Konditionale Mutagenese von Desmoglein 2 in der Maus

Desmosomen sind hoch organisierte interzelluläre Verbindungen, die Zellverbänden eine mechanische Stabilität verleihen. Die Intermediärfilamentnetzwerke benachbarter Zellen werden mit Hilfe der desmosomalen Cadherine vom Desmoglein- und Desmocollin-Typ miteinander verknüpft. Diese Glykoproteine interagieren miteinander im Interzellularspalt zwischen benachbarten Zellen und stellen mit ihren zytoplasmatischen Domänen einen Ankerpunkt für desmosomale Brückenproteine dar, an welche wiederum die Proteine des Intermediärfilament-Zytoskeletts binden. Bei der Maus spielt das desmosomale Cadherin Desmoglein 2 (DSG2) bereits in frühen Stadien der Embryogenese eine entscheidende Rolle. Homozygote DSG2-Knockout-Mäuse sterben bereits vor der Implantation des Embryos ab. Im adulten Tier ist Dsg2 die am weitesten verbreitete Isoform, in Darm, Leber und Herzmuskel wird es zudem exklusiv exprimiert. Ziel dieser Arbeit war es, die Bedeutung von Dsg2 in differenzierten Gewebeverbänden adulter Tiere zu untersuchen. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden mehrere transgene Mauslinien hergestellt, in denen mit Hilfe des Cre/loxP-Systems eine Deletion im DSG2-Gen konditional und gewebsspezifisch induziert werden konnte. Dazu wurden zuerst zwei loxP-Sequenzen und eine mit zwei FRT-Stellen flankierte Neomyzinresistenzgen-Kassette in das DSG2-Gen von embryonalen Stammzellen durch homologe Rekombination eines Targeting-Konstrukts inseriert. Diese Zellen wurden in Blastozysten injiziert und Mauslinien hergestellt. Mit Hilfe der Flpe-Rekombinase wurde anschließend die Resistenzenzgen-Kassette entfernt. Diese Stämme wurden mit Mäusen verpaart, die eine induzierbare und gewebsspezifische Synthese der Cre-Rekombinase ermöglichen. Im Darmepithel und der Leber konnte eine gewebsspezifische Rekombination des DSG2-Gens induziert werden. Untersuchungen der DSG2-mRNA zeigten, dass die DSG2-Rekombination in der Darmschleimhaut nahezu vollständig erfolgte. Immunfluoreszenz-Analysen an Gewebsfragmenten induzierter Tiere mit Isotyp-spezifischen Antikörpern, die im Rahmen dieser Arbeit hergestellt worden waren, zeigten jedoch keine signifikanten Unterschiede der Desmosomenzahl und -verteilung. Daher wurden eGFP-Hybride des zu erwartenden mutierten Dsg2-Proteins in Zellen exprimiert und mit wildtypischem Dsg2 verglichen. Es konnte hinsichtlich der Verteilung und Morphologie der Desmosomen keine Unterschiede zwischen beiden Dsg2-Proteinen festgestellt werden. Der Dsg2-Mutante fehlen wichtige Proteinbereiche, die für die trans-Interaktion der extrazellulären Domäne verantwortlich sind, die Haupt-N-Glykosylierungsstelle, sowie eine der insgesamt vier Kalzium-Bindestellen. Dies sind Eigenschaften, von denen man bisher annahm, dass sie eine zentrale Bedeutung für die desmosomale Adhäsion besitzen. Weitere Experimente werden zeigen, inwieweit die hergestellte Dsg2-Mutante in „Stresssituationen“, wie sie z.B. bei Regenerationsvorgängen oder der Tumorgenese auftreten, zu veränderten adhäsiven Eigenschaften führt.

Desmosomes are highly organised intercellular junctions participating in mechanical stabilization of various tissues. Desmosomal cadherins of the Desmoglein- and Desmocollin-type contribute to the integration of intermediate filament networks in neighbouring cells by forming adhesive bonds via their extracellular domains and by establishing intermediate filament anchorage sites via their intracellular carboxytermini. Desmoglein 2 (Dsg2) is the most abundant desmoglein isoform in adult mice and is exclusively expressed in heart, liver and intestine. Furthermore, it has been shown to be essential for murine embryogenesis, since homozygous DSG2-knockout animals die around implantation. To elucidate the importance of Dsg2 for differentiated tissues, several transgenic mouse strains were generated to allow conditional mutation of the DSG2 gene. These strains express the Cre-recombinase in a tissue-specific and inducible fashion to mediate deletion of DSG2-gene segments that were marked by newly-introduced loxP recombinase recognition sites. loxP-sites were first introduced into the DSG2-locus of murine embryonic stem cells by homologous recombination. For selection, a neomycin-resistance cassette flanked by FRT Flp-recombinase recognition sites was included. Properly recombined cells were injected into blastocysts and transgenic mouse strains were prepared. By mating these strains with Flp-recombinase expressing transgenic mice the neomycin-resistance cassette was subsequently excised. The resulting animals were then crossed with the different transgenic Cre-recombinase expressing mice to permit Cre-mediated DSG2 recombination. Tissue specific recombination of DSG2 was accomplished in intestinal mucosa and liver leading to almost complete depletion of DSG2-mRNA as shown by RT-PCR in the small intestine. Yet, the number and distribution of desmosomes was not visibly altered as seen by immunofluorescence microscopy using a newly prepared Dsg2-specific antibody. To further examine the effect of the introduced mutation on Dsg2, eGFP-hybrids were constructed of wild type and mutant Dsg2 and tested in cell culture. No significant differences in distribution and morphology of both Dsg2-proteins were detected. The Dsg2 mutant protein lacks crucial parts of its extracellular domain. These parts encompass the only N-glycosylation site and one of four calcium binding pockets previously thought to be of paramount importance for desmosomal adhesion. Further experiments will show whether this newly described Dsg2 mutant presents adhesive and/or other deficiencies which may only become apparent in certain cellular stress situations and tumourigenesis.