Esfingolipids i senyal•lització cel.lular: l'(E)-2-hexadecenal com a possible lípid bioactiu

L’esfingosina-1-fosfat (S1P) és un lípid bioactiu amb funcions crucials en la biologia cel•lular. Entre aquestes, la seva activitat mitogènica i citoprotectora són les més estudiades. L’S1P és catabolitzada intracel•lularment mitjançant l’esfingosina-1-fosfat liasa (SGPL1) per generar (E)-2-hexadecenal i fosforiletanolamina. L’objectiu d’aquest projecte és explorar si l’(E)-2-hexadecenal és realment un catabòlit innocu o bé si, pel seu caràcter acceptor de Michael, és capaç de reaccionar amb pèptids o proteïnes específics. Aquesta interacció podria traduïr-se en funcions biològiques determinades, algunes de les quals són possiblement atribuïdes a l’esfingosina-1-fosfat com a tal. Per poder explorar el potencials adductes proteïcs amb l’aldehid, s’han emprat, sobre cèl•lules HeLa que sobreexpressen SGPL1, sondes anàlegs a esfingosina i esfinganina (i els seus derivats fosforil•lats) que presenten una funció azida en la posició omega de la cadena esfingoide. Aquestes, mitjançant química click sense coure, s’han fet reaccionar amb una molècula que presenta un dibenzociclooctí unit a biotina DBCObiotina). Després d’aïllar les proteïnes així biotinilades amb una reïna d’estreptavidina, aquestes es van separar per electroforesi. Les bandes proteïques observades es van extreure del gel i es van digerir amb tripsina, per posteriorment analitzar els pèptids per MALDI-TOF, el que permetria l’identificació de proteïnes a partir de “peptide mass fingerprinting”. Lamentablement, a la fi d’aquest contracte, encara no s’ha pogut identificar cap proteïna que s’uneixi a l’aldehid alliberat per la reacció de l’esfingosina-1- fosfat liasa. No obstant, durant aquest temps s’ha millorat el mètode per detectar aquests adductes proteïcs. Per això, si la recerca continua en aquesta línia, properament es podria saber amb certesa si existeixen o no aquestes interaccions covalents entre determinades proteïnes i l’(E)-2-hexadecenal.

Sphingosine-1-phosphate (S1P) is a well-known bioactive lipid with crucial functions in cellular biology. Its activities as mitogenic and cytoprotective lipid are the most studied. S1P is catabolized by sphingosine-1-phosphate lyase to release (E)-2-hexadecenal and phosphorylethanolamine. The aim of this project is to explore the ability of (E)-2-hexadecenal, a Michael acceptor, to react with specific peptides or proteins. This potential interaction would be traduced in concrete biological functions, some of them already attributed to S1P. In order to explore this possibility, we have added, to SGPL1 overexpressing HeLa cells, some sphingoid probes (sphingosine, sphinganine and their phosphorylated derivatives) containing an azide group at the omega position of the sphingoid chain. These molecules, by means of copper-free click chemistry, reacted with a molecule containing a dibenzocyclooctyne and a biotin (DBCO-biotin). After the affinity isolation using streptavidin-agarose beads, the biotinylated proteins were separated by electrophoresis. The protein bands were extracted and digested with trypsin. The resulting peptides were analyzed by MALDI-TOF, to identify the proteins by “peptide mass fingerprinting”. Unfortunately, at the end of this contract, any protein adducts have been found. However, the protocol to isolate and identify them have been set up and, probably, if this research goes on, the covalent interactions between (E)-2-hexadecenal and proteins would be soon identified.