Ansatz zur Generierung einer konditionalen, reversiblen Wt1 k.o.-Maus

Ansatz zur Generierung einer konditionalen, reversiblen Wt1 k.o.-Maus Der Wilms-Tumor (WT, Nephroblastom) ist ein embryonaler Nierentumor, der durch die maligne Transformation von undifferenziertem Nierengewebe, sog. nephrogenen Resten, entsteht. WT treten mit einer Inzidenz von 1 in 10.000 Lebendgeburten auf. Das Hauptmanifestationsalter, der normalerweise einseitig und sporadisch auftretenden Tumore, liegt zwischen dem 3. und 4. Lebensjahr. Etwa 10 % der Patienten entwickeln jedoch bilaterale Tumore. In diesen Fällen ist eine Assoziation mit komplexen genetischen Krankheitsbildern (u. a. WAGR-, Denys-Drash-, Frasier- und Beckwith-Wiedemann-Syndrom) festzustellen. In 15 % der sporadischen WT sind Mutationen im WT1 (Wilms-Tumor 1)-Gen beschrieben. WT1 besteht aus zehn Exons und weist typische Merkmale von Transkriptionsfaktoren (z. B. vier Zinkfinger) auf. Zwei alternative Spleißereignisse betreffen Exon 5 (+/−Exon 5) und Exon 9 (Transkripte mit bzw. ohne die codierenden Sequenzen für die AS Lysin-Threonin-Serin; +/−KTS). Die Lage der drei alternativ vorhandenen AS zwischen den Zinkfingern 3 und 4 bestimmt die verschiedenen Funktionen der WT1-Proteine (4 Isoformen) als Transkriptionsfaktor (−KTS) bzw. als RNA-bindendes Protein (+KTS). Das zunächst im Zusammenhang mit WT als Tumorsuppressorgen identifizierte WT1 ist ein Entwicklungsgen mit einem sehr komplexen Expressionsmuster in der Embryonalentwicklung. Dabei ist v. a. die Bedeutung in der Urogenitalentwicklung entscheidend. Konstitutive, homozygote Wt1−/− k.o.-Mäuse sind embryonal (~ E12,5 dpc) letal und bilden u. a. keine Gonaden und keine Nieren. Aus diesem Grund existiert bisher kein Wilms-Tumormodell. Die Herstellung eines konditionalen murinen Tiermodells auf Basis des Tet on/off-Systems zur Untersuchung der Nierenentwicklung bzw. zur Analyse der Wilms-Tumorpathogenese war Ziel dieser Arbeit. Hierfür wurden drei Mauslinien generiert: Zwei transgene sog. Responder-Linien, die eine chimäre spleißbare Wt1-cDNA der Variante musWt1+Exon 5;+/−KTS unter der Kontrolle eines Tet-responsiven Promotors im Genom tragen. Dieses tTA/Dox-abhängig regulierbare Wt1-Transgen (tgWt1) sollte (exogen regulierbar) die Expression des endogenen Wt1-Lokus ausreichend nachahmen, um die kritischen Phasen der Embryogenese zu überwinden und lebensfähige Tiere zu erhalten. Parallel dazu wurde die Wt1-Effektor-Mauslinie (WE2) generiert. Diese trägt einen tetrazyklinabhängigen Transaktivator (tTA) zur Steuerung Tet-regulierbarer Transgene unter der Kontrolle des endogenen Wt1-Promotors. Die durch homologe Rekombination in ES-Zellen erreichte Integration des tTA direkt am Translationsstartpunkt des Wt1-Lokus hat in den Tieren einen heterozygoten Wt1 knock out/tTA knock in zur Folge. Die bisher vorgenommenen Verpaarungen doppelt transgener Wt1-tTA+/−/Resp-Mäuse ergaben keinen Rescue des letalen Wt1 k.o. und es konnten bislang keine Wilms-Tumore induziert werden. Alle im Verlauf der Arbeit generierten Mauslinien wurden umfassend charakterisiert. So konnte für die Tiere der Responder-Linien Wt1-Resp1 (mit zusätzlichen Isolator-Sequenzen zum Schutz des Transgens vor Positionseffekten) und Wt1-Resp2 (ohne Isolatoren) konnte die Tet-induzierbare Expression und die Spleißbarkeit des tgWt1 in MEF-Assays und mittels Effektor-Mäusen auf RNA-Ebene nachgewiesen werden. Die genomische Charakterisierung der WE2-Linie ergab eine ungeklärte etwa 120 kb große Inversion am Wt1-Lokus, die alle 5'-regulatorischen Sequenzen mitsamt des tTA vom Rest von Wt1 trennt. Tiere dieser Linie weisen aber dennoch einen funktionalen Wt1 k.o. auf: Unter den Nachkommen aus Intercross-Verpaarungen von Wt1-tTA+/−-Mäusen lassen sich auf Grund der Letalität keine Wt1−/−-Genotypen nachweisen. Die Charakterisierung der Effektor-Linie auf RNA-Ebene und mittels Reporter-Mäusen liefert ein Wt1-analoges tTA-Expressionsmuster: So findet man eine deutliche tTA-Expression u. a. in Niere (Glomeruli), Uterus, Ovar und Testis. Die hier vorgestellten Experimente ergeben darüber hinaus eindeutige Hinweise einer Beteiligung von Wt1 in der Entstehung der glatten Muskulatur bzw. in der Vaskulogenese.

Aim of generating a conditional, revesible Wt1 k.o. mouse Wilms' tumor (nephroblastoma) is a malignant embryonic kidney cancer which affects 1:10.000 children, usually below the age of 5 years. Most patients present with sporadic unilateral neoplasms, whereas ~10 % develop bilateral tumors. These cases are often associated with complex genetic diseases like WAGR-, Denys-Drash-, Frasier- and Beckwith-Wiedemann-Syndrome. Wilms' tumor is intimately linked to early kidney development and is thought to arise from mesenchymal blastema cells that fail to differentiate into metanephric structures but continue to proliferate due to genetic and epigenetic changes in the persitent embryonic renal tissue (nephrogenic rests). The Wilms' tumor 1 gene (WT1), the first gene found to be inactivated in Wilms' tumor, is mutated in ~15 % of sporadic tumors. Alterations of WT1 are also observed in other malignancies such as leukemia, mesothelioma and desmoplastic small round cell tumor. Dependent on the tumor type, WT1 proteins might either function as tumor suppressor proteins or as a survival factor. WT1 is located at human chromosome 11p13 and on mouse chromosome 2, spanning ~ 50 kb genomic DNA and comprising 10 exons that encode mRNAs ~3 kb. WT1 exon 5 and exon 9 are alternatively spliced. The encoded protein exhibits typical characteristics of a transcription factor, namely four zinc fingers at the C-terminal domain. The use of the alternative splice donor site at the end of exon 9 leads to the incorporation of three amino acids (lysine, threonine, serine; KTS) between the zinc fingers 3 and 4, resulting in altering the function of WT1 proteins as a transcription factor (−KTS isoforms) or as a RNA binding protein (+KTS isoforms). WT1 is showing a complex expression pattern in embryogenesis demonstrating its importance for certain other mesodermally derived tissues, including gonads, cardiac vasculature and spleen. Constitutive Wt1 null mice (Wt1−/−) die at E12,5 (dependent on the genetic background) of failure in cardiac development. In addition, these mice show no development of the kidneys or the gonads, pointing to a key role for Wt1 in urogenital genesis. Up to date, no murine Wilms’ tumor model exists. To study Wilms’ tumorigenesis we generated mouse strains to simulate Wt1 ablation in nephrogenesis using the Tet on/off system: First: By homologous recombination a tTA was introduced at the Wt1 locus (tTA knock in), excising Wt1 exon 1 (Wt1 knock out) and leading to a Wt1+/−-tTA mouse strain, which could be used as an effector for tetO transgene strains. However, there are results pointing to an 120 kb inversion involving the recombinated Wt1 locus. Anyway, homozygous Wt1−/− mice are lethal, thus providing strong evidence for the inactivation of Wt1. Under control of the Wt1 promotor, the integrated tTA is resembling the Wt1 expression pattern. Using reporter mouse strains we documented a role for Wt1 in vasculogenesis and respectively in the development of smooth muscle cells in general. Second: Two responder strains were generated by pronucleus injection harbouring a tetOWt1 transgene consisiting of a tetOCMV-promotor driving a musWt1+ exon5; +/−KTS cDNA (tgWt1+ex5, +/−KTS) in presence of tTA. This chimeric Wt1 cDNA incorporates complete intron 9 to provide the alternative splice donor site. Both tgWt1 isoforms (+ex5, +KTS and +ex5, −KTS) could be detected. Crossing of the Wt1+/−-tTA and the tgWt1+ex5, +/−KTS mice revealed no rescue of the lethal Wt1−/− phenotype. In addition, no Wilms’ tumor could be induced.