Experimentelle Untersuchungen zur embryonalen Entwicklung identifizierter Vorläuferzellen des zentralen Nervensystems von Drosophila melanogaster

Zusammenfassung Das ventrale Nervensystem (vNS) von Drosophila melanogaster entsteht aus zwei verschiedenen Populationen von Vorläufern, den mesektodermalen oder Mittellinien (ML)-Vorläufern und den neuroektodermalen Vorläufern oder Neuroblasten (NBs). Beide Populationen unterscheiden sich in vielen Aspekten, wie z.B. Genexpression, Teilungsverhalten und Zellstammbaum. Die ca. 30 NBs pro Hemisegment delaminieren als Einzelzellen aus dem Neuroektoderm und bilden ein invariantes subepidermales Muster in der neu entstandenen neuralen Zellschicht aus. Sie sind dort aufgrund ihrer Lage und der Expression spezifischer molekularer Marker individuell identifizierbar. Um die Mechanismen zu verstehen, die zur Determination und Differenzierung von ZNS Zellen führen, ist es eine Grundvoraussetzung, die Zellstammbäume aller Vorläufer zu kennen. Unter Verwendung des lipophilen in vivo Fluoreszenzfarbstoffs DiI wurden in früheren Arbeiten die Zellstammbäume der ML-Vorläufer und von 17 NBs, die aus der ventralen Hälfte des Neuroektoderms stammten, beschrieben. In der hier vorgelegten Arbeit wurden die Zellstammbäume von 13 NBs, die aus dem dorsalen Teil des Neuroektoderms delaminierten, beschrieben und 12 davon identifizierten Vorläufern zugeordnet. Darüber hinaus wurde ein bisher nicht beschriebener NB (NB 1-3) identifiziert und anhand morphologischer und molekularer Kriterien charakterisiert. Insgesamt produzierten die NBs ca. 120 Neurone und 22 bis 27 Gliazellen pro Hemineuromer, die in eine systematische Terminologie eingefügt wurden. Insgesamt besteht damit ein Neuromer des embryonalen vNS von Drosophila aus ca. 700 Neuronen (350 pro Hemineuromer) und 60 Gliazellen (30 pro Hemineuromer), die von NBs abstammen. Hinzu kommen ca. 12 ML-Neurone und 2 bis 4 ML-Glia pro Neuromer. Damit stammten die meisten Gliazellen im embryonalen vNS von Drosophila von NBs ab, die aus dem dorsalen Neuroektoderm hervorgingen. Zwei dieser NBs hatten ausschließlich gliale Nachkommen (NB 6-4A, GP) und fünf generierten sowohl Glia als auch Neurone (NBs 1-3, 2-5, 5-6, 6-4T, 7-4). Die übrigen sieben Zellstammbäume (NBs 2-4, 3-3, 3-5, 4-3, 4-4, 5-4, Klon y) waren rein neuronal. Es war ferner möglich, das bereits bekannte laterale Cluster von even-skipped exprimierenden Zellen (EL) dem Stammbaum von NB 3-3 zuzuordnen. Zusammen mit den zuvor beschriebenen Klonen sind damit mehr als 90% der thorakalen und abdominalen Zellstammbäume im embryonalen vNS von Drosophila bekannt. Darüber hinaus sind zuvor identifizierte Neurone und die meisten Gliazellen einem bestimmten Stammbaum zugeordnet und damit mit einer ontogenetischen Geschichte versehen. Dieser komplette Datensatz liefert eine Grundlage für die Interpretation mutanter Phänotypen und für zukünftige Untersuchungen über die Festlegung von Zellschicksalen und die Differenzierung von Zellen. Dies könnte dazu beitragen, das Verhältnis zwischen Herkunft der Zelle, Genexpression und Zellfunktion besser zu verstehen. Die wesentliche Funktion neuronaler Zellen ist die Integration und Weiterleitung von elektrischen Signalen. Mithin ist die Ausbildung elektrischer Eigenschaften (Elektrogenese) ein wesentlicher Aspekt der neuronalen Entwicklung. Um dabei zelltypspezifische Unterschiede zu finden, ist die Arbeit an definierten Zellpopulationen eine zwingende Voraussetzung. Es wurde daher hier ein in vitro System verwendet, das die selektive Kultivierung identifizierter embryonaler Vorläufer unter verschiedenen Bedingungen erlaubt. Da die Zellstammbäume der ML-Vorläufer besonders einfach sind und die ML-Zellen zudem in vielen Aspekten von den neuroektodermalen Zellen verschieden sind (s.o.), wurden die ML-Neurone als erstes Modellsystem ausgewählt. Unter Verwendung der Patch-clamp Technik wurden die in dieser definierten Zellpopulation auftretenden Ionenströme detailliert beschrieben. ML-Neurone exprimierten zumindest zwei verschiedene Typen von spannungsgesteuerten K+-Strömen (IA und IK), einen spannungsabhängigen Na+-Strom und zwei spannungsgesteuerte Ca(Ba)2+-Ströme. Darüber hinaus reagierten sie auf die Neurotransmitter ACh und GABA. Die meisten Ionenströme in den ML-Neuronen waren, trotz ihrer ontogenetischen Besonderheit, annähernd identisch mit denen, die in anderen Drosophila-Neuronen gefunden wurden. Ihnen fehlte allerdings eine anhaltende Komponente des Na+-Stroms, und sie waren homogen in ihrer Aktivität. Selbst bei anhaltender elektrischer Stimulation generierten sie immer nur ein Aktionspotential. Sie sind daher möglicherweise spezifisch hinsichtlich ihrer Signalleitungseigenschaften. Interessanterweise zeigte sich durch Verwendung verschiedener Kulturbedingungen, daß die Expression der spannungsgesteuerten K+-Kanäle weitgehend zellautonom erfolgte, während die Expression der anderen Ströme stark durch das Vohandensein von Neuritenkontakten beeinflußt wurde. Vorläufige Untersuchungen lassen darauf schließen, daß der involvierte molekulare Mechanismus unabhängig von synaptischer Transmission ist. In einer Art 'Ausblick' wurde schließlich die Validität von in vitro Ableitungen durch Analyse spannungsgesteuerter K+-Ströme in einer neuen in situ Präparation geprüft, die verschiedene Bereiche des Drosophila-ZNS für elektrophysiologische Untersuchungen zugänglich macht. Damit ist ein experimentelles System etabliert, daß den direkten Vergleich von in vitro und in situ Daten an definierten Zellpopulationen ermöglichen sollte.

Mesonic chiral perturbation theory - odd intrinsic parity sector

In der vorliegenden Dissertation werden zwei verschiedene Aspekte des Sektors ungerader innerer Parität der mesonischen chiralen Störungstheorie (mesonische ChPT) untersucht. Als erstes wird die Ein-Schleifen-Renormierung des führenden Terms, der sog. Wess-Zumino-Witten-Wirkung, durchgeführt. Dazu muß zunächst der gesamte Ein-Schleifen-Anteil der Theorie mittels Sattelpunkt-Methode extrahiert werden. Im Anschluß isoliert man alle singulären Ein-Schleifen-Strukturen im Rahmen der Heat-Kernel-Technik. Zu guter Letzt müssen diese divergenten Anteile absorbiert werden. Dazu benötigt man eine allgemeinste anomale Lagrange-Dichte der Ordnung O(p^6), welche systematisch entwickelt wird. Erweitert man die chirale Gruppe SU(n)_L x SU(n)_R auf SU(n)_L x SU(n)_R x U(1)_V, so kommen zusätzliche Monome ins Spiel. Die renormierten Koeffizienten dieser Lagrange-Dichte, die Niederenergiekonstanten (LECs), sind zunächst freie Parameter der Theorie, die individuell fixiert werden müssen. Unter Betrachtung eines komplementären vektormesonischen Modells können die Amplituden geeigneter Prozesse bestimmt und durch Vergleich mit den Ergebnissen der mesonischen ChPT eine numerische Abschätzung einiger LECs vorgenommen werden. Im zweiten Teil wird eine konsistente Ein-Schleifen-Rechnung für den anomalen Prozeß (virtuelles) Photon + geladenes Kaon -> geladenes Kaon + neutrales Pion durchgeführt. Zur Kontrolle unserer Resultate wird eine bereits vorhandene Rechnung zur Reaktion (virtuelles) Photon + geladenes Pion -> geladenes Pion + neutrales Pion reproduziert. Unter Einbeziehung der abgeschätzten Werte der jeweiligen LECs können die zugehörigen hadronischen Strukturfunktionen numerisch bestimmt und diskutiert werden.

Bioinformatische, genomweite Analyse genexpressionsregulierender Faktoren in Lebergewebe

Für eine Reihe einzelner genetischer Faktoren und Promotorelemente wurde in der Vergangenheit eine Regulation der Genexpression in der Leber (und auch in anderen Geweben) gezeigt. Mit der Verfügbarkeit des gesamten humanen Genoms sowie dessen Expressionsdaten in großen Microarray- und SAGE-Datenbanken bietet sich die Möglichkeit, solche Regulationsmechanismen in großem, genomweitem Maßstab zu untersuchen. Dabei geht diese Arbeit der Frage nach, ob es übergeordnete, eine Expression speziell in der Leber fördernde oder hemmende Faktoren gibt oder ob jedes Gen von einer unabhängigen Kombination von Faktoren reguliert wird, in dessen Summe die Expression des individuellen Gens in der Leber am stärksten ist. Sollten sich übergeordnete, eine Expression in der Leber stimulierende Faktoren finden, wären diese interessant für die Entwicklung neuer Behandlungskonzepte bei Lebererkrankungen. Zur Untersuchung dieser Fragestellung wurden aus einem Affymetrix Microarray Datenset für 12 Gewebe die Expressiondaten von insgesamt jeweils 15.472 Genen extrahiert. In einem zweiten Schritt wurden zusätzlich die Promotorsequenzen der einzelnen zugehörigen Gene, definiert als eine 1000 bp Region upstream des Transkriptionsstarts, in dieselbe Datenbank abgelegt. Die Promotorsequenzen wurden über den PromotorScan-Algorithmus analysiert. Auf diese Weise wurden Transkriptionsfaktorbindungsstellen auf 7042 der Promotoren identifiziert. Es fand sich eine Gesamtzahl von 241.984 Transkriptionsfaktorbindungsstellen. Anhand der Microarray-Expressionsdaten wurde die Gesamtgruppe der verfügbaren Gene und Promotoren in zwei Gruppen unterteilt, nämlich in die Gruppe der Gene, deren Expression in der Leber deutlich am höchsten gefunden wurde und in die Gruppe der Gene, die in anderen Geweben am höchsten exprimiert waren. Jeder potentiell bindende Transkriptionsfaktor wurde auf unterschiedliches Vorkommen in diesen beiden Gruppen hin untersucht. Dies geschah unter der Vorstellung, dass übergeordnete Faktoren, die eine Expression in der Leber stimulieren in der Gruppe der Gene, die in der Leber am höchsten exprimiert sind, verhältnismäßig wesentlich häufiger zu finden sein könnten. Eine solches häufigeres Vorkommen ließ sich jedoch für keinen einzigen Faktor nachweisen. Transkriptionsfaktorbindungsstellen sind typischerweise zwischen 5 und 15 bp lang. Um auszuschließen, dass mit dem verwendeten PromotorScan-Algorithmus Transkriptionsfaktorbindungsstellen, die bisher nicht bekannt sind, nicht übersehen wurden, wurden die Häufigkeit sämtlicher möglicher 8 bp (48) und 10 bp (410) Nukleotid-Kombinationen in diesen Promotoren untersucht. Biologisch relevante Unterschiede fanden sich zwischen den beiden Gruppen nicht. In gleicher Weise wurde auch die Bedeutung von TATA-Boxen untersucht. TATA-Boxen kommt bei der Transkriptionsinitiierung eine wichtige Rolle zu, indem über sie die Bindung des initialen Transkriptionskomplexes vermittelt wird. Insgesamt 1033 TATA-Boxen wurden ebenfalls mittels PromotorScan vorausgesagt. Dabei waren 57 auf Promotoren von Genen, die in der Leber überexprimiert waren und 976 auf Promotoren von Genen, die in anderen Geweben überexprimiert waren. Der Vergleich dieser beiden Gruppen ließ keine signifikant unterschiedliche Häufigkeit an TATA-Boxen erkennen. Im weiteren wurde die Bedeutung von CpG-Islands für eine potentiell differentielle Regulation untersucht. Insgesamt wurden 8742 CpG-Islands in einem Bereich von bis zu 5 kb upstream des Transkriptionsstarts identifiziert, 364 davon auf Promotoren von Genen, die am höchsten in der Leber exprimiert waren, 8378 auf Promotoren von Genen, die in anderen Geweben am höchsten exprimiert waren. Signifikante Unterschiede in der Verteilung von CpG-Islands auf Promotoren dieser beiden Gengruppen ließen sich nicht nachweisen. Schließlich wurden die RNA- und Proteinsequenzen des Transkriptoms und Proteoms hinsichtlich ihrer Zusammensetzung aus einzelnen Nukleotiden bzw. Aminosäuren analysiert. Auch hierbei fanden sich keine signifikanten Unterschiede in der Verteilung zwischen beiden Gengruppen. Die Zusammenschau der Ergebnisse zeigt, dass die Regulation der einzelnen Gene im Lebergewebe im wesentlichen individuell erfolgt. Im Rahmen der vorgelegten bioinformatischen Analysen fanden sich keine übergeordneten genetischen „Leberfaktoren“, die speziell eine Expression von Genen in der Leber stimulieren. Neue therapeutische Ansätze, die auf eine Regulation der Genexpression in der Leber zielen, werden somit auch weiterhin auf die Beeinflussung individueller Gene fokussiert bleiben.

Clowninnen: Portrait einer Berufsgruppe /// Arbeitspapiere / Institut für Ethnologie und Afrikastudien ; 76

Clowninnen. Portrait einer Berufsgruppe Eine neue Berufsgruppe etabliert sich: Die Clownin! Seit den 1980er Jahren treten vermehrt Frauen als Clownin in die europäische Öffentlichkeit. Sie erobern zunehmend weitere gesellschaftliche Bereiche, treten aus dem Zirkus heraus, hinein in die wirtschaftliche, religiöse, medizinische, pädagogische und soziale Sphäre. Die Erweiterung der Arbeitsfelder beinhaltet differenzierte Aktionsmöglichkeiten für die Clownin und prägt die Beziehung zu den Zuschauern, die vom Einzelkontakt z.B. im Altenheim über Seminargruppen bis hin zu hunderten von Personen bei Bühnenstücken reichen. Die Zugangswege zur Clownsarbeit sind individuell, wobei sich die früher typisch familiäre Bindung in Zirkus- und anderen Künstlerfamilien nicht mehr finden lässt. Das Clown-Sein begreifen die Frauen als einen Prozess, der vor allem durch Persönlichkeitsarbeit und Lebenserfahrung geprägt ist. Bestimmte Aspekte des Clowns erschließen sich erst im und durch das Clownsspiel, wobei immer wieder Grenzen auf persönlicher und gesellschaftlicher Ebene aufgebrochen werden. Kernstück der Studie bilden zehn qualitative Interviews mit Frauen aus Deutschland und der Schweiz, die beruflich als Clownin in unterschiedlichen Arbeitsfeldern tätig sind. Ergänzend beobachtete die Autorin Auftritte in verschiedenen Arbeitsbereichen und führte eine Befragung an 16 Clownsschulen durch. Ziel dieser Studie ist es, Ausbildungswege, Arbeitsfelder und Arbeitsweisen dieser neuen Berufsgruppe aus emischer Sicht darzulegen. Vertiefend wird das Selbstverständnis der Clowninnen vorgestellt. Welche Ziele verfolgen die Frauen in ihrer Arbeit und wo sehen sie die Grenzen des Clowns? Welche Bedeutung messen sie der Spiritualität und dem Tod zu? Wie gestaltet sich das Wechselspiel zwischen Privatperson und Clownin? In mehreren Portraits und in vergleichenden Darstellungen finden sich Antworten auf diese Fragen, bei denen die Frauen durch vielfältige Zitate immer wieder selber zu Wort kommen.

Einfluss einer pharmazeutischen Betreuung auf den klinischen Verlauf und die Behandlungsergebnisse von Diabetikern mit Diabetischem Fußsyndrom (DFS)

Einfluss einer Pharmazeutischen Betreuung auf den klinischen Verlauf und die Behandlungsergebnisse von Diabetikern mit Diabetischem Fußsyndrom (DFS) Hintergrund/Rationale: In Deutschland gibt es etwa 6 Millionen Diabetiker und die Tendenz ist steigend. Das Diabetische Fußsyndrom (DFS) stellt eine häufige und besonders gravierende Folgeerkrankung des Diabetes mellitus dar. Jährlich werden in Deutschland ca. 45.000 Amputationen aufgrund des DFS bei Diabetikern durchgeführt. Es verursacht bei den Patienten physische und psychische Beeinträchtigungen und produziert hohe Krankheitskosten. Der Prävention, der Behandlung und der Rezidivprophylaxe des DFS kommt daher ein hoher Stellenwert zu. Ziel dieser Arbeit war es, ein klinisch-pharmazeutisches Betreuungsprogramm für Patienten mit DFS zu erarbeiten und den Einfluss der Pharmazeutischen Betreuung, speziell einer intensivierten Patientenschulung, auf klinische und soziale Behandlungsergebnisse hin zu untersuchen. Es sollte geklärt werden, ob eine zusätzliche pharmazeutische Betreuung Einfluss auf den Wundheilungsverlauf und die Abheilungsrate der Fußläsionen von Diabetikern mit DFS nehmen kann. Methoden: 52 Patienten mit DFS wurden in eine randomisierte, kontrollierte Studie eingeschlossen und im Verhältnis 1:1 einer Interventions- oder Kontrollgruppe zugeteilt. Die Interventionsgruppe wurde kontinuierlich durch einen Apotheker zusätzlich individuell betreut (Anleitung zum sachgerechten Umgang mit Arzneimitteln, Medizinprodukten und Therapiemaßnahmen), die Kontrollgruppe erhielt die übliche medizinische Betreuung. Die Auswirkungen der Intervention auf den klinischen Verlauf der beobachteten Fußläsionen, die Rezidivfreiheit und Rehospitalisierungsrate, aber auch auf die Patientenzufriedenheit, das Patientenwissen und die Lebensqualität wurden untersucht. Jeder Patient wurde über einen Zeitraum von 12 Monaten beobachtet. Ergebnisse: Die Studienergebnisse belegen einen positiven Einfluss der Pharmazeutischen Betreuung auf die klinischen Endpunkte der Diabetiker mit DFS. Die Wundheilung der Läsionen in der Interventionsgruppe, bezogen auf Abheilungsdauer und -rate, konnte klinisch positiv beeinflusst werden. Des weiteren konnte in der Interventionsgruppe die Anzahl an neu aufgetretenen Läsionen, sowie weiterer Krankenhausaufenthalte um jeweils fast 50% verringert werden. Durch die Pharmazeutische Betreuung konnte die Patientenzufriedenheit mit der Behandlung deutlich gesteigert werden. Entsprechendes fand sich für das Patientenwissen und die Lebensqualität.

Sinnfindung als Bewältigungsmöglichkeit einer Darmkrebserkrankung

Ziel der vorliegenden Untersuchung war, Sinnfindung als Einflussgröße auf die Anpassung an eine Darmkrebserkrankung längsschnittlich zu untersuchen. 341 Darmkrebspatientinnen und –patienten nahmen an der Untersuchung teil. Sie beantworteten zu zwei Messzeitpunkten, der erste lag zu Beginn einer stationären Rehabilitation, der zweite war sechs Monate später, einen Fragebogen, der Fragen zur Sinnfindung, Religiosität, zu klassischen Coping-Inhalten und zur Anpassung an die Erkrankung beinhaltete. Zu beiden Messzeitpunkten fand ein Vergleich mit einer gesunden Kontrollgruppe (n = 320) vergleichbaren Alters statt. Die Rücklaufquote vom ersten zum zweiten Messzeitpunkt lag bei 86,3 % in der Untersuchungsgruppe und bei 93,1 % in der Kontrollgruppe. Obwohl ein Vergleich der Gesunden mit den Darmkrebspatientinnen und -patienten ergab, dass Gesunde sowohl zum ersten, als auch zum zweiten Messzeitpunkt niedrigere Werte für Angst und Depressivität und höhere Werte bei Lebensqualität und Gesundheitszustand hatten, verbesserten sich dennoch innerhalb der Untersuchungsgruppe Lebensqualität und Gesund¬heitszustand innerhalb von sechs Monaten signifikant. Angst, Depressivität, krankheitsspezifisches Wohlbefinden und posttraumatische persönliche Reifung veränderten sich hingegen nicht. Der stärkste Prädiktor für die Varianzaufklärung aller Anpassungsmaße war Sinnfindung, obwohl die Werte für Sinnfindung in der Kontrollgruppe statistisch sogar höher waren als in der Untersuchungsgruppe. In diesem Zusammenhang wurde das Konstrukt der Religiosität insofern wichtig, als dass Personen mit hohen Werten der Zentralität der Religiosität höhere Werte bei der Sinnfindung aufwiesen als Personen, bei denen die Religiosität im Alltag keine Rolle spielte. Religiosität kann demnach als Element zur Sinnfindung betrachtet werden. Bei dem Konstrukt Sinnfindung handelte es sich also um einen differenzierten und inhaltlich individuell ausgestalteten Prädiktor, der inkrementelle Varianzaufklärung im Sinne von gelungener Anpassung leistete. Im Bereich der Therapie könnte die Kenntnis um die relative Bedeutsamkeit beider Konstrukte, sowohl dem der Sinnfindung, als auch dem der Religiosität als mögliches sinnstiftendes Element, Eingang in Therapiekonzepte und praktische Implikationen finden.

Functional polymer coatings — My-Patterning and My-Analysis

In dieser Arbeit werden Strukturen beschrieben, die mit Polymeren auf Oberflächen erzeugt wurden. Die Anwendungen reichen von PMMA und PNIPAM Polymerbürsten, über die Restrukturierung von Polystyrol durch Lösemittel bis zu 3D-Strukturen, die aus PAH/ PSS Polyelektrolytmultischichten bestehen. Im ersten Teil werden Polymethylmethacrylat (PMMA) Bürsten in der ionischen Flüssigkeit 1-Butyl-3-Methylimidazolium Hexafluorophospat ([Bmim][PF6]) durch kontrollierte radikalische Polymerisation (ATRP) hergestellt. Kinetische Untersuchungen zeigten ein lineares und dichtes Bürstenwachstum mit einer Wachstumsrate von 4600 g/mol pro nm. Die durchschnittliche Pfropfdichte betrug 0.36 µmol/m2. Als Anwendung wurden Mikrotropfen bestehend aus der ionischen Flüssigkeit, Dimethylformamid und dem ATRP-Katalysator benutzt, um in einer definierten Geometrie Polymerbürsten auf Silizium aufzubringen. Auf diese Weise lässt sich eine bis zu 13 nm dicke Beschichtung erzeugen. Dieses Konzept ist durch die Verdampfung des Monomers Methylmethacrylat (MMA) limitiert. Aus einem 1 µl großen Tropfen aus ionischer Flüssigkeit und MMA (1:1) verdampft MMA innerhalb von 100 s. Daher wurde das Monomer sequentiell zugegeben. Der zweite Teil konzentriert sich auf die Strukturierung von Oberflächen mit Hilfe einer neuen Methode: Tintendruck. Ein piezoelektrisch betriebenes „Drop-on-Demand“ Drucksystem wurde verwendet, um Polystyrol mit 0,4 nl Tropfen aus Toluol zu strukturieren. Die auf diese Art und Weise gebildeten Mikrokrater können Anwendung als Mikrolinsen finden. Die Brennweite der Mikrolinsen kann über die Anzahl an Tropfen, die für die Strukturierung verwendet werden, eingestellt werden. Theoretisch und experimentell wurde die Brennweite im Bereich von 4,5 mm bis 0,21 mm ermittelt. Der zweite Strukturierungsprozess nutzt die Polyelektrolyte Polyvinylamin-Hydrochlorid (PAH) und Polystyrolsulfonat (PSS), um 3D-Strukturen wie z.B. Linien, Schachbretter, Ringe, Stapel mit einer Schicht für Schicht Methode herzustellen. Die Schichtdicke für eine Doppelschicht (DS) liegt im Bereich von 0.6 bis 1.1 nm, wenn NaCl als Elektrolyt mit einer Konzentration von 0,5 mol/l eingesetzt wird. Die Breite der Strukturen beträgt im Mittel 230 µm. Der Prozess wurde erweitert, um Nanomechanische Cantilever Sensoren (NCS) zu beschichten. Auf einem Array bestehend aus acht Cantilevern wurden je zwei Cantilever mit fünf Doppelschichten PAH/ PSS und je zwei Cantilever mit zehn Doppelschichten PAH/ PSS schnell und reproduzierbar beschichtet. Die Massenänderung für die individuellen Cantilever war 0,55 ng für fünf Doppelschichten und 1,08 ng für zehn Doppelschichten. Der daraus resultierende Sensor wurde einer Umgebung mit definierter Luftfeuchtigkeit ausgesetzt. Die Cantilever verbiegen sich durch die Ausdehnung der Beschichtung, da Wasser in das Polymer diffundiert. Eine maximale Verbiegung von 442 nm bei 80% Luftfeuchtigkeit wurde für die mit zehn Doppelschichten beschichteten Cantilever gefunden. Dies entspricht einer Wasseraufnahme von 35%. Zusätzlich konnte aus den Verbiegungsdaten geschlossen werden, dass die Elastizität der Polyelektrolytmultischichten zunimmt, wenn das Polymer gequollen ist. Das thermische Verhalten in Wasser wurde im nächsten Teil an nanomechanischen Cantilever Sensoren, die mit Poly(N-isopropylacrylamid)bürsten (PNIPAM) und plasmapolymerisiertem N,N-Diethylacrylamid beschichtet waren, untersucht. Die Verbiegung des Cantilevers zeigte zwei Bereiche: Bei Temperaturen kleiner der niedrigsten kritischen Temperatur (LCST) ist die Verbiegung durch die Dehydration der Polymerschicht dominiert und bei Temperaturen größer der niedrigsten kritischen Temperatur (LCST) reagiert der Cantilever Sensor überwiegend auf Relaxationsprozesse innerhalb der kollabierten Polymerschicht. Es wurde gefunden, dass das Minimum in der differentiellen Verbiegung mit der niedrigsten kritischen Temperatur von 32°C und 44°C der ausgewählten Polymeren übereinstimmt. Im letzten Teil der Arbeit wurden µ-Reflektivitäts- und µ-GISAXS Experimente eingeführt als neue Methoden, um mikrostrukturierte Proben wie NCS oder PEM Linien mit Röntgenstreuung zu untersuchen. Die Dicke von jedem individuell mit PMMA Bürsten beschichtetem NCS ist im Bereich von 32,9 bis 35,2 nm, was mit Hilfe von µ-Reflektivitätsmessungen bestimmt wurde. Dieses Ergebnis kann mit abbildender Ellipsometrie als komplementäre Methode mit einer maximalen Abweichung von 7% bestätigt werden. Als zweites Beispiel wurde eine gedruckte Polyelektrolytmultischicht aus PAH/PSS untersucht. Die Herstellungsprozedur wurde so modifiziert, dass Goldnanopartikel in die Schichtstruktur eingebracht wurden. Durch Auswertung eines µ-GISAXS Experiments konnte der Einbau der Partikel identifiziert werden. Durch eine Anpassung mit einem Unified Fit Modell wurde herausgefunden, dass die Partikel nicht agglomeriert sind und von einer Polymermatrix umgeben sind.

Das moderne Buch: Harry Graf Kesslers Ästhetik der Lebenskunst im Spiegel der Großherzog Wilhelm Ernst Ausgabe deutscher Klassiker

Die Großherzog Wilhelm Ernst Ausgabe deutscher Klassiker wurde seit 1904 bis in die Zwanziger Jahre hinein im Insel Verlag in Leipzig publiziert. Die Buchreihe hat nicht nur für den Verlag und die Druckerei Poeschel in der sie gedruckt wurde eine ganze Reihe von Neuerungen nach sich gezogen, auch für den deutschen Buchmarkt hat die Klassikerausgabe einen Meilenstein bedeutet. Sie hat einige Eigenschaften des Taschenbuches vorweggenommen. Sie orientierte sich an der Qualität bibliophiler Buchpublikationen, aber war dennoch preislich erschwinglich. Zeitgenössische Klassikerausgaben erschienen zumeist mit einem Kommentar. Nicht so die Großherzog Wilhelm Ernst Ausgabe. Der Text wurde zwar von führenden Wissenschaftlern editiert, aber sie war dennoch unkommentiert. Der Text war in einer Jenson-Antiqua gesetzt obwohl die Debatte um individuell gestaltete Künstlerschriften und die Diskussion um die als deutsche Schrift begriffene Fraktur unter den wichtigsten Protagonisten des deutschen Buchgewerbes ihren Höhepunkt noch nicht erreicht hatte. Ziel für die Klassikerausgabe war darüber hinaus, das zur Jahrhundertwende leicht angestaubte Image der Stadt Weimar aufzupolieren. Über das Patronat des Großherzogs hinaus hätte man die Gewinne aus dem Verkauf der Bücher der Permanenten Ausstellung für die Anschaffung von modernen Kunstobjekten zur Verfügung stellen wollen, die unter der Leitung von Harry Graf Kessler stand. Sieht man den Inhalt der Werke der in der Klassikerreihe erschienen Dichter Goethe, Schiller und Körner in einem ästhetischen Kontext mit dem der Philosophen Schopenhauer und Kant, wird im Spiegel der Formalästhetik der Klassikerausgabe Graf Kesslers Bildungs- und Kulturbegriff erkennbar, der sich in den Jahren nach der Jahrhundertwende zu seinem Lebenskunstideal verdichtete. Der zerrütteten Existenz der Zeitgenossen, wie Friedrich Nietzsche sie beschrieben hatte, sollte der Inhalt der Ausgabe in seiner modernen Form eine moderne Wertehaltung entgegensetzen. Die Lektüre der Klassiker sollte den deutschen Philister „entkrampfen“ und ihm ein Stück der verloren geglaubten Lebensfreude wieder zurück bringen, in dem dieser auch die Facetten des Lebensleids als normal hinnehmen und akzeptieren lernte. Die Klassikerausgabe repräsentierte aus diesem Grund auch den kulturellen und politischen Reformwillen und die gesellschaftlichen Vorstellungen die der Graf für ein modernes Deutschland als überfällig erachtete. Die Buchreihe war aus diesem Grund auch ein politisches Statement gegen die Beharrungskräfte im deutschen Kaiserreich. Die Klassikerreihe wurde in der buchhistorischen Forschung zwar als bedeutender Meilenstein charakterisiert und als „wichtiges“ oder gar „revolutionäres“ Werk der Zeit hervorgehoben, die Ergebnisse der Forschung kann man überspitzt aber in der Aussage zusammenfassen, dass es sich bei der Großherzog Wilhelm Ernst Ausgabe um einen „zufälligen Glückstreffer“ deutscher Buchgestaltung zu handeln scheint. Zumindest lassen die Aussagen, die bisher in dieser Hinsicht gemacht wurden, keine eindeutige Einordnung zu, außer vielleicht der, dass die Klassiker von der englischen Lebensreform inspiriert wurden und Henry van de Velde und William Morris einen Einfluss auf ihre äußere Form hatten. Gerade die Gedankenansätze dieser Beiden nutzte Graf Kessler aber für eigene Überlegungen, die ihn schließlich auch zu eigenen Vorstellungen von idealer Buchgestaltung brachten. Da für Kessler auch Gebrauchsgegenstände Kunst sein konnten, wird das Konzept der Klassikerausgabe bis zur Umsetzung in ihrer `bahnbrechenden´ Form in das ideengeschichtliche und ästhetische Denken des Grafen eingeordnet. Die Klassiker werden zwar in buchhistorischen Einzeluntersuchungen bezüglich ihrer Komponenten, dem Dünndruckpapier, ihrem Einband oder der Schrifttype exponiert. In buchwissenschaftlichen Überblicksdarstellungen wird ihr Einfluss hingegen weniger beachtet, denn verschiedene Kritiker bezogen sie seit ihrem ersten Erscheinen nicht als deutsches Kulturgut mit ein, denn sie lehnten sowohl die englischen Mitarbeiter Emery Walker, Edward Johnston, Eric Gill und Douglas Cockerell wie auch ihre Gestaltung als „welsche“ Buchausgabe ab. Richtig ist, die Großherzog Wilhelm Ernst Ausgabe hatte dieselbe Funktion wie die von Graf Kessler in Weimar konzipierten Kunstausstellungen und die dortige Kunstschule unter der Leitung seines Freundes Henry van de Velde. Auch das für Weimar geplante Theater, das unter der Leitung von Hugo von Hofmannsthal hätte stehen sollen und die Großherzog Wilhelm Ernst Schule, hätten dieselben Ideen der Moderne mit anderen Mitteln transportieren sollen, wie die Großherzog Wilhelm Ernst Ausgabe deutscher Klassiker.

In-vivo-Tumorbiologie mittels 68 Ga-PET: Beurteilung der p-Glykoprotein-Aktivität in Weichgewebe-Tumoren sowie Diagnose und Therapie von Knochenmetastasen

Krebs ist eine der häufigsten Krankheiten und stellt eine der wichtigsten medizinischen Herausforderungen des 21. Jahrhunderts dar. Eine frühzeitige Diagnose ist dabei essentiell für eine individuell angepasste Therapie zur Verbesserung der Lebensqualität und -erwartung der Patienten. Hierbei kommen der 68Ge/68Ga-Generator und das daraus resultierende PET-Nuklid 68Ga immer stärker in den Fokus von Wissenschaft und Medizin. rnrnFür eine erfolgreiche Therapie stellt die Chemoresistenz (Multi-Drug-Resistance) zahlreicher Tumore eine schwerwiegende Komplikation dar. Für das Therapieversagen ist die Aktivierung des Transportproteins p-Glykoprotein (pGP) maßgeblich mit verantwortlich. Mit Hilfe der Schiff’schen Base [68Ga]MFL6.MZ konnte die Aktivitätsänderung von pGP unter verschiedener Beeinflussung erstmals in vivo beobachtet werden. So zeigte sich, dass sich unter azidotischen Bedingungen in Tumoren die Aktivität des pGP erhöht und somit vermehrt auch Zytostatika, die pGP-Substrate sind, aus den Tumoren transportiert werden. Durch Aufklärung der Abhängigkeit der pGP-Aktivität von dessen Signalkaskade konnte gezeigt werden, dass durch eine Blockade der MAP-Kinase p38 eine Erniedrigung der pGP-Aktivität zu verzeichnen ist. Die ebenfalls in der Signalkaskade eingebundene MAP-Kinase ERK1/2 hingegen spielt hier nur eine untergeordnete Rolle.rnrnNeben dem Versagen der Chemotherapie stellt auch die Metastasierung eines Malignoms massive Einschnitte in die Lebensqualität von Erkrankten dar. Befallen die Metastasen das Skelett eines Menschen, wird dies zumeist erst spät registriert. 68Ga-markierte Bisphosphonate bieten nun die Möglichkeit, Patienten quantitativ auf Knochenmetastasen hin untersuchen zu können. So konnten zu Beginn einfache Phosphonate wie EDTMP und DOTP nicht die nötige in vivo Stabilität bzw. hohe radiochemische Ausbeuten liefern und sind damit für die Anwendung am Menschen uninteressant. Jedoch die DOTA-basierten Bisphosphonate allen voran der Ligand BPAMD zeigen ein großes Potential. In vivo-Versuche an Ratten mit Knochenmetastasen zeigten, dass sich [68Ga]BPAMD an den Metastasen anreichert und einen sehr guten Kontrast zum gesunden Knochen darstellt. Der Tracer konnte erstmals am Menschen angewendet werden und zeigte in ausgewählten Regionen eine höhere Anreicherung als eine zuvor durchgeführte PET-Aufnahme mit [18F]Fluorid. Der Ligand BPAMD bietet außerdem den Vorteil, neben 68Ga auch andere dreiwertige Radionuklide wie das therapeutische 177Lu komplexieren zu können. Durch Studien zur Komplexbildung und Stabilität konnte auch [177Lu]BPAMD in der klinischen Anwendung erprobt werden und zeigte eine Anreicherung an den Knochenmetastasen. So ist es nun möglich, Knochenmetastasen mittels 68Ga-PET zu diagnostizieren, eine entsprechende Dosisberechnung anzustellen und anschließend mit dem gleichen Liganden eine Therapie mit [177Lu]BPAMD durchzuführen.

Asymmetrisches Dimethylarginin als kardiovaskulärer Risikofaktor : Transportmechanismen und Auswirkungen einer Akkumulation

Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit dem Membrantransporter-vermittelten Export von asymmetrischem Dimethyl-L-Arginin (ADMA) aus der Endothelzelle. Da ADMA-Plasmakonzentrationen mit Erkrankungen wie koronaren Herzkrankheiten, Atherosklerose, Bluthochdruck und Endotheldysfunktion in Verbindung gebracht werden, ist ein effektiver ADMA-Export aus der Zelle heraus unabdingbar. Um den Mechanismus hierfür aufzuklären, wurden die immortalisierte Endothelzelllinie EA.hy926 und weitere primäre Endothelzellen (humane Umbilikalvenenendothelzellen und Endothelzellen der großen und kleinen Herzgefäße) auf die Expression basischer Aminosäuretransporter mittels einer qRT-PCR hin untersucht. Dabei zeigte sich, dass alle getesteten Endothelzellen die Aminosäuretransporter hCAT-1, y+LAT1 und y+LAT2 exprimierten. Basierend auf ADMA-Exportdaten, die mit entsprechenden Transporter-überexprimierenden Xenopus laevis-Oozyten gewonnen wurden, wurde festgestellt, dass alle drei Membrantransporter ADMA exportieren konnten. Der physiologisch wichtige Exportweg für intrazellulär anfallendes ADMA scheint dabei der via y+L zu sein, da es sich hierbei um einen aktiven Exportmechanismus handelt, der im Gegentransport von im humanen Plasma reichlich vorhandenen neutralen Aminosäuren und Natriumionen den nach innen gerichteten Natriumgradienten ausnutzt. Die Wichtigkeit des Membrantransportes für die Kontrolle intrazellulärer ADMA-Konzentrationen wurde in vitro durch Entzug von extrazellulären Austauschsubstraten und einer daraus resultierenden Blockade der Transportfunktion gezeigt. Hierbei wurde innerhalb von zwei Stunden ein 2,5-facher Anstieg der intrazellulären ADMA-Konzentration festgestellt, die bei Präsenz von Austauschsubstrat für die Transporter nicht auftrat. Die Relevanz der y+LATs für den ADMA-Export wurde durch Herunterregulation dieser Proteine mittels siRNA sichtbar: Unter diesen Bedingungen konnte ADMA auch in Anwesenheit von Austauschsubstrat für das System y+L weniger effektiv exportiert werden. Eine wichtige Aufgabe des humanen Endothels ist die Bildung bioaktiven Stickstoffmonoxids, das unter anderem eine Vasodilatation der Gefäße bewirkt. Für diese NO-Synthese wird L-Arginin als Substrat von der endothelialen NO-Synthase benötigt. ADMA stellt einen kompetitiven Inhibitor dar, dessen erhöhtes intrazelluläres Vorkommen möglicherweise hemmend auf die NO-Synthase wirken könnte. Es konnten hier allerdings keine Auswirkungen eines um das 4-fache gestiegenen, intrazellulären ADMA-Spiegels auf die Tätigkeit der endothelialen NO-Synthase festgestellt werden. Möglicherweise bedarf es eines noch weiter zu Gunsten des ADMAs verschobenen, intrazellulären L-Arginin:ADMA-Verhältnisses, um eine Hemmung der NO-Synthase festzustellen. Dies könnte bei einem pathologischen Transporterausfall eintreten, der intrazellulär permanent höhere ADMA-Konzentrationen zur Folge hätte. Des Weiteren hätte ein Anstieg der Arginasetätigkeit und damit einhergehend ein Substratdefizit für die NO-Synthase den gleichen Effekt. Der translationale Ansatz mit humanen peripheren mononukleären Blutzellen von Patienten aus der 2. Medizinischen Klinik zeigte die Tendenz einer Korrelation zwischen dem ADMA-Exportvermögen und der Endothelfunktion und brachte zudem die Erkenntnis eines individuell äußerst variablen ADMA-Exportvermögens zutage.

Untersuchungen zur Plasmapheresetherapie bei Patienten mit thrombotisch thrombozytopenischer Purpura

Die thrombotische thrombozytopenische Purpura (TTP) ist charakterisiert durch eine Triade aus Thrombozytopenie, hämolytischer Anämie und Mikrothromben. Ursächlich für diese Mikroangiopathie ist ein Mangel der Von Willebrand Faktor (VWF)-spaltenden Protease, ADAMTS13, der durch Autoantikörper oder eine genetische Mutation bedingt sein kann. In der Folge treten hochmolekulare, prothrombotische VWF Multimere im Blut auf, die eine Plättchenadhäsion und -aggregation initiieren, die zu mikrovaskulären Thromben in den Arteriolen und Kapillaren zahlreicher Organe insbesondere im zentralen Nervensystem führt. rnMomentan ist der Goldstandard der Therapie dieser ansonsten tödlich verlaufenden Erkrankung, die Plasmapherese (PEX). Hierfür stehen mit Fresh Frozen Plasma (FFP) und solvent/detergent (s/d) Plasma zwei Präparate zur Verfügung. Die Effizienz der Therapie bei der TTP konnte in den letzten Jahrzehnten im klinischen Alltag belegt werden, dennoch geht die intensive und invasive Therapie mit vielen Risiken und Nebenwirkungen für die Patienten einher, die in dieser Arbeit herausgearbeitet werden sollten. rnIn einer deutschlandweiten Patientenstudie wurde retrospektiv, mittels Fragebögen, ein Nebenwirkungsprofil der Plasmapherese erstellt, sowie mögliche Prädispositionen für die TTP untersucht. Zudem wurden mögliche Auslöser für das Auftreten einer klinisch manifesten TTP analysiert. Die Auswertung zeigte, dass Parästhesien (64,4 %) und Schüttelfrost (61,2 %) als häufigste Nebenwirkungen der PEX bei den Patienten auftraten. Weitere Symptome waren vermehrte Kopfschmerzen (50,6 %) und Tachykardien (36,8 %). Nebenwirkungen wie schwerer Kollaps (9 %) traten selten auf. Patienten mit Allergien in der Anamnese reagierten nicht empfindlicher auf die PEX, als andere. Ein Unterschied in der Häufigkeit der Nebenwirkungen hinsichtlich der verschiedenen Plasmapräparate konnte nicht gezeigt werden, relativiert wird dies durch den sehr geringen Einsatz von Octaplas® bei der untersuchten Patientenkohorte.rnEs konnte eine deutliche Verbindung zwischen dem Auftreten der TTP und anderen Autoimmunerkrankungen gezeigt werden. Von insgesamt 87 Patienten leiden 20,8 % an einer weiteren Autoimmunerkrankung. Insbesondere die Hashimoto Thyreoiditis liegt bei den Befragten als häufige Begleiterkrankung vor. Die genetische Prädisposition hat sich in den vergangen Jahren als ein primärer Risikofaktor für die TTP herausgestellt.rnAls mögliche Trigger eines TTP Schubes konnten Infektionen (38,7 %), Medikamente (u.a. Kontrazeptiva, Chinolone, Clarithromycin) (24,3 %), und Schwangerschaft (5,4 %) ausgemacht werden.rnEin weiterer Untersuchungspunkt der Dissertation war die Beurteilung der ADAMTS13-Aktivität in den Plasmapräparaten. Hierfür wurden drei verschieden Methoden, zwei auf Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer beruhende Assays und eine turbidimetrische Messung, verwendet. In allen Methoden konnte eine physiologische ADAMTS13-Aktivität, 646 ng/ml für FFP und 634 ng/ml für Octaplas®, gemessen werden, die sich für beide Präparate nicht signifikant unterschied. Auffällig waren jedoch die höheren Schwankungen der Aktivität bei den verschiedenen Chargen bei FFP gegenüber Octaplas®. rnAufgrund des Herstellungsverfahrens bietet Octaplas® einen sichereren Schutz vor Virusübertragungen und dem Auftreten von TRALI als FFP. Jedoch kann es aufgrund der niedrigen Konzentration an Protein S prothrombotisch wirken. FFP enthält dagegen einen höheren Gehalt an Gerinnungsfaktoren. rnAbschließend ist festzuhalten, dass beide Präparate für die Therapie der TTP geeignet sind. Welches Präparat gewählt wird, sollte individuell für den zu behandelnden Patienten entschieden werden. Bei TTP-Patienten, die in der Vergangenheit bereits sensibel auf FFP reagierten, bietet sich eine Therapie mit Octaplas® an. Die schnelle Bereitstellung einer adäquaten Therapie spielt bei der thrombotisch thrombozytopenischen Purpura die entscheidende Rolle.

Anpassung des Metamodells PerPot an den ausdauerorientierten Laufsport zur Trainings- und Wettkampfoptimierung

Schon seit einigen Jahrzehnten wird die Sportwissenschaft durch computergestützte Methoden in ihrer Arbeit unterstützt. Mit der stetigen Weiterentwicklung der Technik kann seit einigen Jahren auch zunehmend die Sportpraxis von deren Einsatz profitieren. Mathematische und informatische Modelle sowie Algorithmen werden zur Leistungsoptimierung sowohl im Mannschafts- als auch im Individualsport genutzt. In der vorliegenden Arbeit wird das von Prof. Perl im Jahr 2000 entwickelte Metamodell PerPot an den ausdauerorientierten Laufsport angepasst. Die Änderungen betreffen sowohl die interne Modellstruktur als auch die Art der Ermittlung der Modellparameter. Damit das Modell in der Sportpraxis eingesetzt werden kann, wurde ein Kalibrierungs-Test entwickelt, mit dem die spezifischen Modellparameter an den jeweiligen Sportler individuell angepasst werden. Mit dem angepassten Modell ist es möglich, aus gegebenen Geschwindigkeitsprofilen die korrespondierenden Herzfrequenzverläufe abzubilden. Mit dem auf den Athleten eingestellten Modell können anschliessend Simulationen von Läufen durch die Eingabe von Geschwindigkeitsprofilen durchgeführt werden. Die Simulationen können in der Praxis zur Optimierung des Trainings und der Wettkämpfe verwendet werden. Das Training kann durch die Ermittlung einer simulativ bestimmten individuellen anaeroben Schwellenherzfrequenz optimal gesteuert werden. Die statistische Auswertung der PerPot-Schwelle zeigt signifikante Übereinstimmungen mit den in der Sportpraxis üblichen invasiv bestimmten Laktatschwellen. Die Wettkämpfe können durch die Ermittlung eines optimalen Geschwindigkeitsprofils durch verschiedene simulationsbasierte Optimierungsverfahren unterstützt werden. Bei der neuesten Methode erhält der Athlet sogar im Laufe des Wettkampfs aktuelle Prognosen, die auf den Geschwindigkeits- und Herzfrequenzdaten basieren, die während des Wettkampfs gemessen werden. Die mit PerPot optimierten Wettkampfzielzeiten für die Athleten zeigen eine hohe Prognosegüte im Vergleich zu den tatsächlich erreichten Zielzeiten.

Individualisierte Krebstherapie : präklinischer „proof of concept“ einer mutationsspezifischen Immuntherapie

Da nicht-synonyme tumorspezifische Punktmutationen nur in malignen Geweben vorkommen und das veränderte Proteinprodukt vom Immunsystem als „fremd“ erkannt werden kann, stellen diese einen bisher ungenutzten Pool von Zielstrukturen für die Immuntherapie dar. Menschliche Tumore können individuell bis zu tausenden nicht-synonymer Punktmutationen in ihrem Genom tragen, welche nicht der zentralen Immuntoleranz unterliegen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Hypothese zu untersuchen, dass das Immunsystem in der Lage sein sollte, mutierte Epitope auf Tumorzellen zu erkennen und zu klären, ob auf dieser Basis eine wirksame mRNA (RNA) basierte anti-tumorale Vakzinierung etabliert werden kann. Hierzu wurde von Ugur Sahin und Kollegen, das gesamte Genom des murinen B16-F10 Melanoms sequenziert und bioinformatisch analysiert. Im Rahmen der NGS Sequenzierung wurden mehr als 500 nicht-synonyme Punktmutationen identifiziert, von welchen 50 Mutationen selektiert und durch Sanger Sequenzierung validiert wurden. rnNach der Etablierung des immunologischen Testsysteme war eine Hauptfragestellung dieser Arbeit, die selektierten nicht-synonyme Punktmutationen in einem in vivo Ansatz systematisch auf Antigenität zu testen. Für diese Studien wurden mutierte Sequenzen in einer Länge von 27 Aminosäuren genutzt, in denen die mutierte Aminosäure zentral positioniert war. Durch die Länge der Peptide können prinzipiell alle möglichen MHC Klasse-I und -II Epitope abgedeckt werden, welche die Mutation enthalten. Eine Grundidee des Projektes Ansatzes ist es, einen auf in vitro transkribierter RNA basierten oligotopen Impfstoff zu entwickeln. Daher wurden die Impfungen naiver Mäuse sowohl mit langen Peptiden, als auch in einem unabhängigen Ansatz mit peptidkodierender RNA durchgeführt. Die Immunphänotypisierung der Impfstoff induzierten T-Zellen zeigte, dass insgesamt 16 der 50 (32%) mutierten Sequenzen eine T-Zellreaktivität induzierten. rnDie Verwendung der vorhergesagten Epitope in therapeutischen Vakzinierungsstudien bestätigten die Hypothese das mutierte Neo-Epitope potente Zielstrukturen einer anti-tumoralen Impftherapie darstellen können. So wurde in therapeutischen Tumorstudien gezeigt, dass auf Basis von RNA 9 von 12 bestätigten Epitopen einen anti-tumoralen Effekt zeigte.rnÜberaschenderweise wurde bei einem MHC Klasse-II restringierten mutiertem Epitop (Mut-30) sowohl in einem subkutanen, als auch in einem unabhängigen therapeutischen Lungenmetastasen Modell ein starker anti-tumoraler Effekt auf B16-F10 beobachtet, der dieses Epitop als neues immundominantes Epitop für das B16-F10 Melanom etabliert. Um den immunologischen Mechanismus hinter diesem Effekt näher zu untersuchen wurde in verschieden Experimenten die Rolle von CD4+, CD8+ sowie NK-Zellen zu verschieden Zeitpunkten der Tumorentwicklung untersucht. Die Analyse des Tumorgewebes ergab, eine signifikante erhöhte Frequenz von NK-Zellen in den mit Mut-30 RNA vakzinierten Tieren. Das NK Zellen in der frühen Phase der Therapie eine entscheidende Rolle spielen wurde anhand von Depletionsstudien bestätigt. Daran anschließend wurde gezeigt, dass im fortgeschrittenen Tumorstadium die NK Zellen keinen weiteren relevanten Beitrag zum anti-tumoralen Effekt der RNA Vakzinierung leisten, sondern die Vakzine induzierte adaptive Immunantwort. Durch die Isolierung von Lymphozyten aus dem Tumorgewebe und deren Einsatz als Effektorzellen im IFN-γ ELISPOT wurde nachgewiesen, dass Mut-30 spezifische T-Zellen das Tumorgewebe infiltrieren und dort u.a. IFN-γ sekretieren. Dass diese spezifische IFN-γ Ausschüttung für den beobachteten antitumoralen Effekt eine zentrale Rolle einnimmt wurde unter der Verwendung von IFN-γ -/- K.O. Mäusen bestätigt.rnDas Konzept der individuellen RNA basierten mutationsspezifischen Vakzine sieht vor, nicht nur mit einem mutations-spezifischen Epitop, sondern mit mehreren RNA-kodierten Mutationen Patienten zu impfen um der Entstehung von „escape“-Mutanten entgegenzuwirken. Da es nur Erfahrung mit der Herstellung und Verabreichung von Monotop-RNA gab, also RNA die für ein Epitop kodiert, war eine wichtige Fragestellungen, inwieweit Oligotope, welche die mutierten Sequenzen sequentiell durch Linker verbunden als Fusionsprotein kodieren, Immunantworten induzieren können. Hierzu wurden Pentatope mit variierender Position des einzelnen Epitopes hinsichtlich ihrer in vivo induzierten T-Zellreaktivitäten charakterisiert. Die Experimente zeigten, dass es möglich ist, unabhängig von der Position im Pentatop eine Immunantwort gegen ein Epitop zu induzieren. Des weiteren wurde beobachtet, dass die induzierten T-Zellfrequenzen nach Pentatop Vakzinierung im Vergleich zur Nutzung von Monotopen signifikant gesteigert werden kann.rnZusammenfassend wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit präklinisch erstmalig nachgewiesen, dass nicht-synonyme Mutationen eine numerisch relevante Quelle von Zielstrukturen für die anti-tumorale Immuntherapie darstellen. Überraschenderweise zeigte sich eine dominante Induktion MHC-II restringierter Immunantworten, welche partiell in der Lage waren massive Tumorabstoßungsreaktionen zu induzieren. Im Sinne einer Translation der gewonnenen Erkenntnisse wurde ein RNA basiertes Oligotop-Format etabliert, welches Eingang in die klinische Testung des Konzeptes fand.rn