Aljube, uma cadeia política

Dissertação apresentada para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em História Contemporânea

Ocorrência, diagnóstico molecular e resistência a antifúngicos de Candida sp. de infecções vaginais em Portugal e Cabo-Verde

Dissertação para a obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Transporte do brometo de etídio através da parede celular de Mycrobacterium smegmatis: desenvolvimento e aplicação de metodologias de quantificação do transporte e correlação com a resistência aos antibióticos

O efluxo activo e a permeabilidade celular reduzida são consideradas as principais causas da resistência intrínseca micobacteriana a diversos antimicrobianos. Neste estudo comparámos a capacidade de extrusão do brometo de etídio (EtBr), um substrato universal de bombas de efluxo, pela estirpe selvagem M. smegmatis mc2155 com estirpes mutantes deletadas para LfrA e MspA, respectivamente a principal bomba de efluxo e porina de M. smegmatis, na presença e ausência dos inibidores de bombas de efluxo (IBEs) verapamil, tioridazina, clorpromazina e carbonil cianeto mclorofenilhidrazona (CCCP) e correlacionámos estes resultados com a capacidade destes IBEs em reduzir a susceptibilidade de M. smegmatis a diversos antibióticos. Os resultados obtidos mostram que, na ausência da principal porina de M. smegmatis, MspA, a acumulação de EtBr diminui e as células tornam-se igualmente mais resistentes a diversos antibióticos. Quando a principal bomba de efluxo de M. smegmatis, LfrA, é deletada a estirpe mutante apresenta um incremento na acumulação de EtBr e um aumento na susceptibilidade ao EtBr, isoniazida, rifampicina, etambutol e ciprofloxacina. Na presença dos IBEs testados, com excepção do CCCP, observa-se uma redução da concentração mínima inibitória para a estreptomicina, rifampicina, amicacina, ciprofloxacina, claritromicina e eritromicina. Estes resultados colocam em evidência que a porina MspA é um canal importante para a entrada de EtBr e antibióticos nas células e que o efluxo activo através da bomba de efluxo LfrA está envolvido na resistência de baixo nível a diversos antibióticos e EtBr em M. smegmatis. As metodologias desenvolvidas neste trabalho e os resultados obtidos proporcionaram um contributo para o melhor conhecimento dos dois principais mecanismos responsáveis pela resistência intrínseca micobacteriana a diversos antimicrobianos, considerada como um importante factor facilitador da aquisição e estabilização de um património genético que conduz ao desenvolvimento de resistência de alto nível em micobactérias.

Contribuição para a caracterização dos mecanismos de Resistência aos antibióticos β-lactâmicos em estirpes de Haemophilus influenzae, isoladas em Portugal

Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Impregnação de fibras de celulose com nanopartículas de prata, óxido de zinco e óxido de cobre para aplicações anti-bacterianas

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia de Materiais

Avaliação de bacteriófagos com atividade antibacteriana em isolados provenientes de doentes com pneumonia associada ao ventilador

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Novas estratégias no combate à tuberculose: a NADH-MENAQUINONA desidrogenase do tipo II de Mycobacterium tuberculosis

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Microbiologia Médica

O papel de determinantes plasmídicos na resistência a compostos antimicrobianos em Staphylococcus aureus

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Microbiologia médica

Caracterização de estirpes de Streptococcus agalactiae provenientes de colonização de tratos genitourinário e gastrointestinal da mulher grávida

Streptococcus agalactiae, ou Streptococcus do grupo B, é actualmente, o principal responsável pelo desenvolvimento de infecção neonatal, seja de início precoce (nos primeiros 7 dias de vida) ou tardio (entre os 7 dias e os 3 meses de vida). O principal factor de risco ao desenvolvimento de doença neonatal precoce é a colonização rectovaginal da mulher grávida. No presente estudo foram caracterizados 179 isolados provenientes de colonização dos tratos genitourinário e gastrointestinal da mulher grávida, obtidos no Hospital Garcia de Orta (Almada) entre 2007 e 2010. A colonização vaginal da mulher grávida neste período foi de 12%, e os serótipos mais prevalententemente detectados foram os serótipos Ia, V, IV, II e III, o que está de acordo com outros estudos efectuados em Portugal, à excepção do serótipo IV que tem sido pouco detectado na Europa. Todos os isolados se revelaram susceptíveis à penicilina, ofloxacina e vancomicina e, apenas 11.8% se revelaram susceptíveis a todos os antibióticos testados. A resistência à tetraciclina, eritromicina e clindamicina, de 2007 a 2010, foi de 86.8%, 14.6% e 9.7%, respectivamente. Não foi encontrado nenhum fenótipo de resistência à eritromicina dominante. Neste estudo o serótipo capsular mais associado à resistência à eritromicina foi o serótipo Ia, seguido pelos serótipos III, V e II. Verificou-se a presença de uma associação entre o serótipo Ia, o fenótipo M e a presença do gene mef(A). Os isolados com fenótipo cMLSB apresentaram o gene erm(B) e o gene erm(A) [erm(TR)] foi detectado em todos os isolados de fenótipo iMLSB, em ambos os casos com diversos serótipos. Os isolados pertencentes à mesma grávida foram considerados geneticamente relacionados com base na técnica de PFGE, excepto em dois casos em que as duas mulheres grávidas aparentemente estavam colonizadas por mais do que uma estirpe. Observou-se uma grande heterogeneidade populacional entre os isolados caracterizados. Relativamente à resistência aos macrólidos, a origem foi multiclonal e não derivada da disseminação de um único clone. Mais estudos epidemiológicos longitudinais são necessários para complementar os já existentes e, conhecer a evolução das estirpes de S. agalactiae em circulação, não só a nível nacional, mas em todo o mundo. Desta forma será possível definir a melhor estratégia para a criação de uma vacina adequada à variabilidade populacional de S. agalactiae.

Tipagem molecular de isolados clínicos e ambientais do complexo de espécies de Cryptococcus neoformans através do gene fosfolipase B(PLB1) e avaliação da susceptibilidade antifúngica

Cryptococcus neoformans é uma levedura encapsulada, presente em animais e humanos, que infecta tanto indivíduos imunocomprometidos como imunocompetentes. A criptococose é uma causa significativa de morbilidade e mortalidade em todo o mundo, sendo a meningoencefalite o sinal mais frequente da doença. Duas espécies estão incluídas no complexo de Cryptococcus neoformans: C. gattii (serotipos B e C) e C. neoformans. Por sua vez, C. neoformans é dividido em duas grandes variedades - var. grubii (serotipo A) e var. neoformans (serotipo D) –, além de incluir estirpes híbridas (serotipo AD). A técnica de RFLP tem sido usada para identificar facilmente os tipos moleculares dos isolados em estudos epidemiológicos. Oito tipos foram descritos: VNI, VNII (ambos correspondentes a estirpes C. neoformans var. grubii), VNIII (estirpes híbridas AD), VNIV (C. neoformans var. neoformans), e VGI-IV (correspondentes a C. gattii). Este trabalho teve como objectivo, caracterizar geneticamente uma colecção de isolados clínicos e ambientais, portugueses e estrangeiros, e avaliar a sua resistência a duas drogas antifúngicas, permitindo comparar os padrões epidemiológicos do complexo de espécies com os encontrados noutras regiões do mundo. A colecção possui 337 isolados de C. neoformans, provenientes de diversos hospitais e regiões, previamente identificados por métodos convencionais de diagnóstico. A determinação dos tipos moleculares foi realizada através do método de RFLP no gene PLB1. Dos 267 isolados analisados, o tipo mais abundante foi VN I (61,42%), seguido por VN III (24,34%). Menos abundantes foram VN IV (10,11%) e VN II (3%), enquanto que VG I foi raro (1,12%). Os restantes tipos moleculares de C. gattii não foram encontrados. Usando o método de difusão em disco, 98 destes isolados foram analisados quanto à susceptibilidade antifúngica. Foi registada resistência ao voriconazol em apenas 3,1% dos isolados testados. Foi encontrada resistência ao fluconazol num elevado número de isolados (32,7%) e susceptibilidade dependendo da dose em 15,3%. Este trabalho, também teve o intuito de correlacionar os resultados anteriores com o tipo molecular. Todavia não foi encontrada diferença estatisticamente significativa entre qualquer dos tipos moleculares e as CMIs correspondentes ao fluconazol. Porém, os resultados mostram que alguns tipos moleculares são menos susceptíveis do que outros em relação ao voriconazol: VN I e VN IV são mais resistentes do que VN II, e VN I e VN II são mais susceptíveis que VN III. Concluindo, a elevada frequência de VN I está de acordo com resultados obtidos em outros estudos em países Europeus e Sul-Americanos. É notável a abundância de VN III em Portugal, tal como relatado noutros países do Sul da Europa, mas também no Chile, contrariamente a outras regiões do globo. A elevada resistência ao fluconazol é compatível com os resultados documentados em estudos anteriores. Esta investigação é um importante passo na epidemiologia da criptococose e da ocorrência de C. neoformans em Portugal.

Estudo molecular de estirpes de Aspergillus fumigatus isolados em aviários e em aves diagnosticadas com aspergilose. Possíveis implicações na Saúde Pública

Aspergillus fumigatus é um agente etiológico fúngico disperso mundialmente por variados nichos ecológicos e o fungo patogénico que mais promove doenças respiratórias em aves e pessoas imunocomprometidas. A exposição a conídios deste fungo pode causar aspergilose invasiva, a doença mais frequente em variadas espécies ornitológicas, com elevada mortalidade e morbidade. Além disso, esta doença é um dos fatores que mais contribui para significativas perdas económicas na indústria avícola, bem como perdas de biodiversidade, em espécies selvagens. Neste contexto, Aspergillus fumigatus, que pertence ao complexo Fumigati, desenvolve-se facilmente no trato respiratório de aves e humanos, no solo, nas camas e ninhos das aves. Tem uma fácil aerolização e contamina os alimentos nos ambientes avícolas e produz uma micotoxina, gliotoxina, que invade o trato respiratório e é considerada como fator de virulência. A identificação exacta dos isolados fúngicos provenientes de aves é muito importante, para percepção da sua epidemiologia em aves, para pesquisa de espécies crípticas de Aspergillus fumigatus, que podem desencadear as mesmas patologias mas apresentar diferentes resultados às mesmas terapêuticas antifúngicas. A análise molecular efectuada neste estudo permitiu atingir estes objectivos. Como tal, 108 isolados provenientes de diversificadas aves foram analisados por ferramentas moleculares para determinar a presença de espécies crípticas de Aspergillus fumigatus e observar os seus diferentes perfis de susceptibilidade antifúngica ao itraconazol. Não foram detectadas espécies crípticas, mas foi possível corrigir duas identificações morfológicas erradas ao nível do complexo. Apesar da emergência da resistência adquirida por Aspergillus fumigatus ao itraconazol, estar a emergir, não foram detectadas estirpes resistentes neste estudo. O conhecimento molecular deste agente etiológico responsável pela aspergilose invasiva em aves é importante para auxiliar a escolha de uma melhor terapêutica e futuros tratamentos para infeções oportunistas fúngicas, contribuindo assim para menos perdas na produção avícola e para uma melhoria da Saúde Pública.

Funcionalização de fibras de celulose em papel com nanopartículas: aplicação como bactericida

As doenças infecciosas emergentes e o desenvolvimento de resistência aos antibióticos, por parte das bactérias patogénicas e fungos, a um ritmo alarmante são uma questão de extrema preocupação. Apesar do aumento do conhecimento da patogénese microbiana e aplicação de terapias modernas, a taxa de mortalidade associada a infecções microbianas ainda permanece alta. Muitas destas infecções têm origem nos alimentos e água que ingerimos. Torna-se, portanto, urgente procurar novas estratégias e encontrar novos agentes antimicrobianos, a partir de substâncias naturais e inorgânicas para desenvolver novos fármacos ou agentes para controlar as infecções microbianas. É aqui, que a nanotecnologia entra em acção com o conceito de embalagem activa. Esta beneficia do uso de nanopartículas para aumentar a segurança e a qualidade de um produto pois estas possuem actividade antimicrobiana. A maioria das embalagens é feita de papel, que possui óptimas propriedades e características (baixo custo, porosidade e biodegrabilidade), tornando-se um substrato cobiçado em diversas áreas de investigação. Neste trabalho, uniu-se as vantagens do papel com as propriedades antimicrobianas das nanopartículas. Assim, impregnaram-se diferentes substratos de papel com nanopartículas, com o objectivo de testar qual o que apresenta maior actividade antibacteriana. Para tal utilizou-se o cartão, o saco de refeições de take-away, papel de mesa e papel de talheres, os quais foram impregnados com nanopartículas de prata, cobre, óxido de zinco e óxido de tungsténio, com concentrações variadas. Estas nanopartículas foram testadas em cinco bactérias diferentes: Staphylococcus aureus (ATCC6538), Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) (RN4220) e Enterococcus faecalis (ATCC29212), Escherichia coli (ATCC8739) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC9027) e numa levedura Candida albicans (ATCC10231). Dos testes anti-bacterianos realizados, concluiu-se que os melhores resultados foram obtidos para o cartão com AgNPs. Utilizando o cartão como substrato e as nanopartículas de prata como agente anti-bacteriano, estudou-se a influência da concentração de AgNPs (2, 10, 25 e 50mM). A concentração de 50mM revelou-se mais eficaz, em especial para a bactéria Pseudomonas aeruginosa (ATCC9027).

Deteção de Neisseria gonorrhoeae em amostras de urina de utentes de uma consulta de venereologia

Introdução: A vigilância epidemiológica dos agentes infeciosos é fundamental como atividade de controlo das doenças sexualmente transmissíveis. A gonorreia é uma das infeções sexualmente transmissíveis (IST) mais comum e é causada pela bactéria Neisseria gonorrhoeae. Os dados sobre os diferentes microrganismos causadores de IST são escassos em Portugal e a vigilância tradicional não é suficiente. Em muitos casos de infeção por N. gonorrhoeae, os pacientes são tratados empiricamente através de uma abordagem sindromática por vezes sem recurso a análises laboratoriais que confirmem a infeção e, além disso, existem os casos assintomáticos que contribuem para a contínua propagação da infeção por N. gonorrhoeae. A gonorreia é tratável e curável mas não está disponível uma vacina. Consequentemente, o controlo desta doença depende da identificação e tratamento de indivíduos infetados e dos seus contactos na rede de transmissão. Por outro lado, quando é efetuada cultura os resultados apresentam ocasionalmente falsos negativos, devido às características exigentes de crescimento da N. gonorrhoeae in vitro ou à automedicação prévia do doente. Objetivos: Avaliar a ocorrência de infeções por Neisseria gonorrhoeae entre utentes de uma consulta de venereologia, nos primeiros seis meses de 2011. Métodos: Estudo transversal. Amostragem consecutiva, cálculo do número de amostras pela fórmula de Wald para um nível de confiança de 95% e um erro de previsão de 3,3%. Foram analisadas 145 amostras de urina utilizando técnicas de amplificação de ácidos nucleicos com alvos diferentes. A identificação de Neisseria gonorrhoeae foi efetuada pela deteção de uma sequência do pseudogene porA de N. gonorrhoeae por técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real e pela deteção de uma sequência do gene ccpB de N. gonorrhoeae por técnica de PCR. Critérios de exclusão: recusa em participar ou apresentar problemas para o entendimento do consentimento livre e informado. Resultados: Foi detetada Neisseria gonorrhoeae em 8 doentes – 5,5 % de prevalência global. A prevalência entre indivíduos com infeção sexualmente transmissível prévia (n = 35) foi significativamente mais elevada (p = 0,032). Neste grupo detetou-se N. gonorrhoeae em 4 doentes (11,43 %). Em doentes com queixas de exsudado uretral (n = 29), foi detetada N. gonorrhoeae em seis (20,69 %), demonstrando que a prevalência entre os indivíduos com este sintoma é, também, significativamente mais elevada (p = 0,001). A coinfecção com Clamydia trachomatis foi observada em 1,4 % dos casos (2/145). A percentagem de casos assintomáticos foi de 12,5 % (1/8). As técnicas de PCR utilizadas neste estudo demonstraram-se igualmente especificas para a deteção de N. gonorrhoeae e ambas mais sensíveis relativamente à cultura. Neste estudo as estirpes isoladas em cultura apresentaram resistência a penicilina em 25 % dos casos, 37,5 % a tetraciclinas e 12,5 % eram produtoras de β-lactamases. Conclusões: A prevalência determinada neste estudo encontra-se superior ao esperado. Os resultados deste estudo indicam a existência de um importante problema de saúde pública e a necessidade de considerar a implementação de rastreios em grupos específicos de população. Este estudo confirma que as técnicas de PCR com os alvos porA e ccpB são satisfatórias para a deteção de Neisseria gonorrhoeae em amostras de urina. Apesar da percentagem de estirpes resistentes a tetraciclinas e penicilina ser elevada não foram demonstradas resistências a fluoroquinolonas ou cefalosporinas nas estirpes estudadas.

Tipagem molecular de isolados clínicos e ambientais do complexo de espécies de Cryptococcus neoformans através do gene da fosfolipase B (PLB1) e avaliação da susceptibilidade antifúngica

Cryptococcus neoformans é uma levedura encapsulada, presente em animais e humanos, que infecta tanto indivíduos imunocomprometidos como imunocompetentes. A criptococose é uma causa significativa de morbilidade e mortalidade em todo o mundo, sendo a meningoencefalite o sinal mais frequente da doença. Duas espécies estão incluídas no complexo de Cryptococcus neoformans: C. gattii (serotipos B e C) e C. neoformans. Por sua vez, C. neoformans é dividido em duas grandes variedades - var. grubii (serotipo A) e var. neoformans (serotipo D) –, além de incluir estirpes híbridas (serotipo AD). A técnica de RFLP tem sido usada para identificar facilmente os tipos moleculares dos isolados em estudos epidemiológicos. Oito tipos foram descritos: VNI, VNII (ambos correspondentes a estirpes C. neoformans var. grubii), VNIII (estirpes híbridas AD), VNIV (C. neoformans var. neoformans), e VGI-IV (correspondentes a C. gattii). Este trabalho teve como objectivo, caracterizar geneticamente uma colecção de isolados clínicos e ambientais, portugueses e estrangeiros, e avaliar a sua resistência a duas drogas antifúngicas, permitindo comparar os padrões epidemiológicos do complexo de espécies com os encontrados noutras regiões do mundo. A colecção possui 337 isolados de C. neoformans, provenientes de diversos hospitais e regiões, previamente identificados por métodos convencionais de diagnóstico. A determinação dos tipos moleculares foi realizada através do método de RFLP no gene PLB1. Dos 267 isolados analisados, o tipo mais abundante foi VN I (61,42%), seguido por VN III (24,34%). Menos abundantes foram VN IV (10,11%) e VN II (3%), enquanto que VG I foi raro (1,12%). Os restantes tipos moleculares de C. gattii não foram encontrados. Usando o método de difusão em disco, 98 destes isolados foram analisados quanto à susceptibilidade antifúngica. Foi registada resistência ao voriconazol em apenas 3,1% dos isolados testados. Foi encontrada resistência ao fluconazol num elevado número de isolados (32,7%) e susceptibilidade dependendo da dose em 15,3%. Este trabalho, também teve o intuito de correlacionar os resultados anteriores com o tipo molecular. Todavia não foi encontrada diferença estatisticamente significativa entre qualquer dos tipos moleculares e as CMIs correspondentes ao fluconazol. Porém, os resultados mostram que alguns tipos moleculares são menos susceptíveis do que outros em relação ao voriconazol: VN I e VN IV são mais resistentes do que VN II, e VN I e VN II são mais susceptíveis que VN III. Concluindo, a elevada frequência de VN I está de acordo com resultados obtidos em outros estudos em países Europeus e Sul-Americanos. É notável a abundância de VN III em Portugal, tal como relatado noutros países do Sul da Europa, mas também no Chile, contrariamente a outras regiões do globo. A elevada resistência ao fluconazol é compatível com os resultados documentados em estudos anteriores. Esta investigação é um importante passo na epidemiologia da criptococose e da ocorrência de C. neoformans em Portugal.

Identificação de biomarcadores de prognóstico e marcadores preditivos de resposta à terapia no cancro do cólon e recto

Mais de 50% dos novos casos de cancro do cólon e recto (CCR) diagnosticados desenvolvem metástases, as quais apresentam uma elevada resistência às terapias convencionais, tornando o CCR uma das principais causas de morte por cancro. Por estas razões, é necessário identificar biomarcadores moleculares de prognóstico e preditivos da resposta ao tratamento. A maioria dos tumores colorectais apresentam mutações em genes que codificam para componentes da via de sinalização WNT. O presente trabalho teve como objectivo estudar o papel de mutações específicas no gene TCF7L2, um importante factor de transcrição desta via, como potenciais factores de prognóstico no cancro do cólon e recto e avaliar a presença de alterações (epi)genéticas e a sua relação com a resposta à quimioradioterapia pré-operatória no cancro do recto, de modo a identificar marcadores preditivos de resposta ao tratamento. Foi efectuada a análise de mutações em exões específicos do TCF7L2 em 68 amostras de CCR, por DGGE, Genescan e sequenciação automática. Foi realizada a análise de perda de heterozigotia por Genescan e de copy-number e metilação por MS-MLPA, para o mesmo gene, em 16 tumores do recto. Foram confirmados alguns destes resultados, ao nível do DNA e RNA, por qPCR. Foram detectadas mutações no gene TCF7L2 em 7/68 (10%) CCR, as quais foram menos frequentes em tumores sem instabilidade de microssatélites (MSS) do que em tumores instáveis (5/56, 11% vs 8/12, 67%). Na maioria dos tumores do recto resistentes à terapia foram detectados ganhos da região upstream e 5´do gene, os quais foram mais frequentes do que em tumores sensíveis (4/6 vs 1/8, p=0,063). Os tumores do recto que responderam melhor à quimioradioterapia apresentaram mais frequentemente ganhos na região 3’ do gene. Em conclusão, as mutações no gene TCF7L2 são pouco frequentes em tumores estáveis, sendo necessário mais estudos para avaliar relação com o prognóstico. As alterações de copy number poderão ser potenciais marcadores de resposta à quimioradioterapia pré-operatória no recto, no entanto os resultados ainda são preliminares, sendo necessária a análise de um maior número de casos.