Glykopolymere für biomedizinsche Anwendungen : Synthese von mannosylierten N-(2-Hydroxyprpyl)methacrylamid Polymersystemen für die Adressierung von Zellen des Immunsystems

Das Ziel dieser Arbeit lag darin mannosylierte Polymersysteme hauptsächlich auf der Basis von N-(Hydroxy)propylmethacrylat zu synthetisieren, um gezielt Zellen des Immunsystems zu adressieren. Dazu wurden zunächst verschiedene Reaktivesterpolymere auf der Basis von Pentafluorophenylmethacrylat (PFPMA) unter Verwendung der RAFT-Polymerisation mit enger Molekulargewichtsverteilung und unterschiedlichen Anteilen an LMA (Laurylmethacrylat) hergestellt.rnUm eine genaue Aussage über den Aufbau eines statistischen PFPMA-LMA Copolymers treffen zu können, wurde die Copolymerisation von PFPMA und LMA mittels Echtzeit 1H-NMR Kinetikmessungen untersucht. Dies ermöglichte es, die Copolymerisationsparameter zu berechnen und genaue Aussagen über den Aufbau eines statistischen PFPMA-LMA Copolymers zu treffen. Die so erhaltenen Reaktivesterpolymere wurden dann in einer polymeranalogen Reaktion unter Erhalt des Polymerisationsgrades in die gewünschten HPMA-Polymere umgewandelt. Um die quantitative Umsetzung ohne auftretende Nebenreaktionen zu untersuchen, wurden verschiedene Reaktionsbedingungen gewählt und unterschiedliche Analysemethoden verwendet. Damit konnte gezeigt werden, dass es möglich ist, über den Reaktivesteransatz qualitativ hochwertige amphiphile Polymersysteme herzustellen, die auf anderen Wegen schwer zu synthetisieren und charakterisieren sind. Ein weiterer Vorteil dieser Syntheseroute ist, dass gleichzeitig sowohl Marker für die Visualisierung der Polymere in vitro und in vivo, als auch Targetliganden für die Adressierung bestimmter Zellen eingeführt werden können. Dafür wurde hauptsächlich Mannose als einfache Zuckerstruktur angebunden, da bekannt ist, dass mannosylierte Polymersysteme von Zellen des Imunsystems aufgenommen werden. Zusätzlich konnten die mannosylierten Polymere mit hydrophobem Wirkstoff beladen werden, wobei die Stabilität von beladenen Mizellen anhand der Einlagerung eines hydrophoben radioaktiven Komplexes genauer untersucht werden konnte.rnAnschließende in vitro Experimente der mannosylierten Polymermizellen an dendritischen Zellen zeigten wie erwartet eine mannosespezifische und verstärkte Aufnahme. Für eine mögliche Untersuchung dieser Systeme in vivo mittels PET konnte gezeigt werden, dass es möglich ist HPMA Polymere radioaktiv zu markieren, wobei auch erste Markierungsversuche mit einem langlebigen Radionuklid für Langzeitbiodistributionsstudien durchgeführt werden konnte.rn

Synthese und radioaktive Markierung potentieller PET- bzw. SPECT-Liganden zur Quantifizierung und Visualisierung der pankreatischen beta-Zell-Masse

Abstract Due to the ongoing efforts in transplanting b-cell mass there is also a great medical interest in specific b-cell imaging agents to quantify the acceptance of transplanted islets in humans in vivo. Additionally, in the context of type 1 diabetes mellitus the chronic and progressive loss of b-cells caused by autoimmune destruction has led to concerted efforts to prevent further loss of b-cells by autoantigen-specific immunotherapy of pre-diabetic patients. nateglinide and glibenclamide are SUR1 ligands used to stimulate insulin secretion in type 2 diabetic patients. They bind to a class of molecules known as the ATP-sensitive potassium channels, located on the insulin producing b-cells of the islets of Langerhans and are therefore excellent candidates as b-cell specific tracers. To obtain a precursor for a direct labelling of nateglinide with [18F]fluoride, the aromatic system of the phenylalanine structure element was derivatised to obtain a phenolic OH-group in 4-position which is capable of further derivatisation. The formed phenylether N-(trans-4-isopropylcyclohexanecarbonyl)-O-(2-hydroxyethyl)-D-tyrosin benzylester was tried to be tosylated according to several literature procedures but none of them was applicable. The catalytic influence of ytterbium(III)triflate in the reaction of toluenesulfonic acid anhydride and the alcohol was investigated. It was found that Yb(III) facilitates the tosylation of the alcohol under non-basic conditions and was extended to the tosylation of a great variety of different alcohols to prove its applicability in general. The radioactive labelling of N-(trans-4-isopropyl-cyclohexanecarbonyl)-O-(2-[18F]fluoroethyl)-D-tyrosine with [18F]F-/ Kryptofix® 222/ K2CO3-system was achieved in radiochemical yields (RCY) of 10 % after deprotection with Pd/ C and H2. In addition to the direct labelling approach, a labelling procedure applying 2[18F]fluoroethyltosylate and N-(trans-4-isopropyl-cyclohexanecarbonyl)-D-tyrosin was performed in 40 % RCY. Unfortunately the determination of the KD value of N-(trans-4-isopropylcyclohexanecarbonyl)-O-(2-fluoroethyl)-D-tyrosine revealed a significant decrease in affinity compared to original nateglinide. The in vivo evaluation of some 18F-labelled glibenclamide derivatives in humans and animals revealed that longer measuring times are warranted because a high liver uptake spoiles the data acquisition and the activity washout proceeds very slowly. Therefore glibenclamide was labelled with a radioisotope with a longer half life such as 99mTc (t1/2 = 6 h) to lengthen the possible time frame for image acquisition. The synthesis of a 99mTc labelled hydrophilic glibenclamide derivative was performed. It is hoped that gliben-clamide is internalised into the b-cell and there binds to the 95 % of intracellular SUR-1 receptors with eventual metablolisation and thus trapping in the cell. The KD-value of the corresponding Re-compound was determined to be 0.5 nM and the insulin secretion properties were similar to those of original glibenclamide. The labelling precursor N-{4-[N,N-bis-(carboxy-methyl)-aminoethyl)-5-chlorobenzene-carboxamido]-ethyl}-benzene-sulfonyl-N'-cyclohexyl urea tris sodium salt was reacted with [99mTc(I)(OH2)3(CO)3] Cl to yield the final N-{4-[99mTc(I)-tricarbonyl-N,N-bis-(carboxymethyl)-aminoethyl)-5-chloro-benzene-carboxamidoethyl]-benzene-sulfonyl}-N'-cyclo-hexyl-urea sodium salt in 70% RCY.

Synthese, 11 C- und 18 F-Markierung und Evaluierung von Repaglinid-Derivaten zur Quantifizierung der pankreatischen beta-Zell-Masse in vivo mittels PET

Diabetes mellitus umfasst eine heterogene Gruppe von Stoffwechselfunktionsstörungen, die durch hohe Blut-Glukose-Werte gekennzeichnet sind. Zwei Haupttypen von Diabetes mellitus wurden definiert: Typ 1- und Typ 2-Diabetes. Repaglinid ist ein neuer, schnell wirksamer, bei Typ 2-Diabetikern eingesetzter prandialer Glukose-Regulator mit einer kurzen Plasmahalbwertszeit (<1 Stunde) und der erste Vertreter der Carbamoylmethylbenzoesäure Familie, der in klinischen Studien getestet wurde. Die 18F- und 11C-markierten Repaglinid-Derivate (S)-2-(2-[18F]Fluorethoxy)-4-((3-methyl-1-(2-piperidin-1-yl-phenyl)-butylcarbamoyl)-methyl)-benzoesäure ([18F]Fluorethoxy-desethoxy-Repaglinid) und (S)-2-([11C]Methoxy)-4-([3-methyl-1-(2-piperidin-1-yl-phenyl)-butyl-carba-moyl]-benzoesäure ([11C]Methoxy-desethoxy-Repaglinid) wurden als potentielle Tracer für die nicht-invasive Quantifizierung des Sulfonylharnstoffrezeptor-Typ1-Status (SUR-1) der Insulin-sezernierenden -Zellen mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) synthetisiert. [18F]Fluorethoxy-desethoxy-Repaglinide konnte in einer radiochemischen Ausbeute (RCA) von 20% nach 135 Minuten mit einer radiochemischen Reinheit >98% unter Verwendung des sekundären Markierungsvorläufers 2-[18F]Fluorethyltosylat erhalten werden. Die spezifische Aktivität lag im Bereich von 50-60 GBq/µmol. Für die radioaktive Synthese des [11C]Methoxy-desethoxy-Repaglinids wurde der sekundäre Markierungsvorläufer [11C]Methyliodid verwendet. Der 11C-Radiotracer wurde in einer RCA von 35% (bezogen auf [11C]CO2) mit einer spezifischen Aktivität von 40-70 GBq/µmol erhalten. Um die Eigenschaften des fluorierten sowie des methoxylierten Repaglinids zu charakterisieren, wurde die Affinität beider Verbindungen zum humanen SUR-1 evaluiert. [19F]Fluorethoxy-desethoxy-Repaglinid und Methoxy-desethoxy-Repaglinid induzierten Verdrängungskurven mit Hill-Koeffizienten nahe 1 und ergaben Dissotiationskonstanten (KD) von 142 nM beziehungsweise 83 nM - vergleichsweise geringe Verluste relativ zu Original-Repaglinid. Die biologische Aktivität wurde mittels Insulin-Sekretionstests an isolierten Ratten-Inselzellen gezeigt und war ebenfalls mit der des Repaglinids vergleichbar. Schließlich wurde die Biodistribution des [18F]Fluorethoxy-desethoxy-Repaglinids in gesunden Sprague-Dawley-Ratten durch Messung der Konzentration der Verbindung in verschiedenen Organen nach intravenöser Injektion untersucht. Das pankreatische Gewebe zeigte im Zeitintervall zwischen 10 und 30 Minuten nach Injektion eine stabile Akkumulation von etwa 0.12% der injizierten Dosis. 50% dieser Tracer-Akkulmulation konnten durch zusätzliche Injektion von nicht-radioaktiv-markiertem Repaglinid verdrängt werden, was auf eine mögliche Eignung des [18F]Fluorethoxy-desethoxy-Repaglinids für in vivo-Untersuchungen mittels PET schließen lässt. Eine erste humane PET-Studie zeigte zwar ebenfalls eine stabile, allerdings nur geringere Akkumulation von [18F]Fluorethoxy-desethoxy-Repaglinid im Pankreas und eine überproportional hohe Aktivitätsanreicherung in der Leber. Die Radioaktivitäts-akkumulation im Blut fiel nach wenigen Minuten unter die des Pankreas.

Production, radiochemical separation and chemical coupling of radioactive arsenic isotopes to synthesize radiopharmaceuticals for molecular imaging

Noninvasive molecular-imaging technologies are playing a keyrole in drug discovery, development and delivery. Positron Emission Tomography (PET) is such a molecular imaging technology and a powerful tool for the observation of various diseases. However, it is limited by the availability of agents with high selectivity to the target and a physical half-life of the used positron emitting nuclide which matches the biological half-life of the observed process. For the long lasting enrichment of antibodies in tumor tissue few suitable isotopes for PET imaging are currently available. The element arsenic provides a range of isotopes, which could be used for diagnosis and also for endoradiotherapy. This work describes the development of radiochemical separation procedures to separate arsenic isotopes in no-carrier-added (nca) purity from reactor or cyclotron irradiated targets, the development and evaluation of a labeling chemistry to attach these separated arsenic isotopes to monoclonal antibodies, the in vitro and in vivo evaluation of antibodies labeled with radioactive arsenic isotopes and the molecular imaging using small animal PET.

Synthesis and evaluation of 18-F-radiopharmaceuticals within the serotonergic receptor system for molecular imaging

Molecular imaging technologies as Positron Emission Tomography (PET) are playing a key role in drug discovery, development and delivery due to the possibility to quantify e.g. the binding potential in vivo, non-invasively and repetitively. In this context, it provides a significant advance in the understanding of many CNS disorders and conditions. The serotonergic receptor system is involved in a number of important physiological processes and diseases such as depression, schizophrenia, Alzheimer’s disease, sleep or sexual behaviour. Especially, the 5-HT2A and the 5-HT1A receptor subtypes are in the focus of fundamental and clinical research due to the fact that many psychotic drugs interact with these neuronal transmembrane receptors. This work describes the successful development, as well as in vitro and in vivo evaluation of 5-HT2A and 5-HT1A selective antagonistic PET-radiotracers. The major achievements obtained in this thesis are: 1. the development and in vitro evaluation of several 5-HT2A antagonistic compounds, namely MH.MZ (Ki = 9.0 nM), (R)-MH.MZ (Ki = 0.72 nM) and MA-1 (Ki = 3.0 nM). 2. the 18F-labeling procedure of these compounds and their optimization, whereby radiochemical yields > 35 % in high specific activities (> 15 GBq/µmol) could be observed. Synthesis time inclusive secondary synthon synthesis, the radioactive labeling procedure, separation and final formulation took no longer than 120 min and provided the tracer in high radiochemical purity. 3. the in vivo µPET evaluation of [18F]MH.MZ and (R)-[18F]MH.MZ resulting in promising imaging agents of the 5-HT2A receptor status; from which (R)-[18F]MH.MZ seems to be the most promising ligand. 4. the determination of the influence of P-gp on the brain biodistribution of [18F]MH.MZ showing a strong P-gp dependency but no regional alteration. 5. the four-step radiosynthesis and evaluation of [18F]MDL 100907 resulting in another high affine tracer, which is, however, limited due to its low radiochemical yield. 6. the development and evaluation of 3 novel possible 5-HT2A imaging agents combining structural elements of altanserin, MDL 100907 and SR 46349B demonstrating different binding modes of these compounds. 7. the development, the labeling and in vitro evaluation of the novel 5-HT1A antagonistic tracer [18F]AH1.MZ (Ki = 4.2 nM).

Copper and zinc stable isotope ratios as tracers of biogeochemical processes, sources and transport of Cu and Zn in soils

Copper and Zn are essential micronutrients for plants, animals, and humans; however, they may also be pollutants if they occur at high concentrations in soil. Therefore, knowledge of Cu and Zn cycling in soils is required both for guaranteeing proper nutrition and to control possible risks arising from pollution.rnThe overall objective of my study was to test if Cu and Zn stable isotope ratios can be used to investigate into the biogeochemistry, source and transport of these metals in soils. The use of stable isotope ratios might be especially suitable to trace long-term processes occurring during soil genesis and transport of pollutants through the soil. In detail, I aimed to answer the questions, whether (1) Cu stable isotopes are fractionated during complexation with humic acid, (2) 65Cu values can be a tracer for soil genetic processes in redoximorphic soils (3) 65Cu values can help to understand soil genetic processes under oxic weathering conditions, and (4) 65Cu and 66Zn values can act as tracers of sources and transport of Cu and Zn in polluted soils.rnTo answer these questions, I ran adsorption experiments at different pH values in the laboratory and modelled Cu adsorption to humic acid. Furthermore, eight soils were sampled representing different redox and weathering regimes of which two were influenced by stagnic water, two by groundwater, two by oxic weathering (Cambisols), and two by podzolation. In all horizons of these soils, I determined selected basic soil properties, partitioned Cu into seven operationally defined fractions and determined Cu concentrations and Cu isotope ratios (65Cu values). Finally, three additional soils were sampled along a deposition gradient at different distances to a Cu smelter in Slovakia and analyzed together with bedrock and waste material from the smelter for selected basic soil properties, Cu and Zn concentrations and 65Cu and 66Zn values.rnMy results demonstrated that (1) Copper was fractionated during adsorption on humic acid resulting in an isotope fractionation between the immobilized humic acid and the solution (65CuIHA-solution) of 0.26 ± 0.11‰ (2SD) and that the extent of fractionation was independent of pH and involved functional groups of the humic acid. (2) Soil genesis and plant cycling causes measurable Cu isotope fractionation in hydromorphic soils. The results suggested that an increasing number of redox cycles depleted 63Cu with increasing depth resulting in heavier 65Cu values. (3) Organic horizons usually had isotopically lighter Cu than mineral soils presumably because of the preferred uptake and recycling of 63Cu by plants. (4) In a strongly developed Podzol, eluviation zones had lighter and illuviation zones heavier 65Cu values because of the higher stability of organo-65Cu complexes compared to organo-63Cu complexes. In the Cambisols and a little developed Podzol, oxic weathering caused increasingly lighter 65Cu values with increasing depth, resulting in the opposite depth trend as in redoximorphic soils, because of the preferential vertical transport of 63Cu. (5) The 66Zn values were fractionated during the smelting process and isotopically light Zn was emitted allowing source identification of Zn pollution while 65Cu values were unaffected by the smelting and Cu emissions isotopically indistinguishable from soil. The 65Cu values in polluted soils became lighter down to a depth of 0.4 m indicating isotope fractionation during transport and a transport depth of 0.4 m in 60 years. 66Zn values had an opposite depth trend becoming heavier with depth because of fractionation by plant cycling, speciation changes, and mixing of native and smelter-derived Zn. rnCopper showed measurable isotope fractionation of approximately 1‰ in unpolluted soils, allowing to draw conclusions on plant cycling, transport, and redox processes occurring during soil genesis and 65Cu and 66Zn values in contaminated soils allow for conclusions on sources (in my study only possible for Zn), biogeochemical behavior, and depth of dislocation of Cu and Zn pollution in soil. I conclude that stable Cu and Zn isotope ratios are a suitable novel tool to trace long-term processes in soils which are difficult to assess otherwise.rn

Synthese 18 F-markierter Liganden zur Visualisierung der GABA-Bindungsstelle des GABA A-Rezeptors mittels PET

γ-Aminobuttersäure (GABA) ist der wichtigste inhibitorische Neurotransmitter im zentralen Nervensystem und bindet vorrangig an ionotrope GABAA-Rezeptoren. Diese sind an fast allen neuronalen Prozessen beteiligt und werden darüber hinaus mit neurologischen Erkrankungen wie Epilepsie, Angstzuständen, Schlafstörungen und Schizophrenie in Verbindung gebracht. Die PET bietet als molekulares bildgebendes Verfahren die Möglichkeit einzelne Stoffwechselvorgänge des GABAergen Systems zu visualisieren und zu quantifizieren. Durch den Einsatz eines 18F-markierten Radioliganden an die GABA-Bindungsstelle könnten so die Rezeptorverfügbarkeit des GABAA-Rezeptors gemessen und die Ausschüttung des Neurotransmitters GABA quantifiziert werden.rn4-(2-Naphthylmethyl)-5-(piperidin-4-yl)isothiazolole und -isoxazolole stellen aufgrund ihrer hohen Affinität gegenüber der GABA-Bindungsstelle und ihrer lipophilen Struktur vielversprechende Leitstrukturen für die Entwicklung eines PET-Tracers zur Visualisierung der GABA-Bindungsstelle dar. Daher wurden zunächst 19F-substituierte Referenzverbindungen synthetisiert, um diese hinsichtlich ihrer Eignung als Radioligand in in vitro-Studien zu evaluieren. Dazu wurde Fluor direkt sowie über eine Fluorethoxygruppe an Position 1 des Naphthalinrings eingeführt. Zusätzlich wurde ein Fluorethylether eines Isothiazolols als Referenz-verbindung synthetisiert. In anschließenden Verdrängungsstudien wurden die Affinitäten der synthetisierten Verbindungen mit [3H]Muscimol an Membranpräparaten aus Rattenhirnen, sowie transfizierten HEK293-Zellen bestimmt. Zusätzlich wurden die entsprechenden Log D-Werte bestimmt. Die Verbindung 5-(piperidin-4-yl)-4-(1-fluornaphth-2-ylmethyl)-isothiazol-3-ol VK5 zeigte in den in vitro-Studien die vielversprechendsten Ergebnisse (IC50 = 10 nM; Log D = 1,7) und wurde im Folgenden in einer dreistufigen Radiosynthese als 18F-Verbindung synthetisiert.rnZu diesem Zweck wurde ein geeigneter Markierungsvorläufer dargestellt und über eine n.c.a. SNAr-Markierung mit [18F]F- umgesetzt. Die Reaktionsparameter wurden hinsichtlich Reaktionszeit, -temperatur, Basenkonzentration und Lösungsmittel optimiert. Die zur Aktivierung einer SNAr ein-geführte Carbonylfunktion wurde in einem zweiten Schritt mit Triethylsilan/Trifluoressigsäure reduziert. Im finalen Schritt wurden zwei Schutzgruppen mit Bortrichlorid in DCM abgespaltet und [18F]VK5 als injektionsfertige Lösung in isotoner NaCl-Lösung erhalten. Es wurden radiochemische Ausbeuten von 0,7-1 % (EOS) nach einer durchschnittlichen Synthesedauer von 275 Minuten erhalten.rnDer Radioligand [18F]VK5 wurde anschließend in Autoradiographie-Versuchen an Hirnschnitten der Ratte hinsichtlich seiner Spezifität für die GABA-Bindungsstelle untersucht. Die unspezifische Bindung wurde durch die Zugabe von GABA bestimmt wonach kein signifikanter Unterschied festgestellt werden konnte. Die hohe unspezifische Bindung kann möglicherweise auf die niedrigen spezifischen Aktivitäten zurückgeführt werden. Diese lagen, bedingt durch die drei Schritte der Radiosynthese, in einem Bereich von 0,1-0,6 GBq/μmol. Die erhaltenen Ergebnisse lassen für zukünftige Versuche noch einige Optimierungsmöglichkeiten offen. Aufgrund der bisher erhaltenen Daten lässt sich daher keine definitive Aussage über die Eignung des Liganden [18F]VK5 als PET-Tracer treffen.rn

DNA-Array-Technologie

Es wurde ein genomischer DNA-Array der Modellpflanze Arabidopsis thaliana mit einer 13.800 EST-Klone umfassenden cDNA-Bibliothek entwickelt und in der Genexpressionsanalyse der pflanzlichen Pathogenabwehr eingesetzt. Mittels PCR-Amplifikation sind 13.000 PCR-Produkte der cDNA-Fragmente hergestellt worden, mit denen 66 genomische Arabidopsis-Arrays auf Nylon und Polypropylen als Trägermaterial hergestellt werden konnten. Die Validierung mit Fluoreszenz- und Radiaktivhybridisierung sowie der Vergleich von drei Normalisierungsmethoden führte zu reproduzierbaren Ergebnissen bei hohem Korrelationskoeffizienten. Die etablierte DNA-Array-Technologie wurde zur Genexpressionsanalyse der pathogeninduzierten Abwehrmechanismen der Pflanze Arabidopsis thaliana in den ersten 24 Stunden nach Infektion mit dem avirulenten Bakterium Pseudomonas syringae pv. tomato eingesetzt. In einer Auswahl von 75 Genen der Stoffwechselwege Glycolyse, Citrat-Cyclus, Pentosephosphat-Cyclus und Glyoxylatmetabolismus konnte für 25 % der Gene, im Shikimat-, Tryptophan- und Phenylpropanoidsyntheseweg für 60 % der Gene eine erhöhte Transkriptionsrate nachgewiesen werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit stimmen mit experimentellen Daten verschiedener unabhängiger Studien zur pflanzlichen Pathogenantwort überein. Darüberhinaus sind erstmals Transkriptionsprofile von bisher auf Transkriptionsebene nicht untersuchten Genen erstellt worden. Diese Ergebnisse bestätigen die transkriptionelle Aktivierung ganzer Stoffwechselwege und gewähren erstmals einen Einblick in die koordinierte differentielle Transkription ganzer Stoffwechselwege während der Pathogenabwehr.

Bestimmung der Ionisationsenergie von Actinium und Ultraspurenanalyse von Plutonium mit resonanter Ionisationsmassenspektrometrie (RIMS)

ZusammenfassungDie Resonanzionisationsmassenspektrometrie (RIMS) verbindet hohe Elementselektivität mit guter Nachweiseffizienz. Aufgrund dieser Eigenschaften ist die Methode für Ultraspurenanalyse und Untersuchungen an seltenen oder schwer handhabbaren Elementen gut geeignet. Für RIMS werden neutrale Atome mit monochromatischem Laserlicht ein- oder mehrfach resonant auf energetisch hoch liegende Niveaus angeregt und anschließend durch einen weiteren Laserstrahl oder durch ein elektrisches Feld ionisiert. Die Photoionen werden in einem Massenspektrometer massenselektiv registriert.Ein Beispiel für die Anwendung von RIMS ist die präzise Bestimmung der Ionisationsenergie als fundamentale physikalisch-chemische Eigenschaft eines bestimmten Elements; insbesondere bei den Actinoiden ist die Kenntnis der Ionisationsenergie von Interesse, da es dort bis zur Anwendung der laser-massenspektroskopischer Methode nur wenige experimentelle Daten gab. Die Bestimmung der Ionisationsenergie erfolgt durch die Methode der Photoionisation im elektrischen Feld gemäß dem klassischen Sattelpunktsmodell. Im Experiment werden neutrale Atome in einem Atomstrahl mittels Laserlicht zunächst resonant angeregt. Die angeregten Atome befinden sich in einem äußeren, statischen elektrischen Feld und werden durch einen weiteren Laserstrahl, dessen Wellenlänge durchgestimmt wird, ionisiert. Das Überschreiten der Laserschwelle macht sich durch einen starken Anstieg im Ionensignal bemerkbar. Man führt diese Messung bei verschiedenen elektrischen Feldstärken durch und erhält bei Auftragen der Ionisationsschwellen gegen die Wurzel der elektrischen Feldstärke durch Extrapolation auf die Feldstärke Null die Ionisationsenergie.Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Ionisationsenergie von Actinium erstmalig zu 43398(3) cm-1 º 5,3807(4) eV experimentell bestimmt. Dazu wurden Actiniumatome zunächst einstufig resonant mit einem Laser mit einer Wellenlänge von 388,67 nm auf einen Zustand bei 25729,03 cm-1 angeregt und anschließend mit Laserlicht mit einer Wellenlänge von ca. 568 nm ionisiert. Damit sind die Ionisationsenergien aller Actinoiden bis einschließlich Einsteinium mit Ausnahme von Protactinium bekannt. Als Atomstrahlquelle wird ein spezielles 'Sandwichfilament' benutzt, bei dem das Actinoid als Hydroxid auf eine Tantalfolie aufgebracht und mit einer reduzierenden Deckschicht überzogen wird. Das Actinoid dampft bei Heizen dieser Anordnung atomar ab. Bei den schwereren Actinoiden wurde Titan als Deckschicht verwendet. Um einen Actiniumatomstrahl zu erzeugen, wurde aufgrund der hohen Abdampftemperaturen statt Titan erstmals Zirkonium eingesetzt. Bei Protactinium wurde Thorium, welches noch stärkere Reduktionseigenschaften aufweist, als Deckmaterial eingesetzt. Trotzdem gelang es mit der 'Sandwichtechnik' nicht, einen Protactiniumatomstrahl zu erzeugen. In der Flugzeitapparatur wurde lediglich ein Protactinium-monoxidionensignal detektiert. Um ein erst seit kurzem verfügbares Fest-körperlasersystem zu explorieren, wurden zusätzlich noch die bekannten Ionisations-ener-gien von Gadolinium und Plutonium erneut bestimmt. Die gemessenen Werte stimmen mit Literaturdaten gut überein.Ferner wurde noch ein bestehender Trennungsgang für Plutonium aus Umweltproben auf die Matrices Meerwasser und Hausstaub angepasst und für die Bestimmung von Plutonium und dessen Isotopenzusammensetzung in verschiedenen Probenreihen mittels RIMS eingesetzt. Der modifizierte Trennungsgang ermöglicht das schnelle Aufarbeiten von großen Probenmengen für Reihenuntersuchungen von Plutoniumkontaminationen. Die ermittelten Gehalten an 239Pu lagen zwischen 8,2*107 Atome pro 10 l Meerwasserprobe und 1,7*109Atome pro Gramm Staubprobe.

REXTRAP - ion accumulation, cooling and bunching for REX-ISOLDE

REX-ISOLDE ist ein Pilotexperiment zur Nachbeschleunigung radioaktiver Ionenstrahlen am on-line Massenseparator ISOLDE am CERN. Ein wichtiges Teilprojekt war die Realisierung der effizienten Umwandlung des kontinuierlichen niederenergetischen Ionenstrahles in kurze Ionenpulse hoher Qualität. Zu diesem Zweck wurde im Rahmen dieser Arbeit REXTRAP, eine gasgefüllte Penningfalle entwickelt, in Betrieb genommen und systematisch untersucht.

Spektroskopie und Ultraspurenanalyse von Plutonium mittels Resonanzionisations-Massenspektrometrie

Die Resonanzionisations-Massenspektrometrie (RIMS) ist sowohl für spektroskopische Untersuchungen seltener Isotope als auch für den Ultraspurennachweis langlebiger radioaktiver Elemente einsetzbar. Durch die mehrstufige resonante Anregung atomarer Energieniveaus mit anschließender Ionisation mit Laserlicht wird eine sehr hohe Elementselektivität und Ionisationseffizienz erreicht. Der nachfolgende massenselektive Ionennachweis liefert eine gute Isotopenselektivität zusammen mit einer effektiven Untergrundunterdrückung. Ein wichtiger Bestandteil der RIMS-Apparatur ist ein zuverlässig arbeitendes, leistungsstarkes Lasersystem für die Resonanzionisation. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein von einem hochrepetierenden Nd:YAG-Laser gepumptes, aus drei Titan-Saphir-Lasern bestehendes System fertig aufgebaut und in den Routinebetrieb überführt. Die Titan-Saphir-Laser liefern im Durchstimmbereich von 730 - 880 nm eine mittlere Leistung von bis zu 3 W pro Laser bei einer Linienbreite von 2 - 3 GHz. Sie lassen sich computergesteuert in ihren Wellenlängen durchstimmen. Die mittels Resonanzionisation erzeugten Ionen werden dann in einem Flugzeit-Massenspektrometer entsprechend ihrer Masse aufgetrennt und mit einem Kanalplattendetektor nachgewiesen.Als Voraussetzung für die isotopenselektive Ultraspurenanalyse von Plutonium wurden mit diesem Lasersystem die Isotopieverschiebungen eines effizienten, dreistufigen Anregungsschema für Plutonium bestimmt. Die Laserleistungen reichen zur vielfachen Sättigung der ersten beiden Anregungsschritte und zur zweifachen Sättigung des dritten Anregungsschritts aus.Außerdem wurden die Ionisationsenergien von Pu-239 und Pu-244 zur Untersuchung ihrer Isotopenabhängigkeit bestimmt. Die beiden Ionisationsenergien sind im Rahmen der erreichten Genauigkeit bei einem Meßwert von IP239-IP244 = 0,24(82) cm^-1 gleich.Die Nachweiseffizienz der RIMS-Apparatur für Plutonium wurde in Effizienzmessungen zu 10^-5 bestimmt. Durch die gute Untergrundunterdrückung ergab sich daraus eine Nachweisgrenze von 10^6 Atomen bei der Messung eines Plutoniumisotops. Die Bestimmung der Isotopenverhältnisse von Proben mit einer zertifizierten Isotopenzusammensetzung lieferte eine gute Übereinstimmung der Meßwerte mit den angegebenen Zusammensetzungen.Die RIMS-Apparatur wurde zur Bestimmung des Gehalts und der Isotopenzusammensetzung von Plutonium in Meerwasser- und Staubproben eingesetzt.Auf Grund der Isotopenzusammensetzung konnte gezeigt werden, daß das Plutonium bei den meisten Proben aus dem Fallout von oberirdischen Kernwaffentests stammte. Des weiteren wurde Plutonium in Urinproben bestimmt. Die Nachweisgrenzen lagen bei diesen Umweltproben bei 10^6 bis 10^7 Atomen Plutonium und damit um zwei Größenordnungen niedriger als die Nachweisgrenze für Pu-239 bei der alpha-Spektroskopie, der Standardmethode für den Plutoniumnachweis.

Der PAC1-Rezeptor

Zusammenfassung Im Rahmen dieser Arbeit wurde der PAC1-Rezeptor (Pituitary Adenylate Cyclase Activating-Polypeptide-Rezeptor), ein Mitglied der VIP-Glucagon-Rezeptorfamilie, aus Sf21-Insektenzellen angereichert. Zur Überexpression wurde das Baculovirussystem genutzt. Die Expression konnte um das 20fache gegenüber natürlichem Gewebe gesteigert werden (40 pmol/mg). Das Drosophila-Expressionssystem und die Expression in suspensionsadaptierten HEK-Zellen erwiesen sich dagegen als weniger effizient für die Überexpression des PAC1-Rezeptors. Der PAC1-Rezeptor wurde mit Digitonin aus den Sf21-Zellmembranen solubilisiert und mittels eines Rhodopsin-Epitops über Antikörperaffinitätschromatographie funktionell angereichert. Der funktionell angereicherte Rezeptor wurde mit einem photoreaktiven und radioaktiven PACAP-Liganden markiert. Anschließend erfolgte der proteolytische Verdau mit Kallikrein. Aufgrund der Zuordnung der radioaktiven Spaltfragmente konnte die Ligandenbindungsstelle im PAC1-Rezeptor auf den N-Terminus und den ersten extrazellulären Loop beschränkt werden. Dieses Ergebnis bestätigt Resultate, die für andere Mitglieder dieser Rezeptorfamilie vorliegen.Alternativ wurde der PAC1-Rezeptor unfunktionell in E.colis überexprimiert und in hohen Maße über ein C-terminales His6-Tag aus Inclusion bodies angereichert. Zudem wurde in dieser Arbeit erstmals ein Einfluss des PAC1-Rezeptors auf die APP-Prozessierung festgestellt. Dies äußerte sich in einem Anstieg der APPsa-Sekretion. Obwohl weitere Untersuchungen über genauere Mechanismen und Wechselwirkungen noch ausstehen, konnte hier gezeigt werden, dass der PAC1-Rezeptor einen positiv regulatorischen Einfluss auf die APPsa-Sekretion besaß. Der PAC1-Rezeptor ist wahrscheinlich ein Stimulator der a-Sekretasen und erstmals in direkten Zusammenhang mit der Alzheimerschen Erkrankung diskutierbar.

Untersuchung der Filmbildung aus Polymerdispersionen mit Hilfe der forcierten Rayleighstreuung

Der Filmbildungsprozess wässriger Polymerdispersionen wurde mit forcierter Rayleighstreuung untersucht.Diffusionskoeffizienten D von Farbstoffsonden sind damit zwischen 10^-21 und 10^-9 m^2s^-1 zugänglich. Das Diffusionsverhalten der hydrophoben FarbstoffsondeAberchrome in feuchten und trockenen Filmen aus Poly(n-butylmethacrylat-co-acrylsäure)-Dispersionen sowie bei der Wiederbefeuchtung trockener Filme wurde untersucht.Die Dynamik von Aberchrome weicht in feuchten Filmen von Fickscher Diffusion ab. Dies äußert sich in Abweichungen vomcharakteristischen q^2-Verhalten der Relaxationsrate tau^-1 (tau^-1 = Dq^2; q:Streuvektor) und im Auftreten gestrecktexponentieller Intensitätsrelaxationskurven. Diese Anomalie wurde mit einem apparenten, längenskalenabhängigen Diffusionskoeffizienten Dapp(Lambda) (Lambda= 2Pi/q) beschrieben, der für Lambda -> 0 Werte annimmt, die einem homogen hydroplastifizierten Polymermaterial entsprechen, während Dapp(Lambda) für Lambda -> Unendlich stark anwächst. Diese Anomalien verschwinden bei Wassergehalten entsprechend der Polymerwasserlöslichkeit. Weiteres Trocknen führt zum Absinken des Fickschen-Diffusionskoeffizienten auf einen Grenzwert für trockene Filme. Die Ergebnisse konnten mit einem Zwei-Zustands-Modell beschrieben werden: Die Sonde diffundiert Ficksch in einer hydrophilen Grenzflächenphase und einer langsamen Polymerphase. Austausch zwischendiesen Phasen ist ohne Einschränkung möglich. Das Modell erlaubt die Quantifizierung des Einflusses des Trocknungsprozesses auf Polymer- und Grenzflächenphaseneigenschaften.Dies wurde durch systematische Veränderungen der Grenzflächeneigenschaften demonstriert. Dies geschah durch Acrylsäuregehaltvariationen in den Poly(n-butylmethacrylat-co-acrylsäure)-Dispersionen und Emulgatorbedeckungsgradvariationen. In beiden Fällen reflektieren sich Dispersionsveränderungen in einer Veränderung der Modellparameter in der Grenzflächenphase.

Entwicklung einer Enzymimmunoelektrode zur Bestimmung von Atrazin in Wasser

ZusammenfassungIn der vorliegenden Arbeit ist eine Enzymimmunoelektrode zur Bestimmung von Atrazin in Wasser entwickelt worden. Die Motivation war, einen Immunoassay zu entwickeln, der ohne die speziellen Geräte, wie einen EIA-Reader, durchgeführt werden konnte. Dafür müssen drei Änderungen vorgenommen werden. Es muß das Detektorsystem EIA-Reader zur Meßwerterfassung ersetzt werden, und damit muß die nur im EIA-Reader verwendbare Mikrotiterplatte ausgetauscht werden. Als drittes muß der Immunoassay dem neuen Detektorsystem angepaßt werden. Eine pH-Elektrode wurde anstelle des EIA-Readers benutzt. Als Enzym, das eine pH-Änderung induziert, wurde Lactamase ausgewählt. Als Festphase wurden anstelle der Mikrotiterplatte Polystyrolmikropartikel (PSMP) verwendet. Die Entwicklung der Enzymimmunoelektrode erfolgte in drei Schritten: Entwicklung des Immunoassays für Atrazin unter Verwendung von Lactamase, Übertragung auf die Festphase PSMP und Einsatz der pH-Elektrode als Detektorsystem. Zuerst wurden Tracer mit dem Enzym Lactamase hergestellt. Als Haptene wurden 2-Chlor-4-(isopropylamino)-6-[(1-carboxypent-5-yl)amino]-s-Triazin (iPr/Cl/C6), Di-Chloratrazin und Di-Chlorsimazin verwendet. Es wurden unterschiedliche Testmittelpunkte im Immunoassay erreicht, (iPr/Cl/C6 I50 = 1.22µg/L; Dichloratrazin I50 = 0.27µg/L; Di-Chlorsimazin I50 = 0.12µg/L). Aufgrund der nur mäßigen Stabilität der Tracer unter Verwendung der Di-Chlorderivate wurde auf deren Verwendung bei der Entwicklung der Immunoelektrode verzichtet.Im zweiten Schritt erfolgte die Übertragung auf PSMP. Die Verwendung der PSMP hatte außer einer Verbesserung des Testmittelpunktes auf 1.00µg/L noch den Vorteil, daß die benötigten Mengen an Antikörper verringert werden konnten.Danach wurde die pH-Elektrode als Signalwandler zur Bestimmung des Atrazins eingesetzt. Unter Verwendung der pH-Elektrode konnte der bisher niedrigste Testmittelpunkt (I50 = 0.005µg/L) zur Bestimmung von Atrazin erreicht werden.

Analyse von Biotransformationen und Naturstoffsynthesen in pflanzlichen Zellkulturen unter Anwendung der in vivo NMR-Spektroskopie ohne Markierung

Die Aufklärung von Biosynthesewegen erfolgt häufig mit Hilfe von Fütterungsexperimenten mit radioaktiven oder stabilen Isotopen markierten Präkusoren oder auf der Basis der Enzymreinigung mit anschließender molekularbiologischer Charakterisierung. Die erstgenannte Methode verlangt die Isolierung der Produkte. Jedoch besteht bei Aufarbeitung und Extraktion immer die Gefahr, daß sich der Metabolit teilweise oder vollständig chemisch verändert. Ein weiterer Nachteil der genannten Methoden ist, daß diese generell mühsam und zeitaufwendig sind. Mit Hilfe der in vivo NMR-Spektroskopie können diese Nachteile umgangen werden. In der vorliegenden Arbeit wurden Biotransformationen und Biosynthesesequenzen des Ajmalin-Biosyntheseweges mit Hilfe der in vivo NMR-Spektroskopie in Pflanzenzellkulturen von Rauvolfia serpentina und Rauvolfia serpentina x Rhazya stricta anhand der natürlichen 13C-Häufigkeit untersucht. Dafür wurden ein 700 MHz, 800 MHz und ein 500 MHz CryoProbe Spektrometer eingesetzt, um die Biotransformationen von Isatin-3-oxim und Isatin sowie die Metabolisierungen der Alkaloide Vellosimin, Vinorin, Vomilenin, Ajmalin, Nß-Methyl-dihydrochano-ajmalin und Perakin mit der 1H-13C invers korrelierten NMR-Spektroskopie zu verfolgen.