung der photophysikalischen Prozesse, die in Mischungen von Elektronendonoren mit Elektronenakzeptoren zur Anwendung in organischen Solarzellen auftreten. Als Elektronendonoren werden das Copolymer PBDTTT-C, das aus Benzodithiophen- und Thienothiophene-Einheiten besteht, und das kleine Molekül p-DTS(FBTTh2)2, welches Silizium-überbrücktes Dithiophen, sowie fluoriertes Benzothiadiazol und Dithiophen beinhaltet, verwendet. Als Elektronenakzeptor finden ein planares 3,4:9,10-Perylentetracarbonsäurediimid-(PDI)-Derivat und verschiedene Fullerenderivate Anwendung. PDI-Derivate gelten als vielversprechende Alternativen zu Fullerenen aufgrund der durch chemische Synthese abstimmbaren strukturellen, optischen und elektronischen Eigenschaften. Das gewichtigste Argument für PDI-Derivate ist deren Absorption im sichtbaren Bereich des Sonnenspektrums was den Photostrom verbessern kann. Fulleren-basierte Mischungen übertreffen jedoch für gewöhnlich die Effizienz von Donor-PDI-Mischungen.rnUm den Nachteil der PDI-basierten Mischungen im Vergleich zu den entsprechenden Fulleren-basierten Mischungen zu identifizieren, werden die verschiedenen Donor-Akzeptor-Kombinationen auf ihre optischen, elektronischen und strukturellen Eigenschaften untersucht. Zeitaufgelöste Spektroskopie, vor allem transiente Absorptionsspektroskopie (TA), wird zur Analyse der Ladungsgeneration angewendet und der Vergleich der Donor-PDI Mischfilme mit den Donor-Fulleren Mischfilmen zeigt, dass die Bildung von Ladungstransferzuständen einen der Hauptverlustkanäle darstellt.rnWeiterhin werden Mischungen aus PBDTTT-C und [6,6]-Phenyl-C61-buttersäuremethylesther (PC61BM) mittels TA-Spektroskopie auf einer Zeitskala von ps bis µs untersucht und es kann gezeigt werden, dass der Triplettzustand des Polymers über die nicht-geminale Rekombination freier Ladungen auf einer sub-ns Zeitskala bevölkert wird. Hochentwickelte Methoden zur Datenanalyse, wie multivariate curve resolution (MCR), werden angewendet um überlagernde Datensignale zu trennen. Zusätzlich kann die Regeneration von Ladungsträgern durch Triplett-Triplett-Annihilation auf einer ns-µs Zeitskala gezeigt werden. Darüber hinaus wird der Einfluss des Lösungsmitteladditivs 1,8-Diiodooctan (DIO) auf die Leistungsfähigkeit von p-DTS(FBTTh2)2:PDI Solarzellen untersucht. Die Erkenntnisse von morphologischen und photophysikalischen Experimenten werden kombiniert, um die strukturellen Eigenschaften und die Photophysik mit den relevanten Kenngrößen des Bauteils in Verbindung zu setzen. Zeitaufgelöste Photolumineszenzmessungen (time-resolved photoluminescence, TRPL) zeigen, dass der Einsatz von DIO zu einer geringeren Reduzierung der Photolumineszenz führt, was auf eine größere Phasentrennung zurückgeführt werden kann. Außerdem kann mittels TA Spektroskopie gezeigt werden, dass die Verwendung von DIO zu einer verbesserten Kristallinität der aktiven Schicht führt und die Generation freier Ladungen fördert. Zur genauen Analyse des Signalzerfalls wird ein Modell angewendet, das den gleichzeitigen Zerfall gebundener CT-Zustände und freier Ladungen berücksichtigt und optimierte Donor-Akzeptor-Mischungen zeigen einen größeren Anteil an nicht-geminaler Rekombination freier Ladungsträger.rnIn einer weiteren Fallstudie wird der Einfluss des Fullerenderivats, namentlich IC60BA und PC71BM, auf die Leistungsfähigkeit und Photophysik der Solarzellen untersucht. Eine Kombination aus einer Untersuchung der Struktur des Dünnfilms sowie zeitaufgelöster Spektroskopie ergibt, dass Mischungen, die ICBA als Elektronenakzeptor verwenden, eine schlechtere Trennung von Ladungstransferzuständen zeigen und unter einer stärkeren geminalen Rekombination im Vergleich zu PCBM-basierten Mischungen leiden. Dies kann auf die kleinere Triebkraft zur Ladungstrennung sowie auf die höhere Unordnung der ICBA-basierten Mischungen, die die Ladungstrennung hemmen, zurückgeführt werden. Außerdem wird der Einfluss reiner Fullerendomänen auf die Funktionsfähigkeit organischer Solarzellen, die aus Mischungen des Thienothienophen-basierenden Polymers pBTTT-C14 und PC61BM bestehen, untersucht. Aus diesem Grund wird die Photophysik von Filmen mit einem Donor-Akzeptor-Mischungsverhältnis von 1:1 sowie 1:4 verglichen. Während 1:1-Mischungen lediglich eine co-kristalline Phase, in der Fullerene zwischen den Seitenketten von pBTTT interkalieren, zeigen, resultiert der Überschuss an Fulleren in den 1:4-Proben in der Ausbildung reiner Fullerendomänen zusätzlich zu der co kristallinen Phase. Transiente Absorptionsspektroskopie verdeutlicht, dass Ladungstransferzustände in 1:1-Mischungen hauptsächlich über geminale Rekombination zerfallen, während in 1:4 Mischungen ein beträchtlicher Anteil an Ladungen ihre wechselseitige Coulombanziehung überwinden und freie Ladungsträger bilden kann, die schließlich nicht-geminal rekombinieren.

Excited-state dynamics in donor-acceptor systems for energy conversion

In dieser Arbeit werden die Dynamiken angeregter Zustände in Donor-Akzeptorsystemen für Energieumwandlungsprozesse mit ultraschneller zeitaufgelöster optischer Spektroskopie behandelt. Der Hauptteil dieser Arbeit legt den Fokus auf die Erforschung der Photophysik organischer Solarzellen, deren aktive Schichten aus diketopyrrolopyrrole (DPP) basierten Polymeren mit kleiner Bandlücke als Elektronendonatoren und Fullerenen als Elektronenakzeptoren bestehen. rnEin zweiter Teil widmet sich der Erforschung von künstlichen primären Photosynthesereaktionszentren, basierend auf Porphyrinen, Quinonen und Ferrocenen, die jeweils als Lichtsammeleinheit, Elektronenakzeptor beziehungsweise als Elektronendonatoren eingesetzt werden, um langlebige ladungsgetrennte Zustände zu erzeugen.rnrnZeitaufgelöste Photolumineszenzspektroskopie und transiente Absorptionsspektroskopie haben gezeigt, dass Singulettexzitonenlebenszeiten in den Polymeren PTDPP-TT und PFDPP-TT Polymeren kurz sind (< 20 ps) und dass in Mischungen der Polymere mit PC71BM geminale Rekombination von gebundenen Ladungstransferzuständen ein Hauptverlustkanal ist. Zudem wurde in beiden Systemen schnelle nichtgeminale Rekombination freier Ladungen zu Triplettzuständen auf dem Polymer beobachtet. Für das Donor-Akzeptor System PDPP5T:PC71BM wurde nachgewiesen, dass die Zugabe eines Lösungsmittels mit hohem Siedepunkt, und zwar ortho-Dichlorbenzol, die Morphologie der aktiven Schicht stark beeinflusst und die Solarzelleneffizienz verbessert. Der Grund hierfür ist, dass die Donator- und Akzeptormaterialien besser durchmischt sind und sich Perkolationswege zu den Elektroden ausgebildet haben, was zu einer verbesserten Ladungsträgergeneration und Extraktion führt. Schnelle Bildung des Triplettzustands wurde in beiden PDPP5T:PC71BM Systemen beobachtet, da der Triplettzustand des Polymers über Laungstransferzustände mit Triplettcharakter populiert werden kann. "Multivariate curve resolution" (MCR) Analyse hat eine starke Intensitätsabhängigkeit gezeigt, was auf nichtgeminale Ladungsträgerrekombination in den Triplettzustand hinweist.rnrnIn den künstlichen primären Photosynthesereaktionszentren hat transiente Absorptionsspektroskopie bestätigt, dass photoinduzierter Ladungstransfer in Quinon-Porphyrin (Q-P) und Porphyrin-Ferrocen (P-Fc) Diaden sowie in Quinon-Porphyrin-Ferrocen (Q-P-Fc) Triaden effizient ist. Es wurde jedoch auch gezeigt, dass in den P-Fc unf Q-P-Fc Systemen die ladungsgetrennten Zustände in den Triplettzustand der jeweiligen Porphyrine rekombinieren. Der ladungsgetrennte Zustand konnte in der Q-P Diade durch Zugabe einer Lewissäure signifikant stabilisiert werden.

Contribution of mucosal maltase-glucoamylase activities to mouse small intestinal starch alpha-glucogenesis

Digestion of starch requires activities provided by 6 interactive small intestinal enzymes. Two of these are luminal endo-glucosidases named alpha-amylases. Four are exo-glucosidases bound to the luminal surface of enterocytes. These mucosal activities were identified as 4 different maltases. Two maltase activities were associated with sucrase-isomaltase. Two remaining maltases, lacking other identifying activities, were named maltase-glucoamylase. These 4 activities are better described as alpha-glucosidases because they digest all linear starch oligosaccharides to glucose. Because confusion persists about the relative roles of these 6 enzymes, we ablated maltase-glucoamylase gene expression by homologous recombination in Sv/129 mice. We assayed the alpha-glucogenic activities of the jejunal mucosa with and without added recombinant pancreatic alpha-amylase, using a range of food starch substrates. Compared with wild-type mucosa, null mucosa or alpha-amylase alone had little alpha-glucogenic activity. alpha-Amylase amplified wild-type and null mucosal alpha-glucogenesis. alpha-Amylase amplification was most potent against amylose and model resistant starches but was inactive against its final product limit-dextrin and its constituent glucosides. Both sucrase-isomaltase and maltase-glucoamylase were active with limit-dextrin substrate. These mucosal assays were corroborated by a 13C-limit-dextrin breath test. In conclusion, the global effect of maltase-glucoamylase ablation was a slowing of rates of mucosal alpha-glucogenesis. Maltase-glucoamylase determined rates of digestion of starch in normal mice and alpha-amylase served as an amplifier for mucosal starch digestion. Acarbose inhibition was most potent against maltase-glucoamylase activities of the wild-type mouse. The consortium of 6 interactive enzymes appears to be a mechanism for adaptation of alpha-glucogenesis to a wide range of food starches.

Coupling of mutated Met variants to DNA repair via Abl and Rad51

Abnormal activation of DNA repair pathways by deregulated signaling of receptor tyrosine kinase systems is a compelling likelihood with significant implications in both cancer biology and treatment. Here, we show that due to a potential substrate switch, mutated variants of the receptor for hepatocyte growth factor Met, but not the wild-type form of the receptor, directly couple to the Abl tyrosine kinase and the Rad51 recombinase, two key signaling elements of homologous recombination-based DNA repair. Treatment of cells that express the mutated receptor variants with the Met inhibitor SU11274 leads, in a mutant-dependent manner, to a reduction of tyrosine phosphorylated levels of Abl and Rad51, impairs radiation-induced nuclear translocation of Rad51, and acts as a radiosensitizer together with the p53 inhibitor pifithrin-alpha by increasing cellular double-strand DNA break levels following exposure to ionizing radiation. Finally, we propose that in order to overcome a mutation-dependent resistance to SU11274, this aberrant molecular axis may alternatively be targeted with the Abl inhibitor, nilotinib.

Lack of galactose-alpha-1,3-galactose expression on porcine endothelial cells prevents complement-induced lysis but not direct xenogeneic NK cytotoxicity

The galactose-alpha-1,3-galactose (alphaGal) carbohydrate epitope is expressed on porcine, but not human cells, and therefore represents a major target for preformed human anti-pig natural Abs (NAb). Based on results from pig-to-primate animal models, NAb binding to porcine endothelial cells will likely induce complement activation, lysis, and hyperacute rejection in pig-to-human xenotransplantation. Human NK cells may also contribute to innate immune responses against xenografts, either by direct recognition of activating molecules on target cells or by FcgammaRIII-mediated xenogeneic Ab-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). The present study addressed the question as to whether the lack of alphaGal protects porcine endothelial cells from NAb/complement-induced lysis, direct xenogeneic NK lysis, NAb-dependent ADCC, and adhesion of human NK cells under shear stress. Homologous recombination, panning, and limiting dilution cloning were used to generate an alphaGal-negative porcine endothelial cell line, PED2*3.51. NAb/complement-induced xenogeneic lysis of PED2*3.51 was reduced by an average of 86% compared with the alphaGal-positive phenotype. PED2*3.51 resisted NK cell-mediated ADCC with a reduction of lysis ranging from 30 to 70%. However, direct xenogeneic lysis of PED2*3.51, mediated either by freshly isolated or IL-2-activated human NK cells or the NK cell line NK92, was not reduced. Furthermore, adhesion of IL-2-activated human NK cells did not rely on alphaGal expression. In conclusion, removal of alphaGal leads to a clear reduction in complement-induced lysis and ADCC, but does not resolve adhesion of NK cells and direct anti-porcine NK cytotoxicity, indicating that alphaGal is not a dominant target for direct human NK cytotoxicity against porcine cells.

Combinatorial chromophore assembly inside a DNA four-way junction

In 1964 first proposed by Robin Holliday as a mechanistic model to solve the mystery of how genetic information is exchanged in yeast, the DNA four-way junction or Holliday junction (HJ) was proofed to be the key in- termediate in homologous recombination and became an important tool in the field of DNA origami, computation and nanomachines. Herein we use the assembly of four modified nucleic acid strands into the planar square conformation of this higher order DNA structure to demonstrate in a proof of principle manner the cumulative effect of pyrene moieties interacting inside the junction.[1][2]