Mechanismen der Resistenz und Sensitivierung von menschlichen malignen Melanomzellen gegenüber DNA-alkylierenden Zytostatika

Das metastasierende maligne Melanom ist durch eine geringe p53-Mutations-Rate und eine hohe Resistenz gegenüber Chemotherapie mit alkylierenden Agenzien wie Fotemustin (FM) und Temozolomid (TMZ) gekennzeichnet. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von p53 in der Resistenz von malignen Melanomzellen gegenüber FM untersucht und Möglichkeiten zur Sensitivierung von Melanomzellen gegenüber TMZ und FM aufgezeigt.rnAusgangspunkt war die Beobachtung, dass p53 Wildtyp (p53wt) Melanomzellen resistenter gegenüber FM sind als p53 mutierte (p53mt) Zellen. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass eine FM-Behandlung in p53wt Zellen eine Stabilisierung von p53 und eine Induktion des p53-Zielproteins p21 bewirkte. Mithilfe einer p53wt Zelllinie, welche einen p53 Knockdown trägt, konnte gezeigt werden, dass p53 für die geringe Apoptose-Rate nach FM-Behandlung verantwortlich ist. Eine Untersuchung der Interstrang-Crosslink (ICL)-Reparaturkapazität zeigte, dass p53mt Zellen im Gegensatz zu p53wt Zellen nicht in der Lage sind, FM-induzierte ICL zu reparieren. Dies ging mit einer im Vergleich zu p53wt Zellen starken DNA-Schadensantwort einher. Die Gene für die Proteine DDB2 und XPC wurden als durch FM regulierte DNA-Reparatur-Gene identifiziert, deren Induktion p53-abhängig und lang anhaltend (bis zu 144 h) erfolgt. Da XPC Knockdown-Zellen sensitiver als ihre Kontrollzellen gegenüber FM reagierten, konnte die biologische Relevanz von XPC bei der ICL-Reparatur bestätigt werden. Anhand von Xenograft-Tumoren wurde gezeigt, dass FM auch in situ eine Induktion von DDB2 und XPC auslöst. Die Beobachtung, dass DNA-Reparatur-Gene nach FM-Behandlung hochreguliert werden, liefert eine Erklärung für das schlechte Ansprechen von Melanomen auf eine Therapie mit ICL-induzierenden Chemotherapeutika.rnDes Weiteren befasste sich die vorliegende Arbeit mit Möglichkeiten zur Sensitivierung von Melanomzellen gegenüber den Chemotherapeutika TMZ und FM. In diesem Zusammenhang wurde Valproinsäure (VPA), ein in der Epilepsie-Therapie verwendetes Medikament und Histondesacetylase (HDAC)-Hemmer, bezüglich der chemosensitivierenden Wirkung untersucht. Zunächst konnte der in der Literatur häufig beschriebene stabilisierende Effekt von VPA auf „wildtypisches“ p53-Protein und destabilisierende Effekt auf mutiertes p53-Protein bestätigt werden. Zwei der vier untersuchten Zelllinien konnten mithilfe von VPA gegenüber TMZ sensitiviert werden, während nur eine der vier untersuchten Zelllinien gegenüber FM sensitiviert werden konnte. VPA begünstigt die Induktion von Apoptose, während der Effekt auf die Induktion von Nekrose nur gering ausfiel. Eine Wirkung von VPA auf die Aktivität des Resistenz-vermittelnden Enzyms O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) wurde nicht beobachtet. Zudem wurde ausgeschlossen, dass die Sensitivierung gegenüber TMZ und FM, welche S-Phase abhängige Gentoxine sind, auf einer VPA-induzierten Erhöhung der Proliferation beruht. Mithilfe einer Zelllinie, welche stabil dominant-negatives FADD (Fas-associated death domain) exprimiert, konnten keine Hinweise auf eine Beteiligung des extrinsischen Apoptose-Signalwegs an der VPA-vermittelten Sensitivierung gewonnen werden. Gleichzeitig wurde gezeigt, dass VPA keine Induktion der niedrig exprimierten Procaspase-8 verursachte. Mithilfe eines PCR-Arrays wurden transaktivierende und –reprimierende Effekte von VPA auf die Genexpression gezeigt, wobei das proapoptotische Protein BAX (Breakpoint cluster-2-associated x protein) als ein in der Sensitivierung involviertes Kandidatengen identifiziert wurde. Obwohl eine vollständige Aufklärung der dem Sensitivierungseffekt von VPA zu Grunde liegenden Mechanismen nicht erbracht werden konnte, zeigen die in dieser Arbeit erlangten Beobachtungen einen vielversprechenden Weg zur Überwindung der Resistenz von Melanomzellen gegenüber DNA-alkylierenden Zytostatika auf.rn

Mechanisms of resistance and sensitization of human malignant melanoma cells to DNA-alkylating cytostaticsrnrnMetastasizing malignant melanoma is characterized by a low frequency of p53 mutation and a high resistance to chemotherapy with alkylating agents like fotemustine (FM) or temozolomide (TMZ). This study describes the role of p53 in the resistance of malignant melanoma cells to alkylating agents and demonstrates strategies for sensitizing these cells to TMZ and FM. This study is based on the observation that p53 wild-type (p53wt) melanoma cells were more resistant to FM than p53 mutant (p53mt) cells. FM treatment caused stabilization of the p53 protein and induced the expression of the p53 target gene p21. By using a p53wt cell line knocked down in p53 it was shown that p53 is responsible for the low apoptotic response after FM treatment. Analysis of interstrand-crosslink (ICL) repair revealed that p53mt cells, in contrast to p53wt cells, were not able to repair FM-induced ICLs. This was accompanied by a strong FM-induced DNA damage response in p53mt cells. Genes coding for Xeroderma pigmentosum, complementation group C (XPC) and DNA damage-binding protein 2 (DDB2) were identified as DNA repair genes regulated by FM-induced p53 activity. Their induction is p53-dependent and lasts for up to 144 h. Knocking down XPC resulted in a more sensitive phenotype compared to control cells after FM treatment. This emphasizes the biological relevance of XPC in the repair of ICLs. Making use of melanoma xenograft tumors it was shown that FM also causes an induction of XPC and DDB2 in situ. The observed upregulation of DNA repair genes after FM treatment provides an explanation for the poor response of melanomas to chemotherapy with ICL-inducing drugs. As already stated, this study addresses strategies for sensitizing melanoma cells to the chemotherapeutic drugs TMZ and FM. In this context valproic acid (VPA), a widely-used anticonvulsant and histone deacetylase (HDAC) inhibitor, was investigated as to possible chemosensitizing properties. Firstly we could confirm the well described stabilizing effect of VPA on wild-type p53 protein, as well as the destabilizing effect of VPA on mutant p53 protein. In two of the four analyzed cell lines VPA caused a sensitization to TMZ, while one cell line could be sensitized to FM. VPA primes cells for apoptosis, while having only a minor effect on necrosis. No effect of VPA on the activity of the resistance-mediating enzyme O6-methylguanine-DNA Methyltransferase (MGMT) was observed. Additionally, sensitization to the S-phase killers TMZ and FM was not caused by a VPA-induced increase in cell proliferation. By using a cell line expressing dominant-negative FAS-associated death domain (FADD) no support for the involvement of the extrinsic apoptosis pathway could be shown. In line with this, VPA treatment did not lead to an induction of procaspase-8, whose low expression has been shown to mediate resistance to TMZ in melanoma cells. By using a PCR array it was shown that VPA has transactivating and transrepressing effects on gene expression. Proapoptotic Breakpoint cluster-2-associated x protein (BAX) was identified as a possible candidate responsible for the observed sensitization. Although the sensitization-mediating mechanisms could not be elucidated completely, the observations presented in this study provide a promising avenue for overcoming resistance of melanoma cells to DNA-alkylating cytostatics.rn