Combinatorial Synthesis and Biological Evaluation of Inhibitors of D-Ala-D-Ala-Ligase

Report for the scientific sojourn carried out at the Max Planck Institut of Molecular Phisiology, Germany, from 2006 to 2008.The work carried out during this postdoctoral stage was focused on two different projects. Firstly, identification of D-Ala D-Ala Inhibitors and the development of new synthethic approaches to obtain lipidated peptides and proteins and the use of these lipidated proteins in biological and biophysical studies. In the first project, new D-Ala D-Ala inhibitors were identified by using structural alignments of the ATP binding sites of the bacterial ligase DDl and protein and lipid kinases in complex with ATP analogs. We tested a series of commercially available kinase inhibitors and found LFM-A13 and Tyrphostine derivatives to inhibit DDl enzyme activity. Based on the initial screening results we synthesized a series of malononitrilamide and salicylamide derivatives and were able to confirm the validity of these scaffolds as inhibitors of DDl. From this investigation we gained a better understanding of the structural requirements and limitations necessary for the preparation of ATP competitive DDl inhibitors. The compounds in this study may serve as starting points for the development of bi-substrate inhibitors that incorporate both, an ATP competitive and a substrate competitive moiety. Bisubstrate inhibitors that block the ATP and D-Ala binding sites should exhibit enhanced selectivity and potency profiles by preferentially inhibiting DDl over kinases. In the second project, an optimized synthesis for tha alkylation of cysteins using the thiol ene reaction was establisehd. This new protocol allowed us to obtain large amounts of hexadecylated cysteine that was required for the synthesis of differently lipidated peptides. Afterwards the synthesis of various N-ras peptides bearing different lipid anchors was performed and the peptides were ligated to a truncated N-ras protein. The influence of this differently lipidated N-ras proteins on the partioning and association of N-Ras in model membrane subdomains was studied using Atomic Force Microscopy.

Estudi realitzat a partir d’una estada al Max Planck Institut of Molecular Phisiology, Alemanya, entre 2006 i 2008. S’han realitzat dos projectes. En primer lloc la identificació de nous lligands per a proteïnes gràcies a una nova aproximació que combina l'ús de mètodes computacionals amb el desenvolupament de llibreries basades en productes naturals. Segons aquesta aproximació, la similitud estructural existent entre diferents proteïnes pot ser utilitzada com a punt de partida per l'obtenció de nous lligands. Així, un lligand conegut d'una proteïna pot servir com a punt de partida per a l'obtenció de lligands per altres proteïnes que formin part del mateix "cluster". Aquest projecte que requereix l'ús de mètodes multidisciplinaris com la síntesi orgànica, el desenvolupament d'assaigs in vitro i l'expressió i purificació de proteïnes entre d' altres, ha permès trobar nous inhibidors per a l'enzim DD-ligasa en base a la seva similitud estructural amb diferents kinases com p56lck o cdc2. El segon projecte dur a terme durant aquesta estada postdoctoral s´ha basat en el desenvolupament de nous mètodes de síntesi de proteines lipidades per a utilitzar-les posteriorment com a eina química en estudis bioquímics, biofísics o de l'àmbit de la biologia cel•lular. Concretament el projecte s' ha centrat en el desenvolupament de nous mètodes de síntesi de la proteïna Ras lipidada així com el posterior estudi de la distribució de Ras en els diferents microdominis de membranes que componen les cèl•lules, mitjançant espectroscòpia de fluorescència o microscopi de forca atòmica, entre d'altres.