Contribuição para a caracterização dos mecanismos de Resistência aos antibióticos β-lactâmicos em estirpes de Haemophilus influenzae, isoladas em Portugal

Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

A gravidade das infecções a Haemophilus influenzae e a necessidade de se actuar com rapidez têm levado ao estabelecimento de uma terapia antimicrobiana empírica. No entanto, a emergência de estirpes resistentes como resultado da pressão selectiva é, hoje em dia, uma realidade preocupante. Nesta espécie, a resistência a alguns β-lactâmicos, como é o caso da ampicilina, é essencialmente caracterizada por dois mecanismos: a produção de enzima β-lactamase e a presença de proteínas de ligação à penicilina (PBPs) alteradas. Com o objectivo de caracterizar o mecanismo de resistência a estes antibióticos no nosso país, foi escolhida uma amostra de 240 estirpes clínicas de H. influenzae, de acordo com a concentração inibitória mínima (CIM) à ampicilina. Assim, estudámos 100 estirpes com CIM à ampicilina entre 1 e 8 μg/ml, 80 estirpes com CIM >8 μg/ml e ainda um grupo controlo de 60 estirpes susceptíveis com CIM entre 0,12 e 0,5 μg/ml. A sequência do gene ftsI, que codifica o domínio da transpeptidase da PBP3, foi determinada para todas as estirpes. Das 240 estirpes, 141 apresentavam mutações perto das zonas conservadas do gene ftsI originando 31 padrões mutacionais. A análise dos padrões mutacionais permitiu classificar a maioria destas estirpes(96,5%) no grupo mutacional II (Ubukata et al, 2001) caracterizado pela substituição Asn526Lys. Para além da substituição referida (Asn526Lys) foram ainda caracterizadas com maior frequência as substituições Val547Ile (88%) e Asn569Ser (73%). A relação entre as mutações encontradas e o nível de susceptibilidade à ampicilina permitiu observar que 27,5% das estirpes eram susceptíveis, 13,8% eram resistentes por produção de β-lactamase (BLPAR), 39,1% era resistente sem produção de β-lactamase (BLNAR) e 19,6% apresentavam ambos os mecanismos de resistência (BLPACR). Apesar de o CLSI categorizar como susceptíveis as estirpes com CIM de 1 μg/ml e como intermédias as de 2 μg/ml, 97,3% destas estirpes apresentavam mutações junto das zonas conservadas do domínio da transpeptidase no gene ftsI, indicando a existência do mecanismo de resistência não enzimático. Utilizando a técnica de pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), que analisa a diversidade genética das estirpes, verificámos a existência de uma elevada diversidade entre as estirpes BLNAR. Pelo contrário, as estirpes BLPACR estão, na maior parte dos casos, geneticamente relacionadas entre si. Estudos desta natureza são importantes para a definição de novos breakpoints para os antibióticos β-lactâmicos, em H. influenzae. Poderiam, assim, ser evitadas muitas falências terapêuticas o que representaria elevados ganhos em Saúde Pública.