Análisis comparativo de tres técnicas de derivación de células madre

Las células madre embrionarias (Embryonic Stem Cells; ESC) son células pluripotentes que presentan la capacidad de dividirse indefinidamente a la vez que mantienen la habilidad para diferenciarse a cualquier tipo celular. Aunque de manera rutinaria se derivan a partir de la masa celular interna de embriones en estadio de blastocisto, también pueden derivarse a partir de embriones en estadios precompactacionales y de embriones reconstruidos por procesos de transferencia nuclear. Debido a que durante el desarrollo embrionario temprano, momento en el que se derivan las ESC, tienen lugar profundos cambios de metilación en el genoma, tanto la derivación como el cultivo se consagran como técnicas que pueden alterar los patrones de metilación en genes regulados por impronta genómica. Con el objetivo de analizar la estabilidad epigenética de embriones preimplantacionales y ESC murinas, en este trabajo se ha optimizado un protocolo de anàlisis de los niveles de metilación mediante pirosecuenciación. Para ello se han seleccionado tres genes regulados por impronta genómica (H19/Igf2, Snrpn and Peg3), dos genes relacionados con el mantenimiento de pluripotencia en ESC (Oct4, Nanog y Sox2) y dos genes marcadores de diferenciación temprana (Cdx2 y Gata6). Nuestros resultados muestran que algunos grupos de embriones preimplantacionales presentan una hipo e hipermetilación en las regiones diferencialmente metiladas (Differentially Methylated Regions, DMRs) de los genes Snrpn y Peg3. Además, la línea de ESC analizada presentó anomalías en los tres genes regulados por impronta genómica. No obstante, el hecho de que esta línea fuera inestable a nivel cariotípico no permite establecer una relación entre el cultivo in vitro o la técnica de derivación y la inestabilidad epigenética demostrada. Por todo esto, parece pertinente analizar tanto la integridad epigenética como la estabilidad cromosómica de ESC antes de proceder a realizar ensayos clínicos en humanos.

Cirp function and characterisation in RNA and microRNAs

In order to search for novel genes involved in cell proliferation, the hypothesis was that by infecting primary cells with a cDNA library of immortal cells would render immortalizing genes. Consequently it has been discovered CIRP (Cold inducible RNA-binding protein). Mammalian cells exposed to mild hypothermia show a general inhibition of protein synthesis and a concomitant increase in the expression of a small number of cold-shock mRNAs and proteins. Rbm3, another RNA binding protein belonging to the same family, has been postulated to facilitate protein synthesis at mild cold shock. To investigate if the same occurs for CIRP, CIRP was overexpressed in primary cells and protein sintesis was measured. Interestingly, CIRP increased protein synthesis, however, such increase did not involve an increase in the polysome fraction or affected the ribosome profile. In addition, the effect caused by CIRP inhibition or knockdown was also analyzed. Different siRNAs against CIRP were tested. Once checked their efficiency by decreasing CIRP at mRNA and protein levels, proliferation was tested by BrdU, cell number (DAPI) and proliferation curves were performed. Interestingly, CIRP provoke a decreased proliferation in primary cells: MEFs, HMEC; and cancer cells: TERA2 and HeLa. In conclusion, we describe for the first time that CIRP bypasses replicative senescence when over-expressed at physiological temperature (37ºC) by increasing a general protein synthesis. This effect is achieved through ERK1/2 activation in MEFs.The decrease in growth rate found in mammalian cells treated with mild cold stress is not entirely attributable to arrested metabolism. This decrease may also involve an active process in which CIRP and other stress-responsive proteins play a fundamental role in stimulating proliferation. Although most cell proteins are down-regulated or inhibited with cold stress, CIRP is activated to maintain cells in an active proliferative status and its overexpression at 37°C might be potentially oncogenic.

Projectes d’autoaprenentatge de Biologia Cel·lular a la Llicenciatura de Medicina

Aquest projecte de MQD ha permès realitzar una sèrie d’experiències diverses i valuoses que han apuntat formes alternatives en la docència de la Biologia Cel·lular i l’aprenentatge de l'estudiant de la llicenciatura o del grau de medicina. En base a la valoració qualitativa del grau de satisfacció dels usuaris i en un estudi antitatiu de la seva opinió, considerem que ha estat experiències molt vàlides que afavoreixen que l’alumne participi de forma més activa en la seva formació. La principal dificultat observada ha estat o millor dit serà, l’aplicació de les experiències desenvolupades, de forma obligatòria i generalitzada, a tots els alumnes, sobretot als de 1er curs, donat que es tracta d’un grup molt nombrós (més de 300 alumnes). De totes maneres l’experiència adquirida ha estat molt favorable. Les activitats desenvolupades es continuen aplicant i es continuaran aplicant en el nou pla de medicina. Una aplicació perllongada en cursos successius afavorirà poder extreure’n conclusions de tipus més quantitatiu a més de les apreciacions qualitatives.

Biologia, rituals i religiositat (I)

Tradicionalment hem pensat que la fe és fruit d"una elecció personal. Tanmateix, si el fet religiós és universal, no podria ser que la nostra biologia l"estigués també propiciant?

Biologia, religiositat i rituals (i II)

La religiositat pot actuar de mecanisme de cohesió, però sobretot a nivell de societats tribals on tots pertanyen a la mateixa comunitat

Josep Egozcue

Biografia de Josep Egozcue, primer catedràtic a Espanya de Biologia Cel•lular i un dels introductors de la citogenètica al nostre país. Ha estat una autoritat científica en el camp de l’evolució cromosòmica, de la citogenètica del càncer, de la biologia de la reproducció i en temes de bioètica.

L'aprenentatge basat en problemes en models híbrids de docència-aprenentatge

La Facultat de Ciències de la Salut i de la Vida ha utilitzat des de 2004 la metodologia d'aprenentatge basat en problemes (en endavant ABP) com a mètode docent en els seus estudis de Biologia. En aquest període hem après algunes de les claus de l'aplicació del mètode en els nostres estudis. En primer lloc, cal disposar d'elements formatius que afavoreixin la formació dels tutors que participin en el projecte. Per assolir aquest objectiu hem dissenyat un portal on els nostres professors poden disposar de materials útils per a la seva activitat, així com de documents que permetin entendre millor el que suposa l'ABP. En segon lloc, el projecte tenia l'objectiu de dissenyar i avaluar activitats que permetessin integrar les pràctiques de laboratori en la lògica de la resolució de problemes pròpia de l'ABP. En aquest sentit vam dissenyar dues activitats en el tercer curs de la llicenciatura que anomenaren aprenentatge basat en el laboratori (ABL). Per aquest motiu es van dissenyar problemes que tinguessin una primera part de resolució a l'aula en grup de tutoria i una segona que obligués els estudiants a realitzar experiments de laboratori dirigits a entendre i resoldre les qüestions plantejades al grup de tutoria. L'ABL-1 fou un projecte de biologia cel·lular i destinat a aprofundir en els mecanismes implicats en els fenòmens de diferenciació dels miòcits. L'ABL-2 era un projecte conjunt dels professors de Fisiologia vegetal, Bioestadística i Microbiologia. En aquest cas es desitjava que els estudiants plantegessin la resolució a un problema que suposava la manipulació genètica de cèl·lules vegetals per fer possible que produïssin una substància específica, l'escopolamina. Finalment els estudiants havien d'escriure un article original com a projecte final de cada ABL. Els resultats dels dos anys d'experimentació han esta altament satisfactoris, d'acord amb les enquestes completades per alumnes i professors.

Utilització de plantes d'Arabidopsis thaliana mutants de CK2 per a l'establiment de línies cel·lulars i per a l'estudi de la implicació de la CK2 en l'estructuració de la cromatina

La proteïna CK2 és una Ser/Thr fosfotransferasa evolutivament conservada. Està formada per dues subunitats diferents, α (catalítica) i β (reguladora), que s’associen en un complex heterotetramèric (α2β2). L’activitat d’aquest enzim està regulada per varis mecanismes que la modulen diferencialment en funció del substrat, entre ells, la localització subcel·lular de les diferents subunitats. A partir de plantes transgèniques que contenen les subunitats de CK2 fusionades a una proteïna fluorescent (GFP o YFP) hem establert línies cel·lulars que permetran analitzar, en treballs futurs, els canvis de localització subcel·lular de les subunitats de CK2 provocats per diferents estímuls. La CK2 intervé en un gran nombre de processos cel·lulars, entre d’altres, metabolisme, transport a nucli, control del cicle cel·lular i reparació del DNA. Amb la finalitat d’estudiar el paper de la CK2 en el desenvolupament de les plantes, membres del grup van generar un mutant dominant negatiu per transformació estable de plantes d’Arabidopsis thaliana. Estudis previs mostraven que la pèrdua d’activitat CK2 en aquestes plantes provocava una alteració de l’activitat mitòtica i un bloqueig del cicle cel·lular. Els resultats obtinguts en aquest treball indiquen que aquests fenotips podrien ser conseqüència de la implicació de la CK2 en processos d’estructuració de la cromatina.

Elaboració de nous recursos docents en el camp de la biologia vegetal, mitjançant l'ús de noves tecnologies de microscòpia com làser confocal i multifotó

Aquest projecte s'ha realitzat al Servei de Microscòpia de la Universitat Autònoma de Barcelona, i ha tingut una durada de dos anys (2007-2009). Els objectius concrets d'aquest projecte assolits per a les diferents assignatures ha estat l'anàlisi de característiques citològiques, característiques morfològiques i anatòmiques de les estructures vegetatives dels diferents nivells d’organització, característiques morfològiques i anatòmiques de les estructures reproductores. El material docent obtingut en aquest projecte està sent utilitzat en les assignatures següents: Botànica Farmacèutica, Biodiversitat vegetal marina, Recursos vegetals aquàtics: les algues, Plantes d'ús alimentari, Conserv. i gestió de poblacions i comunitats marines, Usos i cultius de recursos algals marins, B. i diversitat de criptògames, Biologia II, Tècniques Exp. de biologia II, Botànica, Biologia animal i vegetal. Per a la realització de l’estudi, s'ha obtingut una col·lecció d’imatges al MLC, MER i MET per aclarir els criteris sistemàtics. Durant el primer any s’han adquirit totes les imatges necessàries, per tal de poder elaborar el material didàctic en suport digital. Durant el segon any s’ha implementat aquest material a les respectives classes pràctiques i s’ha avaluat la seva importància en la millora de la formació dels alumnes i del suport al professor. L’aplicació del material elaborat a la docència pràctica durant el tot segon any ha permès fer un primer estudi per valorar la seva eficàcia i fer-hi les correccions oportunes. Durant tot el projecte, el treball conjunt de professors i tècnics ha estat bàsic per a l’obtenció de material didàctic adequat a la realitat dels estudis actuals i a la docència pràctica.

La millor comprensió del desenvolupament cardíac i el dany cel•lular en els miòcits ajudarà a definir dianes terapèutiques

En el cor embrional, la senyalització de mort cel•lular apoptòtica iniciada per receptors de mort i les caspases executores 3 i 7 exerceixen un paper important durant el desenvolupament cardíac no relacionat amb la mort cel•lular, i posteriorment són silenciats en l’adult, on les vies independents de caspases estan implicades en la mort cel•lular patològica. Resultats previs del nostre grup han contribuït a entendre com es regula i silencia en el cor l’expressió dels gens de la via apoptòtica depenent de caspases durant el desenvolupament; a més, resultats no publicats demostren que les caspases regulen el procés d’expressió de gens en el cor i, contràriament a la maquinària depenent de caspases, TatD, una nucleasa, ’expressa abundantment al cor postnatal. Es desconeixen les funcions de la senyalització apoptòtica durant el desenvolupament cardíac, tot i que són essencials per al desenvolupament, a més, la senyalització independent de caspases implicada al dany cel•lular en els miòcits només es coneix parcialment, el nostre objectiu és contribuir al coneixement d’ambdós fenòmens. Creiem que les caspases podrien processar proteïnes reguladores de l’expressió de gens musculars alterant la seva activitat, mentre que TatD té un paper rellevant en el dany cel•lular però també en la funció cardíaca normal. Volem caracteritzar la contribució de les caspases 3 i 7 en el desenvolupament cardíac, utilitzant models in vivo (estem finalitzant els creuaments necessaris per a disposar dels animals amb el genotip desitjat) i in vitro (pràcticament hem preparat tot el material i hem optimitzat els protocols per a tirar-ho endavant). També volem caracteritzar la funció de TatD durant el desenvolupament i fisiologia del cor i conèixer-ne la seva funció utilitzant models in vitro i in vivo.

Esfingolipids i senyal•lització cel.lular: l'(E)-2-hexadecenal com a possible lípid bioactiu

L’esfingosina-1-fosfat (S1P) és un lípid bioactiu amb funcions crucials en la biologia cel•lular. Entre aquestes, la seva activitat mitogènica i citoprotectora són les més estudiades. L’S1P és catabolitzada intracel•lularment mitjançant l’esfingosina-1-fosfat liasa (SGPL1) per generar (E)-2-hexadecenal i fosforiletanolamina. L’objectiu d’aquest projecte és explorar si l’(E)-2-hexadecenal és realment un catabòlit innocu o bé si, pel seu caràcter acceptor de Michael, és capaç de reaccionar amb pèptids o proteïnes específics. Aquesta interacció podria traduïr-se en funcions biològiques determinades, algunes de les quals són possiblement atribuïdes a l’esfingosina-1-fosfat com a tal. Per poder explorar el potencials adductes proteïcs amb l’aldehid, s’han emprat, sobre cèl•lules HeLa que sobreexpressen SGPL1, sondes anàlegs a esfingosina i esfinganina (i els seus derivats fosforil•lats) que presenten una funció azida en la posició omega de la cadena esfingoide. Aquestes, mitjançant química click sense coure, s’han fet reaccionar amb una molècula que presenta un dibenzociclooctí unit a biotina DBCObiotina). Després d’aïllar les proteïnes així biotinilades amb una reïna d’estreptavidina, aquestes es van separar per electroforesi. Les bandes proteïques observades es van extreure del gel i es van digerir amb tripsina, per posteriorment analitzar els pèptids per MALDI-TOF, el que permetria l’identificació de proteïnes a partir de “peptide mass fingerprinting”. Lamentablement, a la fi d’aquest contracte, encara no s’ha pogut identificar cap proteïna que s’uneixi a l’aldehid alliberat per la reacció de l’esfingosina-1- fosfat liasa. No obstant, durant aquest temps s’ha millorat el mètode per detectar aquests adductes proteïcs. Per això, si la recerca continua en aquesta línia, properament es podria saber amb certesa si existeixen o no aquestes interaccions covalents entre determinades proteïnes i l’(E)-2-hexadecenal.

ORMDL proteins are a conserved new family of endoplasmic reticulum membrane proteins

Background: Annotations of completely sequenced genomes reveal that nearly half of the genes identified are of unknown function, and that some belong to uncharacterized gene families. To help resolve such issues, information can be obtained from the comparative analysis of homologous genes in model organisms. Results: While characterizing genes from the retinitis pigmentosa locus RP26 at 2q31-q33, we have identified a new gene, ORMDL1, that belongs to a novel gene family comprising three genes in humans (ORMDL1, ORMDL2 and ORMDL3), and homologs in yeast, microsporidia, plants, Drosophila, urochordates and vertebrates. The human genes are expressed ubiquitously in adult and fetal tissues. The Drosophila ORMDL homolog is also expressed throughout embryonic and larval stages, particularly in ectodermally derived tissues. The ORMDL genes encode transmembrane proteins anchored in the endoplasmic reticulum (ER). Double knockout of the two Saccharomyces cerevisiae homologs leads to decreased growth rate and greater sensitivity to tunicamycin and dithiothreitol. Yeast mutants can be rescued by human ORMDL homologs. Conclusions: From protein sequence comparisons we have defined a novel gene family, not previously recognized because of the absence of a characterized functional signature. The sequence conservation of this family from yeast to vertebrates, the maintenance of duplicate copies in different lineages, the ubiquitous pattern of expression in human and Drosophila, the partial functional redundancy of the yeast homologs and phenotypic rescue by the human homologs, strongly support functional conservation. Subcellular localization and the response of yeast mutants to specific agents point to the involvement of ORMDL in protein folding in the ER.

Avaluació de la presència d'organismes entomopatògens (nematodes i fongs) a sòls d'avellaners amb diferents tipus de producció

El present estudi pertinent a una fase inicial d’un projecte d’investigació del Ministeri d’Educació i Ciència que es porta a terme al Departament de Biologia Animal, de Biologia Vegetal i d’Ecologia (BABVE) de la Universitat Autònoma de Barcelona amb col·laboració del Departament d’Agricultura, Alimentació i Acció Rural de la Generalitat de Catalunya anomenat “Control biològic del diabló de l’avellaner, Curculio nucum L. (Coleoptera, Curculionidae) mitjançant organismes entomopatògens (nematodes i fongs)”, es basa en la recerca d’organismes autòctons en els camps d’avellaners que un cop aïllats i caracteritzats puguin ser utilitzats com a insecticides biològics pel control de la plaga clau que afecta els avellaners de Catalunya, el diabló de l’avellaner (Curculio nucum L.). Aquest insecte, pertanyent a la família dels coleòpters presenta una àmplia distribució a l’Europa temperada i septentrional, essent especialment abundant a Espanya, Itàlia i Turquia.

Microsensors químics: ISFET i MEMFET

Treball de recerca realitzat per un alumne d’ensenyament secundari i guardonat amb un Premi CIRIT per fomentar l'esperit científic del Jovent l’any 2008. La nanobiotecnologia és una branca de la nanociència i/o nanotecnologia que previsiblement tindrà un gran creixement i impacte durant els propers anys en molts camps i especialment en el de la diagnosi i tractament de malalties. Això requereix disposar de biosensors a escala nanomètrica que siguin molt sensibles i selectius enfront d’agents químics i biològics, a fi de poder obtenir dades en temps real “in situ” a nivell cel•lular i facilitar tractaments específics i personalitzats. Un petit pas previ als nanobiosensors són els microsensors químics, que poden ser fàcilment implantats en teixits humans sense lesionar-los i proporcionar mesures freqüents o contínues del pH o de la concentració de diversos ions que són dades importants per determinar l’estat de salut d’una persona. Els sensors ISFET tenen una configuració que els permet detectar i mesurar les concentracions de ions H+, per tant mesuren el pH. Entre les seves aplicacions hi destaca la gran eficàcia en la detecció del ió H+ en petites concentracions, que, entre altres usos com els biomèdics, és de gran importància en la mesura de la qualitat dels terrenys de cultiu. Si el sensor tipus ISFET és modificat mitjançant una membrana, com es fa en el present treball, pot desenvolupar moltes aplicacions en el camp de la salut, com és el cas de la detecció de cèl•lules mortes dins el cos humà, i per tant detectar de manera precoç la necrosi.

Combinatorial Synthesis and Biological Evaluation of Inhibitors of D-Ala-D-Ala-Ligase

Report for the scientific sojourn carried out at the Max Planck Institut of Molecular Phisiology, Germany, from 2006 to 2008.The work carried out during this postdoctoral stage was focused on two different projects. Firstly, identification of D-Ala D-Ala Inhibitors and the development of new synthethic approaches to obtain lipidated peptides and proteins and the use of these lipidated proteins in biological and biophysical studies. In the first project, new D-Ala D-Ala inhibitors were identified by using structural alignments of the ATP binding sites of the bacterial ligase DDl and protein and lipid kinases in complex with ATP analogs. We tested a series of commercially available kinase inhibitors and found LFM-A13 and Tyrphostine derivatives to inhibit DDl enzyme activity. Based on the initial screening results we synthesized a series of malononitrilamide and salicylamide derivatives and were able to confirm the validity of these scaffolds as inhibitors of DDl. From this investigation we gained a better understanding of the structural requirements and limitations necessary for the preparation of ATP competitive DDl inhibitors. The compounds in this study may serve as starting points for the development of bi-substrate inhibitors that incorporate both, an ATP competitive and a substrate competitive moiety. Bisubstrate inhibitors that block the ATP and D-Ala binding sites should exhibit enhanced selectivity and potency profiles by preferentially inhibiting DDl over kinases. In the second project, an optimized synthesis for tha alkylation of cysteins using the thiol ene reaction was establisehd. This new protocol allowed us to obtain large amounts of hexadecylated cysteine that was required for the synthesis of differently lipidated peptides. Afterwards the synthesis of various N-ras peptides bearing different lipid anchors was performed and the peptides were ligated to a truncated N-ras protein. The influence of this differently lipidated N-ras proteins on the partioning and association of N-Ras in model membrane subdomains was studied using Atomic Force Microscopy.