Synthese 18 F-markierter Liganden zur Visualisierung der GABA-Bindungsstelle des GABA A-Rezeptors mittels PET

γ-Aminobuttersäure (GABA) ist der wichtigste inhibitorische Neurotransmitter im zentralen Nervensystem und bindet vorrangig an ionotrope GABAA-Rezeptoren. Diese sind an fast allen neuronalen Prozessen beteiligt und werden darüber hinaus mit neurologischen Erkrankungen wie Epilepsie, Angstzuständen, Schlafstörungen und Schizophrenie in Verbindung gebracht. Die PET bietet als molekulares bildgebendes Verfahren die Möglichkeit einzelne Stoffwechselvorgänge des GABAergen Systems zu visualisieren und zu quantifizieren. Durch den Einsatz eines 18F-markierten Radioliganden an die GABA-Bindungsstelle könnten so die Rezeptorverfügbarkeit des GABAA-Rezeptors gemessen und die Ausschüttung des Neurotransmitters GABA quantifiziert werden.rn4-(2-Naphthylmethyl)-5-(piperidin-4-yl)isothiazolole und -isoxazolole stellen aufgrund ihrer hohen Affinität gegenüber der GABA-Bindungsstelle und ihrer lipophilen Struktur vielversprechende Leitstrukturen für die Entwicklung eines PET-Tracers zur Visualisierung der GABA-Bindungsstelle dar. Daher wurden zunächst 19F-substituierte Referenzverbindungen synthetisiert, um diese hinsichtlich ihrer Eignung als Radioligand in in vitro-Studien zu evaluieren. Dazu wurde Fluor direkt sowie über eine Fluorethoxygruppe an Position 1 des Naphthalinrings eingeführt. Zusätzlich wurde ein Fluorethylether eines Isothiazolols als Referenz-verbindung synthetisiert. In anschließenden Verdrängungsstudien wurden die Affinitäten der synthetisierten Verbindungen mit [3H]Muscimol an Membranpräparaten aus Rattenhirnen, sowie transfizierten HEK293-Zellen bestimmt. Zusätzlich wurden die entsprechenden Log D-Werte bestimmt. Die Verbindung 5-(piperidin-4-yl)-4-(1-fluornaphth-2-ylmethyl)-isothiazol-3-ol VK5 zeigte in den in vitro-Studien die vielversprechendsten Ergebnisse (IC50 = 10 nM; Log D = 1,7) und wurde im Folgenden in einer dreistufigen Radiosynthese als 18F-Verbindung synthetisiert.rnZu diesem Zweck wurde ein geeigneter Markierungsvorläufer dargestellt und über eine n.c.a. SNAr-Markierung mit [18F]F- umgesetzt. Die Reaktionsparameter wurden hinsichtlich Reaktionszeit, -temperatur, Basenkonzentration und Lösungsmittel optimiert. Die zur Aktivierung einer SNAr ein-geführte Carbonylfunktion wurde in einem zweiten Schritt mit Triethylsilan/Trifluoressigsäure reduziert. Im finalen Schritt wurden zwei Schutzgruppen mit Bortrichlorid in DCM abgespaltet und [18F]VK5 als injektionsfertige Lösung in isotoner NaCl-Lösung erhalten. Es wurden radiochemische Ausbeuten von 0,7-1 % (EOS) nach einer durchschnittlichen Synthesedauer von 275 Minuten erhalten.rnDer Radioligand [18F]VK5 wurde anschließend in Autoradiographie-Versuchen an Hirnschnitten der Ratte hinsichtlich seiner Spezifität für die GABA-Bindungsstelle untersucht. Die unspezifische Bindung wurde durch die Zugabe von GABA bestimmt wonach kein signifikanter Unterschied festgestellt werden konnte. Die hohe unspezifische Bindung kann möglicherweise auf die niedrigen spezifischen Aktivitäten zurückgeführt werden. Diese lagen, bedingt durch die drei Schritte der Radiosynthese, in einem Bereich von 0,1-0,6 GBq/μmol. Die erhaltenen Ergebnisse lassen für zukünftige Versuche noch einige Optimierungsmöglichkeiten offen. Aufgrund der bisher erhaltenen Daten lässt sich daher keine definitive Aussage über die Eignung des Liganden [18F]VK5 als PET-Tracer treffen.rn

γ-Aminobutyric acid (GABA) is the primary inhibitory neurotransmitter in the mammalian central nervous system and plays an important role in neuronal functions like cognition, learning and memory. Moreover, dysfunctions of the GABAergic system are involved in anxiety, schizophrenia, sleep disorders and epilepsy. Therefore PET ligands are valuable tools to study the pathophysiology of neuronal disorders, effects of pharmacotherapies and normal brain functions. Most radiotracers for PET and SPECT target the benzodiazepine binding site but till today there is no radioligand available for the imaging of the GABA recognition site of GABAA receptors. Those would provide the possibility to measure receptor availabilities as well as the release of GABA from presynaptic neurons.rn4-(2-Naphthylmethyl)-5-(piperidin-4-yl)isothiazololes and -isoxazololes seem to be promising lead structures for the development of PET-tracers for the GABA binding site, due to their high affinities and their lipophilic structures. Therefore new 19F-substituted reference compounds were synthesized to verify their suitability as PET-Tracers in in vitro assays. The fluorine label was introduced at position one of the naphthalene ring either directly or by a fluoroethoxy group. Additionally an isothiazolole was alkylated using fluoroethyltosylate. The affinities towards the GABAA receptor were determined using a radioligand competition binding assay using rat brain membrane preparations and [3H]muscimol. Some of the reference compounds showed high affinity towards the GABA binding site in low nanomolar range. Furthermore log D values were determined by HPLC. The most promising candidate of this series 5-(piperidin-4-yl)-4-(1-fluoronaphth-2-ylmethyl)-isothiazol-3-ol VK5 showed excellent binding properties (IC50 = 10 nM) and was selected for subsequent radiolabeling.rnTherefore a convenient labeling precursor was synthesized and labeled with 18F by direct n.c.a. nucleophilic aromatic substitution. The reaction conditions were optimized due to temperature, duration, solvent and amount of base. The carbonyl group, necessary for the activation of the naphthalene, ring was reduced with triethylsilane/trifluorofolic acid afterwards. During the final step, two protective groups were removed by borontrichloride whereby [18F]VK5 was obtained as injectable solution. Radiochemical yields of 0,7-1 % (EOS) were obtained after a synthesis time of about 275 minutes.rnAutoradiographic studies of [18F]VK5 on brain slices of rats were conducted to determine the specific binding to the GABA binding site. Unspecific binding was determined by addition of GABA but in any case no specific binding was observed. A possible explanation could be the low specific activity, resulting from the three radioactive steps. The obtained results indicate some possibilities for further improvements. Based upon the given results, there could be no definitive conclusion whether [18F]VK5 would be a suitable PET-Tracer or not.rn