Asymmetrisches Dimethylarginin als kardiovaskulärer Risikofaktor : Transportmechanismen und Auswirkungen einer Akkumulation

Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit dem Membrantransporter-vermittelten Export von asymmetrischem Dimethyl-L-Arginin (ADMA) aus der Endothelzelle. Da ADMA-Plasmakonzentrationen mit Erkrankungen wie koronaren Herzkrankheiten, Atherosklerose, Bluthochdruck und Endotheldysfunktion in Verbindung gebracht werden, ist ein effektiver ADMA-Export aus der Zelle heraus unabdingbar. Um den Mechanismus hierfür aufzuklären, wurden die immortalisierte Endothelzelllinie EA.hy926 und weitere primäre Endothelzellen (humane Umbilikalvenenendothelzellen und Endothelzellen der großen und kleinen Herzgefäße) auf die Expression basischer Aminosäuretransporter mittels einer qRT-PCR hin untersucht. Dabei zeigte sich, dass alle getesteten Endothelzellen die Aminosäuretransporter hCAT-1, y+LAT1 und y+LAT2 exprimierten. Basierend auf ADMA-Exportdaten, die mit entsprechenden Transporter-überexprimierenden Xenopus laevis-Oozyten gewonnen wurden, wurde festgestellt, dass alle drei Membrantransporter ADMA exportieren konnten. Der physiologisch wichtige Exportweg für intrazellulär anfallendes ADMA scheint dabei der via y+L zu sein, da es sich hierbei um einen aktiven Exportmechanismus handelt, der im Gegentransport von im humanen Plasma reichlich vorhandenen neutralen Aminosäuren und Natriumionen den nach innen gerichteten Natriumgradienten ausnutzt. Die Wichtigkeit des Membrantransportes für die Kontrolle intrazellulärer ADMA-Konzentrationen wurde in vitro durch Entzug von extrazellulären Austauschsubstraten und einer daraus resultierenden Blockade der Transportfunktion gezeigt. Hierbei wurde innerhalb von zwei Stunden ein 2,5-facher Anstieg der intrazellulären ADMA-Konzentration festgestellt, die bei Präsenz von Austauschsubstrat für die Transporter nicht auftrat. Die Relevanz der y+LATs für den ADMA-Export wurde durch Herunterregulation dieser Proteine mittels siRNA sichtbar: Unter diesen Bedingungen konnte ADMA auch in Anwesenheit von Austauschsubstrat für das System y+L weniger effektiv exportiert werden. Eine wichtige Aufgabe des humanen Endothels ist die Bildung bioaktiven Stickstoffmonoxids, das unter anderem eine Vasodilatation der Gefäße bewirkt. Für diese NO-Synthese wird L-Arginin als Substrat von der endothelialen NO-Synthase benötigt. ADMA stellt einen kompetitiven Inhibitor dar, dessen erhöhtes intrazelluläres Vorkommen möglicherweise hemmend auf die NO-Synthase wirken könnte. Es konnten hier allerdings keine Auswirkungen eines um das 4-fache gestiegenen, intrazellulären ADMA-Spiegels auf die Tätigkeit der endothelialen NO-Synthase festgestellt werden. Möglicherweise bedarf es eines noch weiter zu Gunsten des ADMAs verschobenen, intrazellulären L-Arginin:ADMA-Verhältnisses, um eine Hemmung der NO-Synthase festzustellen. Dies könnte bei einem pathologischen Transporterausfall eintreten, der intrazellulär permanent höhere ADMA-Konzentrationen zur Folge hätte. Des Weiteren hätte ein Anstieg der Arginasetätigkeit und damit einhergehend ein Substratdefizit für die NO-Synthase den gleichen Effekt. Der translationale Ansatz mit humanen peripheren mononukleären Blutzellen von Patienten aus der 2. Medizinischen Klinik zeigte die Tendenz einer Korrelation zwischen dem ADMA-Exportvermögen und der Endothelfunktion und brachte zudem die Erkenntnis eines individuell äußerst variablen ADMA-Exportvermögens zutage.

The present thesis employs the membrane transporter-mediated export of asymmetric dimethyl-L-arginine (ADMA) out of the endothelial cell. There is an indispensable need for an effective ADMA export as ADMA plasma concentrations are associated with coronary heart diseases, atherosclerosis, high blood pressure and endothelial dysfunction. To elucidate the underlying mechanism, the immortalized endothelial cell line EA.hy926 and other primary endothelial cells (from human umbilical veins and endothelial cells from coronary arteries) were analyzed for the expression of cationic amino acid transporters by qRT-PCR. This showed an endothelial expression of the amino acid transporters hCAT-1, y+LAT1 und y+LAT2. ADMA export data obtained with transporter-overexpressing Xenopus laevis-oocytes revealed ADMA as substrate for all three membrane transporters. The physiologically important export pathway seems to be via y+L because it acts as an active export pump for basic amino acids using the inside-directed sodium gradient to import sodium and neutral amino acids that are more abundant in human plasma. The importance of membrane transport for the control of intracellular ADMA concentrations was showed in vitro by depriving extracellular exchange substrates which caused a blockade of transporter function. This resulted in a 2.5-fold increase of the intracellular ADMA concentration in two hours that was not detected under presence of exchange substrate. The relevance of the y+LATs for the ADMA export became apparent after down-regulation of the protein by means of siRNA: under this condition ADMA was exported less effective even in the presence of exchange substrate. One important function of human endothelium is the production of bioactive nitric oxide that causes a vasodilation of the vessels among other things. The endothelial NO-synthase uses L-arginine as substrate for this NO synthesis. ADMA represents a competitive inhibitor and an increased intracellular occurrence could possibly inhibit the NO synthesis. Yet a 4-fold increased intracellular ADMA level did not affect NO-synthase activity. Potentially a less pronounced intracellular L-arginine:ADMA-relation is necessary to determine an inhibited NO-synthase activity. This could occur with a pathological transporter failure which would entail in permanently increased intracellular ADMA concentrations. Furthermore, an increased arginase activity along with a substrate deficit would have the same effect. The translational approach with human peripheral blood mononuclear cells from patients from the 2nd Medical Clinic tended to show a correlation between ADMA export activity and endothelial function. In addition, the pilot study showed that ADMA export activity is individually variable.