Analyse der Beteiligung von Toll-like-Rezeptoren an der DC-Aktivierung nach Parvovirus-H-1-Infektion

Ziel dieser Dissertation war es die funktionelle Rolle der Toll-like Rezeptoren (TLRs) und ihrer Signalwege bei der Aktivierung von dendritischen Zellen (DC) durch Parvovirus H-1- rn(H-1PV) induzierte Tumorzelllysate (TCL) zu untersuchen. rnDas angeborene Immunsystem bekämpft die Bildung und das Wachstum von Tumoren, insbesondere durch Interaktion von Effektor-Immunzellen mit Tumorzellen. Die Aktivierung dieser Immunreaktionen in der Antitumortherapie ist wünschenswert, aber in vielen Situationen nicht zufriedenstellend, da sie durch klassische systemische Therapie allein nicht immer erreicht werden kann. Die therapeutische Anwendung von onkolytischen Viren bei Patienten mit malignen Erkrankungen (Virotherapie) ist ein vielversprechendes Gebiet der Forschung. Die onkosuppressive und immunstimulierende Wirkung von H-1PV auf humane Tumor- und Immunzellen spricht für eine Verwendung in der Krebstherapie. Ein Aktivierung des Immunsystems durch H-1PV konnte bereits in unserer Arbeitsgruppe gezeigt werden.rnIn dieser Arbeit wurden wichtige Aspekte bezüglich der Aktivierung von Toll-like Rezeptoren bei einer H-1PV Infektion untersucht. Zunächst wurde die Rolle von TLRs nach der H-1PV Infektion untersucht. Humane embryonale Nierenzellen (HEK293) wurden stabil mit humanen TLRs transfiziert, um die Rolle spezifischer TLRs während der Aktivierung des Immunsystems zu untersuchen. TLR3 und TLR9 wurden durch eine H-1PV Infektion, die mit der NFκB-Translokation in den Zellkern korreliert, aktiviert. Mit Hilfe eines Reporterplasmides (pNiFty-Luc), wurde durch erhöhte Expression eines NFκB-induzierbaren Reportergens die NFκB-Aktivität im Anschluss an eine H-1PV Infektion nachgewiesen. Zudem wurde die immunologische Wirkung von H-1PV-induzierten Tumorzelllysaten (TCL) auf die humane antitumor-gerichtete Immunantworten analysiert. Ein humanes ex vivo-Modell, bestehend aus einer HLA-A2-positiven humanen Melanom-Zelllinie (SK29Mel) wurde verwendet, um Immunreaktionen mit entsprechenden HLA-restringierten humanen DCs zu untersuchen. DCs die mit H-1PV-infizierten SK29Mel Zellen koinkubiert wurden, zeigten eine erhöhte TLR3- und TLR9-Expression. Diese Daten deuten darauf hin, dass H-1PV-induzierte TCLs humane DCs stimulieren und dies zumindest teilweise durch TLR-abhängige Signalwege geschieht. Demnach wird eine DC-Reifung durch Kokultur mit H-1PV-induzierten TCLs über den TLR-Signalweg erreicht und führte u.a. zu einer NFκB-abhängigen Aktivierung des adaptiven Immunsystems. Die onkolytischen Virotherapie mit H-1PV erhöht so durch unterschiedliche Auswirkungen auf DCs die Immunreaktion und verstärkt die Anti-Tumor-Immunität. Diese Ergebnisse zeigen einen neuen potenziellen Ansatz für den Einsatz onkolytischer Viren für TLR-zielgerichtete Therapieoptionen und stellen eine ideale Möglichkeit zur Erweiterung der Krebsbehandlung dar.rn

The aim of this thesis was to investigate the functional role of Toll-like receptors (TLRs) and their signaling pathways in activation of dendritic cells (DC) by parvovirus H-1 (H-1PV)-induced tumor cell lysates.rnThe innate immune system combats the formation and growth of tumors, mainly relying on the interaction of effector immune cells with tumor cells. The implementation of these immune reactions into antitumor therapy is desirable but in many situations cannot be satisfactorily achieved through classical systemic therapy alone. The therapeutic use of oncolytic viruses in patients with malignancy (virotherapy) is a promising area of investigation. The oncosuppressive and immune-stimulating effect in the mode of action of H-1PV infection in human tumor cells makes it an attractive candidate for use in cancer therapy. An activation of the immune system by H-1PV could already be demonstrated in our working group. rnThis work examined important aspects regarding the activation of Toll-like receptors in rnH-1PV infection. Firstly the role of TLR activation following H-1PV infection was characterized. Human embryonic kidney cells (HEK293) transfected to stably express TLRs were used to further investigate the role of specific TLRs during immune activation. TLR3 and TLR9 were activated by H-1PV infection, which correlated with NFκB translocation to the nucleus. Using a reporter plasmid (pNiFty-Luc), NFκB activity, assessed by increased expression of an NFκB-inducible reporter gene, was increased following H-1PV infection.rnSecondly the immunologic effects of H-1PV induced tumor cell lysates (TCL) on human antitumor immune responses were evaluated. A human ex vivo model, HLA-A2-positive human melanoma cell line (SK29Mel) was used to study immune responses with corresponding HLA-restricted human dendritic cells (DCs). DCs coincubated with H-1PV-infected SK29Mel cells demonstrated increased TLR3 and TLR9 expression. These data suggest that H-1PV-induced TCLs stimulate human DCs at least in part through TLR dependent signaling pathways. Thus, DC maturation occurred through exposure to H-1PV-induced TCLs through TLR-signaling leading to NFκB-dependent activation of the adaptive immune system. rnThus H-1PV oncolytic virotherapy enhances immune priming by different effects on DCs and generates antitumor immunity. The selective activation of dendritic cells through therapeutic targeting of TLRs could increase the activation of anti-tumor immune responses.rnThese results indicate a potential new approach for the use of oncolytic viruses for TLR-targeted therapie and offer a potentially new approach for the expansion of tumor therapy.rn