Der PAC1-Rezeptor

Zusammenfassung Im Rahmen dieser Arbeit wurde der PAC1-Rezeptor (Pituitary Adenylate Cyclase Activating-Polypeptide-Rezeptor), ein Mitglied der VIP-Glucagon-Rezeptorfamilie, aus Sf21-Insektenzellen angereichert. Zur Überexpression wurde das Baculovirussystem genutzt. Die Expression konnte um das 20fache gegenüber natürlichem Gewebe gesteigert werden (40 pmol/mg). Das Drosophila-Expressionssystem und die Expression in suspensionsadaptierten HEK-Zellen erwiesen sich dagegen als weniger effizient für die Überexpression des PAC1-Rezeptors. Der PAC1-Rezeptor wurde mit Digitonin aus den Sf21-Zellmembranen solubilisiert und mittels eines Rhodopsin-Epitops über Antikörperaffinitätschromatographie funktionell angereichert. Der funktionell angereicherte Rezeptor wurde mit einem photoreaktiven und radioaktiven PACAP-Liganden markiert. Anschließend erfolgte der proteolytische Verdau mit Kallikrein. Aufgrund der Zuordnung der radioaktiven Spaltfragmente konnte die Ligandenbindungsstelle im PAC1-Rezeptor auf den N-Terminus und den ersten extrazellulären Loop beschränkt werden. Dieses Ergebnis bestätigt Resultate, die für andere Mitglieder dieser Rezeptorfamilie vorliegen.Alternativ wurde der PAC1-Rezeptor unfunktionell in E.colis überexprimiert und in hohen Maße über ein C-terminales His6-Tag aus Inclusion bodies angereichert. Zudem wurde in dieser Arbeit erstmals ein Einfluss des PAC1-Rezeptors auf die APP-Prozessierung festgestellt. Dies äußerte sich in einem Anstieg der APPsa-Sekretion. Obwohl weitere Untersuchungen über genauere Mechanismen und Wechselwirkungen noch ausstehen, konnte hier gezeigt werden, dass der PAC1-Rezeptor einen positiv regulatorischen Einfluss auf die APPsa-Sekretion besaß. Der PAC1-Rezeptor ist wahrscheinlich ein Stimulator der a-Sekretasen und erstmals in direkten Zusammenhang mit der Alzheimerschen Erkrankung diskutierbar.

The main objective of this work was the purification of the PAC1 receptor (pituitary adenylate cyclase activating-polypeptide), a member of the VIP-glucagon receptor family. The receptor has been overexpressed in Sf21 insect cells, in S2 insect cells and in HEK mammalian cells. We got the best results with the baculovirus expression system in the Sf21 insect cells, the optained expression rate being 20 times higher than in natural material. The next step was the solubilisation of the receptor from the Sf21 insect cell membranes using digitonin followed by an affinity purification step over a C-terminal Rho-tag. The functionally partional purified receptor was labelled with a photoreactive and radioactive ligand, and then proteolytically digested with kallicrein. The radioactive receptor fragments were analysed and allocated to receptor domains. The N-terminal domain and the first extracellular loop of the PAC1 receptor were found to be involved in ligand binding. This result confirmed earlier findings for the VIP-glucagon receptor family. Additionally the PAC1 receptor was overexpressed and purified from E.coli in a unfunctional manner. This purification was done from inclusion bodies using a C-terminal His6-tag.In this work it was shown for the first time, that the PAC1 receptor influenced the APP processing. It was discovered, that the activation of the receptor with its natural PACAP ligands increases the secretion of the APPsalpha fragment. This probably occurs through stimulation of an alpha-secretase. This allows us to postulate a direct connection between the PAC1 receptor and the Alzheimer disease.