Mass spectrometric identification of Varicella-Zoster Virus (VZV) proteins recognized by human T cells

Primary varicella-zoster virus (VZV) infection during childhood leads to varicella commonly known as chickenpox. After primary infection has occurred VZV establishes latency in the host. During subsequent lifetime the virus can cause reactivated infection clinically known as herpes zoster or shingles. In immunodeficient patients’ dissemination of the virus can lead to life-threatening disease. Withdrawal of acyclovir drug prophylaxis puts allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation (HSCT) patients at increased risk for herpes zoster as long as VZV-specific cellular immunity is impaired. Although an efficient live attenuated VZV vaccine for zoster prophylaxis exists, it is not approved in immunocompromised patients due to safety reasons. Knowledge of immunogenic VZV proteins would allow designing a noninfectious nonhazardous subunit vaccine suitable for patients with immunodeficiencies. The objective of this study was to identify T cell defined virus proteins of a VZV-infected Vero cell extract that we have recently described as a reliable antigen format for interferon-gamma (IFN-γ) enzyme-linked immunosorbent spot (ELISpot) assays (Distler et al. 2008). We first separated the VZV-infected/-uninfected Vero cell extracts by size filtration and reverse-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC). The collected fractions were screened for VZV reactivity with peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of VZV-seropositive healthy individuals in the sensitive IFN-γ ELISpot assay. Using this strategy, we successfully identified bioactive fractions that contained immunogenic VZV material. VZV immune reactivity was mediated by CD4+ memory T lymphocytes (T cells) of VZV-seropositive healthy individuals as demonstrated in experiments with HLA blockade antibodies and T cell subpopulations already published by Distler et al. We next analyzed the bioactive fractions with electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) techniques and identified the sequences of three VZV-derived proteins: glycoprotein E (gE); glycoprotein B (gB), and immediate early protein 62 (IE62). Complementary DNA of these identified proteins was used to generate in vitro transcribed RNA for effective expression in PBMCs by electroporation. We thereby established a reliable and convenient IFN-γ ELISPOT approach to screen PBMCs of healthy donors and HSCT patients for T cell reactivity to single full-length VZV proteins. Application in 10 VZV seropositive healthy donors demonstrated much stronger recognition of glycoproteins gE and gB compared to IE62. In addition, monitoring experiments with ex vivo PBMCs of 3 allo-HSCT patients detected strongly increased CD4+ T cell responses to gE and gB for several weeks to months after zoster onset, while IE62 reactivity remained moderate. Overall our results show for the first time that VZV glycoproteins gE and gB are major targets of the post-transplant anti-zoster CD4+ T cell response. The screening approach introduced herein may help to select VZV proteins recognized by memory CD4+ T cells for inclusion in a subunit vaccine, which can be safely used for zoster prophylaxis in immunocompromised HSCT patients.

Nanoparticles for efficient uptake by human dendritic cells and T lymphocytes to be used in adoptive immunotherapy

Dendritic cells (DCs) are the most potent cell type for capture, processing, and presentation of antigens. They are able to activate naïve T cells as well as to initiate memory T-cell immune responses. T lymphocytes are key elements in eliciting cellular immunity against bacteria and viruses as well as in the generation of anti-tumor and anti-leukemia immune responses. Because of their central position in the immunological network, specific manipulations of these cell types provide promising possibilities for novel immunotherapies. Nanoparticles (NP) that have just recently been investigated for use as carriers of drugs or imaging agents, are well suited for therapeutic applications in vitro and also in vivo since they can be addressed to cells with a high target specificity upon surface functionalization. As a first prerequisite, an efficient in vitro labeling of cells with NP has to be established. In this work we developed protocols allowing an effective loading of human monocyte-derived DCs and primary antigen-specific T cells with newly designed NP without affecting biological cell functions. Polystyrene NP that have been synthesized by the miniemulsion technique contained perylenmonoimide (PMI) as a fluorochrome, allowing the rapid determination of intracellular uptake by flow cytometry. To confirm intracellular localization, NP-loaded cells were analyzed by confocal laser scanning microscopy (cLSM) and transmission electron microscopy (TEM). Functional analyses of NP-loaded cells were performed by IFN-γ ELISPOT, 51Chromium-release, and 3H-thymidine proliferation assays. In the first part of this study, we observed strong labeling of DCs with amino-functionalized NP. Even after 8 days 95% of DCs had retained nanoparticles with a median fluorescence intensity of 67% compared to day 1. NP loading did not influence expression of cell surface molecules that are specific for mature DCs (mDCs) nor did it influence the immunostimulatory capacity of mDCs. This procedure did also not impair the capability of DCs for uptake, processing and presentation of viral antigens that has not been shown before for NP in DCs. In the second part of this work, the protocol was adapted to the very different conditions with T lymphocytes. We used leukemia-, tumor-, and allo-human leukocyte antigen (HLA) reactive CD8+ or CD4+ T cells as model systems. Our data showed that amino-functionalized NP were taken up very efficiently also by T lymphocytes, which usually had a lower capacity for NP incorporation compared to other cell types. In contrast to DCs, T cells released 70-90% of incorporated NP during the first 24 h, which points to the need to escape from intracellular uptake pathways before export to the outside can occur. Preliminary data with biodegradable nanocapsules (NC) revealed that encapsulated cargo molecules could, in principle, escape from the endolysosomal compartment after loading into T lymphocytes. T cell function was not influenced by NP load at low to intermediate concentrations of 25 to 150 μg/mL. Overall, our data suggest that NP and NC are promising tools for the delivery of drugs, antigens, and other molecules into DCs and T lymphocytes.

Lentivirus-mediated knockdown of Galectin-10 and Foxp3 in human immune cells

Die Suppression von autoreaktiven T-Zellen ist eine Funktion von CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen (CD4+CD25+ Tregs). CD4+CD25+ Tregs unterdrücken autoaggressive Immunantworten. Galectin-10 und Foxp3 sind wichtige Proteine, die an dem supprimierenden Mechanismus der Tregs beteiligt sind. Galectin-10 ist eines der ältesten bekannten humanen Proteine, die nicht in anderen Spezies gefunden worden sind. Foxp3 ist ein Transkriptionsfaktor, der in menschlichen CD4+CD25+ Tregs und in CD4+CD25- T-Effektor-Zellen nach Aktivierung exprimiert wird. Ein siRNA-vermittelter Knockdown dieses intrazellulären löslichen Proteins hebt die supprimierende Funktion der humanen CD4+CD25+ Tregs auf.rnDiese Arbeit beinhaltet in vitro durchgeführte Untersuchungen zur Ermöglichung eines Knockdown von Galectin-10 und/oder Foxp3 in humanisierten Mäusen. Es war möglich, ein Verfahren für die Produktion von lentiviralen Partikeln zu etablierten, die sich als effizientes Vehikel für den Gentransfer in humane Stammzellen und verschiedene Tumor- und Immunzellen erwiesen. Nach der Transduktion von AML14.3D10 Tumorzellen mit GFP-codierenden lentiviralen Partikeln konnte eine langfristige Expression von GFP erreicht werden. Außerdem war es möglich lentivirale Partikel zu erzeugen, die mit shRNA gegen Galectin-10 codiert waren. Die erzeugten Partikel erwiesen sich als funktionell, indem sie eine deutliche Herunterregulation von Galectin-10 in konstitutiv Galectin-10 exprimierenden AML14.3D10 Tumorzellen bewirkten. Unsere Studie präsentierte außerdem eine erstmalige Untersuchung zum Nachweis von Galectin-10-Protein in Eosinophilen aus humanen CD34+ hämatopoetischen Stammzellen (HSC). Diese stabile in vitro Galectin-10-Expression bietet ein alternatives Untersuchungsmodell zu CD4+CD25+ Tregs, die nicht aus CD34+ HSC differenziert werden können. Der zusätzliche Einbau des GFP-Gens in die mit shRNA gegen Galectin-10 codierende lentivirale Partikel war ein wichtiger Schritt zur Markierung von Zellen, die einen Galectin-10-Knockdown aufwiesen. Die neuen bicistronischen lentiviralen Partikel erwiesen sich sowohl in aus CD34+ HSC differenzierten Eosinophilen als auch in AML14.3D10 Zellen, die einen eosinophilen Phänotyp aufweisen, als funktionell. Schließlich konnte mit den bicistronischen lentiviralen Partikeln, die mit GFP und shRNA gegen Foxp3 codiert waren, eine Herunterregulation von Foxp3 in CD4+CD25- T-Effektor-Zellen erreicht werden, was erneut die erfolgreiche Herstellung von funktionellen lentiviralen Partikeln bewies.rn

Regulation of Nox4 expression by histone deacetylases in human endothelial cells : involvement of epigenetic mechanisms

Nox4 is a member of the NADPH oxidase family, which represents a major source of reactive oxygen species (ROS) in the vascular wall. Nox4-mediated ROS production mainly depends on the expression levels of the enzyme. The aim of my study was to investigate the mechanisms of Nox4 transcription regulation by histone deacetylases (HDAC). Treatment of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and HUVEC-derived EA.hy926 cells with the pan-HDAC inhibitor scriptaid led to a marked decrease in Nox4 mRNA expression. A similar down-regulation of Nox4 mRNA expression was observed by siRNA-mediated knockdown of HDAC3. HDAC inhibition in endothelial cells was associated with enhanced histone acetylation, increased chromatin accessibility in the human Nox4 promoter region, with no significant changes in DNA methylation. In addition, the present study provided evidence that c-Jun played an important role in controlling Nox4 transcription. Knockdown of c-Jun with siRNA led to a down-regulation of Nox4 mRNA expression. In response to scriptaid treatment, the binding of c-Jun to the Nox4 promoter region was reduced despite the open chromatin structure. In parallel, the binding of RNA polymerase IIa to the Nox4 promoter was significantly inhibited as well, which may explain the reduction in Nox4 transcription. In conclusion, HDAC inhibition decreases Nox4 transcription in human endothelial cells by preventing the binding of transcription factor(s) and polymerase(s) to the Nox4 promoter, most likely because of a hyperacetylation-mediated steric inhibition. In addition, HDAC inhibition-induced Nox4 downregulation may also involves microRNA-mediated mRNA destabilization, because the effect of the scriptaid could be partially blocked by DICER1 knockdown or by transcription inhibition.

The interaction of Leishmania major parasites with human myeloid cells and its consequence for adaptive immunity

In der vorliegenden Arbeit fokussierten wir uns auf drei verschiedene Aspekte der Leishmanien-Infektion. Wir charakterisierten den Prozess des Zelltods „Apoptose“ bei Parasiten (1), untersuchten die Eignung von Makrophagen und dendritischen Zellen als Wirtszelle für die Entwicklung der Parasiten (2) und analysierten die Konsequenzen der Infektion für die Entstehung einer adaptiven Immunantwort im humanen System. Von zentraler Bedeutung für dieses Projekt war die Hypothese, dass apoptotische Leishmanien den Autophagie-Mechanismus ihrer Wirtszellen ausnutzen, um eine T-Zell-vermittelte Abtötung der Parasiten zu vermindern.rnWir definierten eine apoptotische Leishmanien-Population, welche durch eine rundliche Morphologie und die Expression von Phosphatidylserin auf der Parasitenoberfläche charakterisiert war. Die apoptotischen Parasiten befanden sich zudem in der SubG1-Phase und wiesen weniger und fragmentierte DNA auf, welche durch TUNEL-Assay nachgewiesen werden konnte. Bei der Interaktion der Parasiten mit humanen Makrophagen und dendritischen Zellen zeigte sich, dass die anti-inflammatorischen Makrophagen anfälliger für Infektionen waren als die pro-inflammatorischen Makrophagen oder die dendritischen Zellen. Interessanterweise wurde in den dendritischen Zellen jedoch die effektivste Umwandlung zur krankheitsauslösenden, amastigoten Lebensform beobachtet. Da sowohl Makrophagen als auch dendritische Zellen zu den antigenpräsentierenden Zellen gehören, könnte dies zur Aktivierung der T-Zellen des adaptiven Immunsystems führen. Tatsächlich konnte während der Leishmanien-Infektion die Proliferation von T-Zellen beobachtet werden. Dabei stellten wir fest, dass es sich bei den proliferierenden T-Zellen um CD3+CD4+ T-Zellen handelte, welche sich überraschenderweise als Leishmanien-spezifische CD45RO+ T-Gedächtniszellen herausstellten. Dies war unerwartet, da ein vorheriger Kontakt der Spender mit Leishmanien als unwahrscheinlich gilt. In Gegenwart von apoptotischen Parasiten konnte eine signifikant schwächere T-Zell-Proliferation in Makrophagen, jedoch nicht in dendritischen Zellen beobachtet werden. Da sich die T-Zell-Proliferation negativ auf das Überleben der Parasiten auswirkt, konnten die niedrigsten Überlebensraten in dendritischen Zellen vorgefunden werden. Innerhalb der Zellen befanden sich die Parasiten in beiden Zelltypen im Phagosom, welches allerdings nur in Makrophagen den Autophagie-Marker LC3 aufwies. Chemische Induktion von Autophagie führte, ebenso wie die Anwesenheit von apoptotischen Parasiten, zu einer stark reduzierten T-Zell-Proliferation und dementsprechend zu einem höheren Überleben der Parasiten.rnZusammenfassend lässt sich aus unseren Daten schließen, dass Apoptose in Einzellern vorkommt. Während der Infektion können sowohl Makrophagen, als auch dendritische Zellen mit Leishmanien infiziert und das adaptive Immunsystem aktivert werden. Die eingeleitete T-Zell-Proliferation nach Infektion von Makrophagen ist in Gegenwart von apoptotischen Parasiten reduziert, weshalb sie im Vergleich zu dendritischen Zellen die geeigneteren Wirtszellen für Leishmanien darstellen. Dafür missbrauchen die Parasiten den Autophagie-Mechanismus der Makrophagen als Fluchtstrategie um das adaptive Immunsystem zu umgehen und somit das Überleben der Gesamtpopulation zu sichern. Diese Ergebnisse erklären den Vorteil von Apoptose in Einzellern und verdeutlichen, dass der Autophagie-Mechanismus als potentielles therapeutisches Ziel für die Behandlung von Leishmaniose dienen kann.rn

Identification of preferentially targeted tumor-associated antigens in melanoma patients via mRNA stimulation of CD8+ blood lymphocytes

Until now, therapeutic vaccination of cancer patients has mainly relied on rather few T cell epitopes processed from structurally normal shared tumor antigens and presented by frequent HLA alleles. So far the design of these studies has not addressed the individuality of tumor-host interactions, which are not only determined by the antigenic tumor phenotype or the natural HLA polymorphism, but also by the individual T cell repertoire. The procedure described herein was developed to identify the preferential targets of the individual repertoire from a panel of known shared tumor-associated antigens. Lymphocytes were isolated from the peripheral blood of cancer patients or healthy donors and stimulated twice with autologous mRNA-transfected FastDC (Dauer et al., J Immunol. 170:4069, 2003). FastDC were generated from blood monocytes and separately transfected via lipofection with in vitro transcribed mRNAs encoding the panel antigens. Responder lymphocytes were tested on day 12 in a 20-hour IFN-g ELISPOT assay for recognition of 293T cells co-transfected pairwise with plasmids encoding the stimulation antigens and the respective individual’s HLA class I alleles. In a first step, stimulation parameters were optimized for the detection of anti-HCMV pp65 responses. A maximum amplification of pp65-specific CD8+ T cell responses was obtained at a rather low IL-2 concentration (25 IU/ml) and at a minimum APC-to-effector ratio of 1:10. Addition of IL-4, IL-7 or IL-15 did not substantially improve the stimulatory potential. The test was applied to the human melanoma models D05 and MZ2, in both of which multiple T cell-defined antigens had previously been identified by expression screening. Blood lymphocytes were stimulated in parallel with autologous tumor cells and with mRNA-transfected FastDC. In D05, T cell reactivities against three out of eleven epitopes induced by stimulation with tumor cells were also found after stimulation with mRNA-transfected FastDC. Two further T cell target epitopes were identified with mRNA but not with tumor cell stimulation. In MZ2, T cell responses against five distinct epitopes were detected on day 12 after stimulation with mRNA transfectants. The same responses were detectable after stimulation with tumor cells only on day 32. mRNA stimulations against 21 tumor-associated antigens in addition to HCMV pp65 were performed in four healthy individuals. In all cases, CD8+ T cells against HCMV pp65 could be expanded. Among tumor-associated antigens, only reactivity against Melan-A/MART-1 in association with HLA-A*0201 was detectable in one of the donors. The vaccination of patients with targets a priori known to be recognized by their T cell repertoire may help to improve the outcome of therapeutic vaccination.

Charakterisierung verschiedener Reifungsstadien humaner dendritischer Zellen und ihr Einfluss auf die T-Zelldifferenzierung

Diese Zusammenfassung der kumulativen Habilitationsschrift bezieht sich auf folgende Originalarbeiten:

The role of EBI-3 in a murine model of lung metastases of melanoma

In dieser Arbeit wurde die Rolle des Epstein-Barr Virus induzierten Gens 3 in einem Mausmodel des durch B16-F10 Zellen hervorgerufenen metastasierenden Melanoms untersucht. Das von aktivierten antigenpräsentierenden Zellen exprimierte EBI-3 gehört zur Familie der löslichen Typ 1 Zytokinrezeptoren, weist eine hohe Homologie zur p40 Untereinheit des IL-12 auf und bildet zusammen mit p28 das IL-27. Die intravenöse Injektion der B16-F10 Zelllinie führte zu einer signifikanten Erniedrigung der Tumormetastasen in den EBI-3 defizienten Lungen sowie zu einer höheren Lebenserwartung dieser Mäuse im Vergleich zu den B6 Wildtypen. Darüber hinaus habe ich in den EBI-3 defizienten Mäusen eine verminderte VCAM-1 Expression auf den Endothelzellen der Lunge gefunden während Änderungen in der VEGF Expression nicht detektiert wurden. Der immunologische Hintergrund, der diesen therapeutischen Effekt hervorrief, konnte durch die T-Zellaktivierung durch die kürzlich neu beschriebene DC Population, welche Interferon-produzierende Killer Dendritische Zellen genannt werden (IK-DC), die zusätzlich von aktivierten und maturierten klassischen DCs unterstützt wurden, erklärt werden. IK-DCs von EBI-3 defizienten Mäusen produzierten höhere Mengen an IFN-g während die klassischen DCs MHC und co-stimulatorische Moleküle exprimierten, welche die Sekretion von IL-12 initiierten. Das Zusammenspiel der genannten Faktoren induzierte eine verstärkte CD4 und CD8 T-Zellantwort in den Lungen dieser Mäuse. Dies wiederum resultierte im TNF- und TRAIL abhängigen programmierten Zelltod der B16-F10 Melanomzellen in den Lungen der EBI-3 defizienten Mäuse, wohingegen sowohl weitere anti-apoptotische Mechanismen als auch T regulatorische Zellen keinen Einfluss auf die in den EBI-3 defizienten Mäusen beobachtete Tumorabwehr zu spielen scheint. Schlussendlich konnten EBI-3 defiziente CD8+ T-Zellen, welche zuvor mit Tumorantigen geprimed wurden, adoptiv in B6 Wildtypmäuse transferiert werden, was zeigte, dass diese Zellen in der Lage sind, die Tumormasse in den Empfängermäusen signifikant zu verringern. Zusammengefasst, demonstrieren diese Daten, dass das Blockieren von EBI-3 im metastasierenden Melanom ein vielversprechender Angriffspunkt in der Tumortherapie darstellt.

Identifizierung und Charakterisierung T-zellerkannter tumorassoziierter Antigene im Melanommodell D41

In der vorliegenden Arbeit wurden Zielstrukturen autologer, tumorreaktiver CD8+ T-Zellen im Modell des Melanompatienten D41 charakterisiert, der im metastasierten Stadium nach Vakzinierung mit autologen dendritischen Zellen und bestrahlten Tumorzellen eine dauerhafte komplette Remission erreichte (O´Rourke et al., Melanoma Res. 17:316, 2007). Aus kryokonservierten Blutlymphozyten verschiedener Zeitpunkte wurden durch Stimulation mit autologen Tumorzellen (D41-MEL) in unabhängigen gemischten Lymphozyten-/Tumorzell-Kulturen (MLTCs) tumorreaktive CD8+ T-Zellen angereichert. Als Erstes wurde überprüft, ob sie gegen bekannte Melanomantigene in Assoziation mit den HLA-Klasse I-Allelen des Patienten gerichtet waren. Dabei zeigten sich Reaktivitäten gegen das melanosomale Differenzierungsantigen Melan-A mit HLA-A*0201 und darüber hinaus gegen die Cancer/Testis-Antigene (CTA) MAGE-A3 und MAGE-A6 mit HLA-A*0101, sowie NY-ESO-1, MAGE-A4 und MAGE-A10 mit HLA-A*0201. In einem zweiten Schritt wurde mit T-Zell-Klonen aus D41-MLTC 2, die keines dieser Antigene erkannten, eine cDNA-Expressionsbank von D41-MEL gescreent. Dies führte zur Klonierung einer für TSPY 1 (testis-specific protein Y-encoded 1) kodierenden cDNA mit einem der T-Zell-Klone. Er erkannte mit hoher Affinität die synthetischen TSPY 1-Peptide LLDDIMAEV (Aminosäurepositionen 66-73) und LLLDDIMAEV (Aminosäurepositionen 65-73) in Assoziation mit HLA-A*0201. Serologische Immunantworten gegen das als CTA einzustufende TSPY 1 sind bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals eine T-Zell-Antwort gegen TSPY 1 nachgewiesen. TSPY 1 trägt mutmaßlich zu Entstehung des Gonadoblastoms bei, seine Expression wurde jedoch z.B. auch in Seminomen, Leberzellkarzinomen und Melanomen nachgewiesen. Die Expression von TSPY 1 in der Zelllinie D41-MEL-Zellen war sehr heterogen. Einzelne Klone der Linie exprimierten TSPY 1 auf stabil hohem, andere Klone auf ebenso stabil intermediärem bzw. nicht detektierbarem Niveau. Die Expression und die Erkennung durch TSPY 1-reaktive T-Zell-Klone wurde durch die demethylierende Substanz 5-Aza-2´-deoxycytidine gesteigert. Dies spricht für eine Promotor-Hypermethylierung als Ursache fehlender bzw. niedriger Expression, wie dies für verschiedene CTA zutrifft. Die im Blut des Patienten D41 detektierbare antitumorale T-Zell-Reaktivität war bereits vor der Vakzinierung mit Tumorzellen nachweisbar und hatte sich somit spontan entwickelt. Ihre Individualität war vorgegeben durch das Antigenexpressionsmuster der D41-Tumorzellen, sowie durch den HLA-Phänotyp und mutmaßlich auch das T-Zellrepertoire des Patienten. Die detaillierte Analyse komplexer antitumoraler T-Zellantworten legt den Grundstein für eine Immuntherapie, die sich auf das tatsächliche Potential des individuellen T-Zellsystems stützen kann.

Molecular interaction of the human metalloprotease meprin beta with the amyloid precursor protein, ADAM10, and ADAM17 based on proteomics

Die Zinkendopeptidasen Meprin α und β sind Schlüsselkomponenten in patho(physiologischen) Prozessen wie Entzündung, Kollagenassemblierung und Angiogenese. Nach ihrer Entdeckung in murinen Bürstensaummembranen und humanen Darmepithelien, wurden weitere Expressionsorte identifiziert, z.B. Leukozyten, Krebszellen und die humane Haut. Tiermodelle, Zellkulturen und biochemische Analysen weisen auf Funktionen der Meprine in der Epithelialdifferenzierung, Zellmigration, Matrixmodellierung, Angiogenese, Bindegewebsausbildung und immunologische Prozesse hin. Dennoch sind ihre physiologischen Substrate weitgehend noch unbekannt. Massenspektrometrisch basierte Proteomics-Analysen enthüllten eine einzigartige Spaltspezifität für saure Aminosäurereste in der P1´ Position und identifizierten neue biologische Substratkandidaten. Unter den 269 extrazellulären Proteinen, die in einem Substratscreen identifiziert wurden, stellten sich das amyloid precursor protein (APP) and ADAM10 (a disintegrin and metalloprotease 10) als sehr vielversprechende Kandidaten heraus. Mehrere Schnittstellen innerhalb des APP Proteins, hervorgerufen durch verschiedenen Proteasen, haben unterschiedlichen Auswirkungen zur Folge. Die β-Sekretase BACE (β-site APP cleaving enzyme) prozessiert APP an einer Schnittstelle, welche als initialer Schritt in der Entwicklung der Alzheimer Erkrankung gilt. Toxische Aβ (Amyloid β)-Peptide werden in den extrazellulären Raum freigesetzt und aggregieren dort zu senilen Plaques. Membran verankertes Meprin β hat eine β-Sekretase Aktivität, die in einem Zellkultur-basierten System bestätigt werden konnte. Die proteolytische Effizienz von Meprin β wurde in FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)-Analysen bestimmt und war um den Faktor 104 höher als die von BACE1. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Meprin β die ersten zwei Aminosäuren prozessiert und somit aminoterminal einen Glutamatrest freisetzt, welcher nachfolgend durch die Glutaminylzyklase in ein Pyroglutamat zykliert werden kann. Trunkierte Aβ-Peptide werden nur in Alzheimer Patienten generiert. Aufgrund einer erhöhten Hydrophobie weisen diese Peptide eine höhere Tendenz zur Aggregation auf und somit eine erhöhte Toxizität. Bis heute wurde keine Protease identifiziert, welche diese Schnittstelle prozessiert. Die Bildung der Meprin vermittelten N-terminalen APP Fragmenten wurde in vitro und in vivo detektiert. Diese N-APP Peptide hatten keine cytotoxischen Auswirkungen auf murine und humane Gehirnzellen, obwohl zuvor N-APP als Ligand für den death receptor (DR) 6 identifiziert wurde, der für axonale Degenerationsprozesse verantwortlich ist. rnIm nicht-amyloidogenen Weg prozessiert ADAM10 APP und entlässt die Ektodomäne von der Zellmembran. Wir konnten das ADAM10 Propeptid als Substrat von Meprin β identifizieren und in FRET Analysen, in vitro und in vivo zeigen, dass die Meprin vermittelte Prozessierung zu einer erhöhten ADAM10 Aktivität führt. Darüber hinaus wurde ADAM10 als Sheddase für Meprin β identifiziert. Shedding konnte durch Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) oder durch das Ionophor A23187 hervorgerufen werden, sowie durch ADAM10 Inhibitoren blockiert werden. rnDiese Arbeit konnte somit ein komplexes proteolytisches Netwerk innerhalb der Neurophysiologie aufdecken, welches für die Entwicklung der Alzheimer Demenz wichtig sein kann.rn

Mechanismen der Resistenz und Sensitivierung von menschlichen malignen Melanomzellen gegenüber DNA-alkylierenden Zytostatika

Das metastasierende maligne Melanom ist durch eine geringe p53-Mutations-Rate und eine hohe Resistenz gegenüber Chemotherapie mit alkylierenden Agenzien wie Fotemustin (FM) und Temozolomid (TMZ) gekennzeichnet. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von p53 in der Resistenz von malignen Melanomzellen gegenüber FM untersucht und Möglichkeiten zur Sensitivierung von Melanomzellen gegenüber TMZ und FM aufgezeigt.rnAusgangspunkt war die Beobachtung, dass p53 Wildtyp (p53wt) Melanomzellen resistenter gegenüber FM sind als p53 mutierte (p53mt) Zellen. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass eine FM-Behandlung in p53wt Zellen eine Stabilisierung von p53 und eine Induktion des p53-Zielproteins p21 bewirkte. Mithilfe einer p53wt Zelllinie, welche einen p53 Knockdown trägt, konnte gezeigt werden, dass p53 für die geringe Apoptose-Rate nach FM-Behandlung verantwortlich ist. Eine Untersuchung der Interstrang-Crosslink (ICL)-Reparaturkapazität zeigte, dass p53mt Zellen im Gegensatz zu p53wt Zellen nicht in der Lage sind, FM-induzierte ICL zu reparieren. Dies ging mit einer im Vergleich zu p53wt Zellen starken DNA-Schadensantwort einher. Die Gene für die Proteine DDB2 und XPC wurden als durch FM regulierte DNA-Reparatur-Gene identifiziert, deren Induktion p53-abhängig und lang anhaltend (bis zu 144 h) erfolgt. Da XPC Knockdown-Zellen sensitiver als ihre Kontrollzellen gegenüber FM reagierten, konnte die biologische Relevanz von XPC bei der ICL-Reparatur bestätigt werden. Anhand von Xenograft-Tumoren wurde gezeigt, dass FM auch in situ eine Induktion von DDB2 und XPC auslöst. Die Beobachtung, dass DNA-Reparatur-Gene nach FM-Behandlung hochreguliert werden, liefert eine Erklärung für das schlechte Ansprechen von Melanomen auf eine Therapie mit ICL-induzierenden Chemotherapeutika.rnDes Weiteren befasste sich die vorliegende Arbeit mit Möglichkeiten zur Sensitivierung von Melanomzellen gegenüber den Chemotherapeutika TMZ und FM. In diesem Zusammenhang wurde Valproinsäure (VPA), ein in der Epilepsie-Therapie verwendetes Medikament und Histondesacetylase (HDAC)-Hemmer, bezüglich der chemosensitivierenden Wirkung untersucht. Zunächst konnte der in der Literatur häufig beschriebene stabilisierende Effekt von VPA auf „wildtypisches“ p53-Protein und destabilisierende Effekt auf mutiertes p53-Protein bestätigt werden. Zwei der vier untersuchten Zelllinien konnten mithilfe von VPA gegenüber TMZ sensitiviert werden, während nur eine der vier untersuchten Zelllinien gegenüber FM sensitiviert werden konnte. VPA begünstigt die Induktion von Apoptose, während der Effekt auf die Induktion von Nekrose nur gering ausfiel. Eine Wirkung von VPA auf die Aktivität des Resistenz-vermittelnden Enzyms O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) wurde nicht beobachtet. Zudem wurde ausgeschlossen, dass die Sensitivierung gegenüber TMZ und FM, welche S-Phase abhängige Gentoxine sind, auf einer VPA-induzierten Erhöhung der Proliferation beruht. Mithilfe einer Zelllinie, welche stabil dominant-negatives FADD (Fas-associated death domain) exprimiert, konnten keine Hinweise auf eine Beteiligung des extrinsischen Apoptose-Signalwegs an der VPA-vermittelten Sensitivierung gewonnen werden. Gleichzeitig wurde gezeigt, dass VPA keine Induktion der niedrig exprimierten Procaspase-8 verursachte. Mithilfe eines PCR-Arrays wurden transaktivierende und –reprimierende Effekte von VPA auf die Genexpression gezeigt, wobei das proapoptotische Protein BAX (Breakpoint cluster-2-associated x protein) als ein in der Sensitivierung involviertes Kandidatengen identifiziert wurde. Obwohl eine vollständige Aufklärung der dem Sensitivierungseffekt von VPA zu Grunde liegenden Mechanismen nicht erbracht werden konnte, zeigen die in dieser Arbeit erlangten Beobachtungen einen vielversprechenden Weg zur Überwindung der Resistenz von Melanomzellen gegenüber DNA-alkylierenden Zytostatika auf.rn

Analyse der Beteiligung von Toll-like-Rezeptoren an der DC-Aktivierung nach Parvovirus-H-1-Infektion

Ziel dieser Dissertation war es die funktionelle Rolle der Toll-like Rezeptoren (TLRs) und ihrer Signalwege bei der Aktivierung von dendritischen Zellen (DC) durch Parvovirus H-1- rn(H-1PV) induzierte Tumorzelllysate (TCL) zu untersuchen. rnDas angeborene Immunsystem bekämpft die Bildung und das Wachstum von Tumoren, insbesondere durch Interaktion von Effektor-Immunzellen mit Tumorzellen. Die Aktivierung dieser Immunreaktionen in der Antitumortherapie ist wünschenswert, aber in vielen Situationen nicht zufriedenstellend, da sie durch klassische systemische Therapie allein nicht immer erreicht werden kann. Die therapeutische Anwendung von onkolytischen Viren bei Patienten mit malignen Erkrankungen (Virotherapie) ist ein vielversprechendes Gebiet der Forschung. Die onkosuppressive und immunstimulierende Wirkung von H-1PV auf humane Tumor- und Immunzellen spricht für eine Verwendung in der Krebstherapie. Ein Aktivierung des Immunsystems durch H-1PV konnte bereits in unserer Arbeitsgruppe gezeigt werden.rnIn dieser Arbeit wurden wichtige Aspekte bezüglich der Aktivierung von Toll-like Rezeptoren bei einer H-1PV Infektion untersucht. Zunächst wurde die Rolle von TLRs nach der H-1PV Infektion untersucht. Humane embryonale Nierenzellen (HEK293) wurden stabil mit humanen TLRs transfiziert, um die Rolle spezifischer TLRs während der Aktivierung des Immunsystems zu untersuchen. TLR3 und TLR9 wurden durch eine H-1PV Infektion, die mit der NFκB-Translokation in den Zellkern korreliert, aktiviert. Mit Hilfe eines Reporterplasmides (pNiFty-Luc), wurde durch erhöhte Expression eines NFκB-induzierbaren Reportergens die NFκB-Aktivität im Anschluss an eine H-1PV Infektion nachgewiesen. Zudem wurde die immunologische Wirkung von H-1PV-induzierten Tumorzelllysaten (TCL) auf die humane antitumor-gerichtete Immunantworten analysiert. Ein humanes ex vivo-Modell, bestehend aus einer HLA-A2-positiven humanen Melanom-Zelllinie (SK29Mel) wurde verwendet, um Immunreaktionen mit entsprechenden HLA-restringierten humanen DCs zu untersuchen. DCs die mit H-1PV-infizierten SK29Mel Zellen koinkubiert wurden, zeigten eine erhöhte TLR3- und TLR9-Expression. Diese Daten deuten darauf hin, dass H-1PV-induzierte TCLs humane DCs stimulieren und dies zumindest teilweise durch TLR-abhängige Signalwege geschieht. Demnach wird eine DC-Reifung durch Kokultur mit H-1PV-induzierten TCLs über den TLR-Signalweg erreicht und führte u.a. zu einer NFκB-abhängigen Aktivierung des adaptiven Immunsystems. Die onkolytischen Virotherapie mit H-1PV erhöht so durch unterschiedliche Auswirkungen auf DCs die Immunreaktion und verstärkt die Anti-Tumor-Immunität. Diese Ergebnisse zeigen einen neuen potenziellen Ansatz für den Einsatz onkolytischer Viren für TLR-zielgerichtete Therapieoptionen und stellen eine ideale Möglichkeit zur Erweiterung der Krebsbehandlung dar.rn

Characterisation of human co-culture systems for applications in bone tissue engineering

For the successful integration of bone tissue engineering constructs into patients, an adequate supply with oxygen and nutrients is critical. Therefore, prevascularisation of bone tissue engineering constructs is desirable for bone formation, remodelling and regeneration. Co-culture systems, consisting of human endothelial cells and primary osteoblasts (pOB) as well as osteosarcoma cell lines, represent a promising method for studying the mechanisms involved in the vascularisation of constructs in bone tissue en- gineering and could provide new insights into the molecular and cellular mechanisms that control essential processes during angiogenesis. The present study demonstrated the im- portant components of co-culture systems with a focus on bone tissue replacement and the angiogenic effects of pOB and osteosarcoma cell lines on human endothelial cells. Furthermore, the studies emphasised an overall approach for analysis of signal molecules that are involved in the angiogenic activation of human endothelial cells by the regulation of VEGF-related pathways at the transcriptional and translational levels. The osteosarcoma cell lines Cal-72, MG-63 and SaOS-2, as well as pOB from several donors, differed in their angiogenesis-inducing potential in 2-D and 3-D co-culture systems. SaOS-2 cells appeared to have a high osteogenic differentiation level with no detectable angiogenesis-inducing potential in co-culture with human endothelial cells. The angiogenic potential of the osteoblast-like cells is mainly correlated with the upregulation of essential angiogenic growth factors, such as VEGF, bFGF and HGF and the downregulation of the angiogenesis inhibitor, endostatin. However, other factors involved in angiogenic regulation were found to differ between SaOS-2 cells, compared to Cal-72 and MG-63. The present study focuses on VEGF pathway-effecting genes as key players in the regulation of angiogenesis. The levels of VEGF and VEGF-effecting genes, such as TGF-α and TIMP-2 are down-regulated in SaOS-2 cells. In contrast, direct regulators of VEGF, such as IL6, IL8 and TNF are strongly upregulated, which indicates disruptions in growth factor regulating pathways in SaOS-2 cells. Potential pathways, which could be involved include MEK, PI3K, MAPK, STAT3, AKT or ERK. Additional treatment of co-cultures with single growth factors did not accelerate or improve the angiogenesis-inducing potential of SaOS-2 cells. Knowledge of the detailed molecular mechanisms involved in angiogenesis control will hopefully allow improved approaches to be developed for prevascularisation of bone tissue engineering constructs.

Untersuchungen zur antitumoralen Wirkungsweise eines bispezifischen MCSP-CD3 Antikörpers in vitro und im humanisierten Tumormausmodell

Humanes MCSP ist ein gut charakterisiertes Tumorantigen, das auf der Mehrzahl aller malignen Melanome hoch exprimiert wird, und stellt somit eine gute Zielstruktur für immuntherapeutische Ansätze dar. rnInnerhalb der vorliegenden Arbeit wurden die Wirkmechanismen eines neuen bispezifischen Antikörpers, der gegen humanes MCSP und CD3 auf T-Zellen gerichtet ist, in vitro und im humanisierten Tumormausmodell in vivo untersucht. In humanen T Zellkokulturen induzierte der bispezifische MCSP-CD3 Antikörper in Gegenwart MCSP-positiver Melanomzellen konzentrationsabhängige T-Zellaktivierung, Sekretion von Zytokinen und effiziente Tumorzelllyse durch CD4- und CD8-positive T-Zellen. Die induzierte Lyse war hierbei unabhängig von der T-Zellrezeptorspezifität sowie kostimulatorischen Molekülen und allein abhängig von der Expression des Tumorantigens sowie CD3 auf den T-Zellen. Wie hier diskutiert, liegt es nahe, dass die Freisetzung lytischer Moleküle (Perforin und Granzym-B) durch CD8- und auch CD4 positiver T-Zellen den Hauptmechanismus in der Lyse der Melanomzellen darstellt. rnUm die Wirksamkeit in vivo testen zu können, wurde ein humanisiertes Tumormausmodell etabliert. Die Injektion humaner hämatopoetischer Stammzellen in neugeborene Rag2-/-gc-/- Mäuse führte zur Entwicklung funktioneller T-Zellen im murinen Thymus, welche lymphatische Organe besiedelten. In vitro induzierten die T-Zellen humanisierter Mäuse in Anwesenheit des bispezifischen MCSP-CD3 Antikörpers ebenfalls konzentrationsabhängige Lyse der Melanomzellen. Wie hier gezeigt, induzierte die Injektion humaner Melanomzellen in humanisierte Mäuse keine messbare Abstoβungsreaktion. Unter Behandlung mit MCSP-CD3 wurde zwar eine erhöhte Anzahl humaner T-Zellen im Tumorgewebe nachgewiesen, jedoch verfügte die verwendete Melanomzelllinie über eine geringe basale T Zellinfiltration, geringe Vaskularisierung und ein noduläres Wachstumsverhalten. Wie innerhalb dieser Arbeit diskutiert, kann durch die Kombination mit Therapien, die eine erhöhte T-Zellinfiltration in das Tumorgewebe ermöglichen, die Wirksamkeit von bispezifischen Antikörpern möglicherweise gesteigert werden. rn