170 resultados para SDS - PAGE


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用蔗糖密度梯度超速离心的方法从单细胞红藻---紫球藻(Porphyridium cruentum)中分离纯化了完整的藻胆体。光谱分析表明,藻胆体在可见光区域有四个吸收峰(545nm, 565nm, 618nm 和 650nm)和一个吸收肩(498nm);荧光发射峰分别在680nm和595nm,二者的比值(λ_(680nm)~(em)/λ_(595nm)~(em))可高达10以上,说明分离的藻胆体非常完整。非变性电泳结果显示,分离的藻胆体至少有三种颜色的条带,分别为:B-PE,R-PC和b-PE,APC可能含量很少而未见到。SDSPAGE电泳鉴定至少有三条明显的带,为PE的α和β的重叠带,γ亚基和RPC的亚基。用羟基磷灰石层析和Sephadex G-200层析的方法分离到了高纯度的B-藻红蛋白、b-藻红蛋白和较纯的R-藻蓝蛋白。光谱检验发现,分离得到的藻胆蛋白均为天然态,其中藻红蛋白的荧光发射峰在580nm左右,藻蓝蛋白的荧光发射峰在640nm左右。SDSPAGE电泳分析,B-藻红蛋白有两条带,分子量大约在20kD,31kD。小分子量的条带极宽,是因为α和β亚基的分子量相近,所以有重叠;大分子量的条带是γ亚基。相对应的是b-藻红蛋白只有20kD的条带,无γ亚基的条带。藻蓝蛋白有两条明显的条带,大约为16kD和20kD。用戊二醛共价交连的方法得了紫球藻B-藻红蛋白和R-藻蓝蛋白和共价结合体。吸收光谱表明,交联体和对照最明显的区别是紫外光区278nm的峰高增加并且蓝移到268nm;交联体的荧光发射光谱与对照相比,498nm激发产生的峰值在588nm(游离的PE的发射峰)和650nm(交联体中PC的发射峰),而对照只有590nm的发射峰,并且交联体在588nm的峰高明显低于对照。非变性电泳鉴定,发现有与对照不同的新的条带出现。这一切证明藻胆蛋白能量传递模型共价交联成功。人工构建的交联物和天然的藻胆体相比,对低离子强度和低温(4 ℃)更为稳定,但能量传递效率相对较低。

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该研究通过蔗糖密度梯度离心分离纯化WSSV-中国株,在电镜观察下观察到不同病毒组分的大小、形态及负染后显示的精细结构;通过SDS-PAGE鉴定在囊膜组分、完整病毒粒子组分中的VP28蛋白.设计一对特异性PCR扩增引物.PCR法从WSSV-中国株基因组DNA中扩增得到vp28基因片段640bp,并在起始密码子ATG前,填加了适合于蓝藻表达系统高效表达的SD序列.进一步将vp28基因正向连接到海藻穿梭表达载体pRL-489上的启动子PpsbA下游,酶切鉴定连接正确.通过PCR扩增在DNA水平上验证vp28基因在两种鱼腥藻Anabaenasp.PCC7120中均以质粒形式存在,在聚球藻Synechococcussp.PCC7002中以整合形式存在于染色体DNA上.用制备的抗WSSV的抗血清,通过WesternBlotting在蛋白水平上证明vp28基因在两种鱼腥藻Anabaenasp.PCC7120中均得到了表达,分子量为28kD.该论文的研究目的是通过基因工程获得WSSV囊膜蛋白VP28的转基因蓝藻,期望有助于揭示WSSV感染对虾的分子机一,确定VP28的功能.

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选择条斑紫菜(Porphyra yezoensis)两个不同发育阶段(孢子体和配子体)作为研究对象,分别从孢子体与配子体的类囊体膜上分离到具有高放氧活性的PSII复合物。配子体PSII复合物的放氧活性为2269.77±152.94 μmolO2/chl(mg).h,孢子体PSII复合物的放氧活性为2256.33±141.81 μmolO2/chl(mg).h。对分离到的PSII复合物的稳定性和放氧活性进行了研究,结果表明:孢子体和配子体的PSII复合物,在4℃条件下保存比-80℃下放氧活性高,稳定性高。配子体跟孢子体比较,在-80℃保存条件下第六天就已经没有放氧活性,而此时-80℃下孢子体PSII复合物仍然具有放氧活性。同时对4℃下保存的PSII复合物进行分子筛柱层析,室温吸收光谱测定以及放氧活性测定,发现随着放氧活性逐渐降低的同时,蛋白大分子有聚合现象。室温吸收光谱表明经过长期的保存,吸收峰向短波长方向偏移,同时叶绿素易降解成为脱镁叶绿素。分别测定了配子体与孢子体PSII复合物的SDS-PAGE电泳蛋白条带的氨基酸序列,配子体PSII复合物经过SDS-PAGE电泳后的蛋白条带,经过质谱测定,鉴定出CP-47、D2、D1蛋白。孢子体PSII复合物,经过SDS-PAGE电泳后的蛋白条带,经过质谱分析鉴定出CP-47、CP-43、D2、D1蛋白。CP-47, CP-43蛋为PSII反应中心叶绿素P680的脱辅基蛋白,D1 与D2蛋白为PSII的反应中心蛋白。对纯化的PSII复合物,并首次采用单颗粒技术分析比较其形态结构,电镜观察证实纯化的PSII复合物为二聚体,颗粒大小约为13nm×7.8nm,经过计算总分子量约为500kDa,但是孢子体与配子体的PSII复合物在形态上有轻微差别,配子PSII复合物要略宽于孢子体复合物,孢子体PSII复合物周边棱角形较配子体明显。

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恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病,目前的抗肿瘤药物虽然具有一定疗效,但存在选择性差、毒副作用大等缺点,药物治疗期待着新的突破。因此,寻找高效低毒的抗肿瘤药物已经成为当前肿瘤研究的重要内容。传统抗肿瘤天然药物的来源局限在陆地,近年来在海洋来源的具有抗肿瘤活性物质的开发上取得了很多成果,获得了多种高活性、毒副作用小、作用机制新颖的活性化合物,为新型抗肿瘤药物的研发提供了新思路。 本研究采用硫酸铵分级沉淀、弱阳离子交换层析、疏水层析、强阴离子交换层析等分离技术,结合MTT活性追踪方法,从海洋软体动物文蛤体液中纯化得到单一蛋白组份MML,SDS-PAGE检测其分子量约为40kD。该蛋白在体外具有显著的抗人肝癌细胞BEL-7402的活性,其IC50达到52µg/mL。相差显微镜下观察发现,MML起效较快,细胞处理半小时后,形态开始发生改变,细胞膜逐渐与胞内物质分离,最终形成明显的空泡状结构。 为进一步研究MML的作用方式,分别从细胞膜毒性、细胞周期阻滞及诱导肿瘤细胞凋亡的角度开展了相关研究。在细胞膜毒性方面,采用扫描电镜观察、Hoechst33342/ PI双染色和乳酸脱氢酶漏出率检测的方法,初步证明了MML对BEL-7402具有细胞膜毒性。结合流式细胞仪、微管蛋白免疫荧光检测技术,研究了MML作用后的细胞周期及微管蛋白的变化情况,结果发现MML的抗肿瘤作用方式可能是通过改变肿瘤细胞膜通透性,进而破坏微管蛋白聚合、阻滞细胞周期,产生抑制肿瘤细胞增殖的活性。DNA Ladder琼脂糖凝胶电泳分析发现,MML作用后的细胞出现一定程度的凋亡,这种凋亡现象的产生是由于MML的直接诱导,还是间接作用产生,尚有待于深入研究。

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以血管生成为靶点的抗肿瘤策略是抗肿瘤领域的研究热点,目前已经发现许多天然和化学合成的抗血管生成药物。鲨鱼软骨作为抗新生血管生成因子的重要来源的研究已有20多年的历史,很多研究显示鲨鱼软骨提取物有抗血管生成活性。但鲨鱼软骨活性多肽的完整分子结构一直未见报道;鲨鱼软骨活性多肽干扰血管生成通路的信号途径尚不明确。 本文应用盐酸胍抽提、丙酮分级沉淀、超滤、凝胶层析等分离技术,从青鲨(Prionace glauca)软骨中分离纯化并鉴定了一种新的具有抗新生血管生成活性的多肽。经SDS-PAGE和N-末端氨基酸序列分析显示,该多肽分子量为15500 Da,采用蛋白数据库分析表明该多肽是一种新发现的鲨鱼软骨多肽(Polypeptide from Prionace glauca,PG155)。 体外实验显示,PG155抑制内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)介导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell ,HUVEC)迁移和管腔形成,并呈剂量依赖关系。200 μg/ml PG155对牛主动脉内皮细胞(Bovine Aortic Endothelial Cells,BAECs)和HUVECs及以下癌细胞,包括人肝癌细胞(human hepatoma Bel-7402 cells,Bel-7402)、 口腔上皮癌细胞(human oral epidermoid carcinoma KB cells ,KB)、人结肠癌细胞(human colon cancer HCT-18 cells,HCT-18)和人乳腺癌细胞(human breast MCF7 cancer cells ,MCF7)的增殖均无抑制作用,说明PG155无细胞毒作用。20 μg/ml PG155显著抑制HUVEC的迁移和管腔形成;40-80 μg/ml PG155 对VEGF 介导的HUVEC的迁移和管腔形成几乎完全抑制。 体内实验显示,PG155显著抑制斑马鱼胚胎模型新生血管生成,并呈剂量依赖关系。形态学观察表明PG155显著抑制斑马鱼胚胎肠下静脉(subintestinal vessels, SIVs)的生长,随着浓度的升高SIVs的生长可受到完全抑制。碱性磷酸酶染色分析显示,在一定浓度范围内,PG155随着浓度的升高对斑马鱼胚胎整体血管生成抑制作用依次增强。160 μg/ml PG155会引起斑马鱼胚胎心脏功能障碍。 由海洋生物中发现新的肿瘤新生血管生成抑制剂国内外的报道较少,我们的工作表明鲨鱼软骨可作为血管生成抑制剂的重要来源,鲨鱼软骨活性多肽PG155由于具有极低的细胞毒作用,并能抑制VEGF介导的血管生成过程,有希望成为一类新型抗肿瘤药物。

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热休克蛋白70是热休克蛋白家族中重要的成员,参与新生蛋白的折叠、转运、重折叠变性蛋白、协助降解变性蛋白和抗逆环境胁迫等功能。海带和裙带菜是浅海潮下带典型的褐藻,孔石莼和浒苔是潮间带典型的绿藻,四种大型海藻均有重要的经济价值和生态价值。随着潮汐变化固着藻类生境理化因素变化剧烈,藻类面临着严重的环境胁迫,因此研究藻类抗逆机理有着重要的意义。 本研究采用同源克隆法配合RACE-PCR,克隆了海带、孔石莼、裙带菜和浒苔HSP70基因的全序列(分别命名为LJHSP70、UPHSP70、QDHSP70和EPHSP70)。利用生物信息学方法分析了四种藻类HSP70结构特征、同源性关系和进化地位。获得的海带HSP70基因全序列长为2918 bp,5’非翻译区为248 bp,3’非翻译区为696 bp,开放阅读框为1974 bp,编码657个氨基酸,预测的分子量为72.03 kDa,等电点为4.97。获得的裙带菜HSP70基因全序列长为3243 bp,5’非翻译区为248 bp,3’非翻译区为1021 bp,开放阅读框为1974 bp,编码657个氨基酸,预测的分子量为72.03 kDa,等电点为4.96。获得的孔石莼HSP70基因全序列长为2283 bp,5’非翻译区为65 bp,3’非翻译区为247 bp,开放阅读框为1971 bp,编码656个氨基酸,预测的分子量为71.13 kDa,等电点为5.04。获得的浒苔HSP70基因全序列长为2265 bp,5’非翻译区为65 bp,3’非翻译区为217 bp,开放阅读框为1983 bp,编码660个氨基酸,预测的分子量为71.39 kDa,等电点为5.03。四种海藻HSP70氨基酸序列均含有四肽重复序列GGMP,具有三个典型的HSP70签名基序。细胞质定位的HSP70 C-末端特征基序为EEID或EEVD,并且N-端氨基酸序列保守性高于C-端。海带和裙带菜HSP70蛋白同源性为98%,孔石莼和浒苔HSP70蛋白同源性为96%,四种海藻HSP70蛋白序列与陆地植物和其他藻类HSP70蛋白序列同源性为70-80%。 利用荧光定量RT-PCR技术对不同胁迫条件处理的海带和孔石莼HSP70 mRNA的表达水平进行定量分析。不同热激温度(5-40 ℃)处理组中,30 ℃处理组的海带HSP70 mRNA表达量最高是10 ℃处理组的海带HSP70 mRNA表达量的3倍,而35 ℃或40 ℃处理组的海带HSP70表达量却低于25 ℃或30 ℃处理组的海带HSP70 mRNA表达量。25 ℃不同热激时间(0-12 h)处理组中,海带HSP70 mRNA表达量呈先上升后下降趋势。热激1 h后海带HSP70 mRNA表达量迅速上升,热激7 h后mRNA表达量达到最大,是对照组表达量的4倍。不同盐度(0‰-45‰)胁迫处理组中,0‰或5‰盐度处理组的海带HSP70 mRNA表达量是30‰盐度处理组海带HSP70 mRNA表达量的3倍。35‰、40‰和45‰盐度处理组之间HSP70 mRNA表达量较低且无显著差异。 不同热激温度(5-40℃)处理组中,20 ℃或25 ℃处理的孔石莼HSP70 mRNA表达量较低,而5 ℃、35 ℃、或40 ℃处理组的孔石莼HSP70 mRNA的表达量是25 ℃处理组孔石莼HSP70 mRNA表达量的2倍以上。30 ℃不同热激时间(0-12 h)处理组中,孔石莼HSP70 mRNA表达量也呈先上升后下降趋势。热激5 h后孔石莼HSP70 mRNA表达量达到最大,是对照组的3.5倍。不同盐度(0‰-45‰)胁迫处理组中,0‰或5‰盐度处理组的孔石莼HSP70 mRNA表达量是30‰盐度处理组孔石莼HSP70表达量的3倍。30‰、40‰和45‰盐度处理组孔石莼HSP70 mRNA表达量较低,且无显著差异。不同紫外线照射时间(0-4.0 h)和不同干燥时间(0-4.0 h)处理组中,孔石莼HSP70 mRNA表达量都在3 h后达到最高值,之后表达量维持在较高水平。 为进一步研究藻类HSP70的生物学功能,将海带HSP70基因的开放阅读框区域克隆到表达载体pEASY-E2中,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。将阳性重组子培养于含有AMP(100 U/mL)的LB培养基,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定。经5 h诱导,其表达量达到平台期,继续培养HSP70表达量并不显著增高。5 mM IPTG诱导海带HSP70蛋白表达量高于1 mM IPTG诱导蛋白表达量。

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The present work is the first report of the biochemical characterization of the venom from nematocysts of the jellyfish Rhopilema esculentum Kishinouye. The nematocysts were isolated by autolysis and centrifugation and separated by flow cytometry. Four types of nematocysts were identified: mastigophores, euryteles, and atrichous and holotrichous isorhiza. SDS-PAGE and amino acid analyses demonstrated that most of the proteins in the nematocyst extract were between 10 kDa and 40 kDa, and that glutamic acid was the main amino acid. A hemolytic activity assay showed that the activity of the nematocyst venom (RNV) was strongest in Tris-HCl buffer (50 mmol/L, pH 7.8, 5% glycerol, 0.5 mmol/L EDTA, 0.1 mol/L NaCl). The hemolytic activity was related to protein concentration and the HU50 against chicken erythrocytes was 0.91 A mu g/mL.

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应用SDS-PAGE技术依据HMW-GS组成型从来自全国10个省(区)、市的小麦品种(系)中筛选出20个,分为5组。准确提取各品种的高分子量谷蛋白,并将SDS-PAGE谱带用凝胶成像系统(Bio-imagingSystem)和Labworks5.0进行亚基定量分析,并进行了面团流变学特性测定,所得数据用SPSS14.0进行统计分析。结果表明,HMW-GS总表达量在各品种间的差异达到极显著水平,所有品种中各亚基的平均表达量10〉7〉5〉1〉8〉12〉2〉9;HMW-GS总表达量及HMW-GS占籽粒蛋白质含量的比例与面团形成时间、稳定时间和粉质评价值之间呈显著正相关;分组比较单个亚基对品质性状的影响表明,亚基1优于null,5+10优于2+12,7+8和7+9相当。研究发现不具有优质亚基组成、但HMW-GS表达量高的品种品质也较好,因此在小麦品质育种中,在注重HMW-GS组成筛选的同时,要注重保留HMW-GS表达量高的材料。

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选用全糯小麦品种‘糯麦1号’与青海主要栽培品种‘阿勃’杂交,综合利用改良碘染色法、SDS-PAGE法和Waxy基因的分子标记等,对杂交后代进行了鉴定筛选。最终从F2代鉴定出了5粒全糯种子,从F_代鉴定出8株Wx-B1亚基缺失的植株。对全糯株系F_3代的农艺性状进行评价,5个全糯株系的综合农艺性状都优于‘糯麦1号’,与‘阿勃’较接近。测定全糯株系和Wx-B1亚基缺失植株F_4代种子的直链淀粉含量,5个全糯株系F_4代种子的直链淀粉含量接近于0,8个Wx-B1亚基缺失植株F_4代种子的直链淀粉含量在总 体上比‘阿勃’的直链淀粉含量低。研究表明,采用综合标记辅助选择可快速而准确地获得适合在青海栽培的全糯和部分糯性小麦。

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为了改良青海省现有小麦主栽品种的品质性状,以青海省春小麦主栽品种青春533和高原602为轮回亲本,以具有1Dx5+1Dy10基因且综合性状良好的宁春4号为非轮回亲本,利用与1Dx5基因共分离的PCR分子标记对BC_1F_1、BC_2F_1和BC_3F_1植株进行目标基因检测;将筛选到的具有1Dx5基因的BC_3F_1植株进行自交,获得了BC_3F_2种子,利用SDS-PAGE电泳对BC_3F_2种子进行HMW-GS分析,分别从青春533×宁春4号和高原602×宁春4号的BC_3F_2中筛选出5粒和2粒具有纯合5+10亚基的种子,且中选植株的农艺性状基本接近轮回亲本。

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通过SDS-PAGE方法对33份青稞Ⅰ组和5份野生大麦H组染色体编码的高分子量谷蛋白亚基(HMW—GS)的多态性进行了研究。结果表明Ⅰ组和H组染色体编码的HMW-GS亚基之间存在带型差异,Ⅰ组高分子量谷蛋白亚基存在两种带型,一种接近7亚基上部,一种接近7亚基下部,H组内部只有一种带型,靠近10亚基。因此,要改进青稞的面筋品质现状,应在青稞中引入新的优质HMW—GS亚基的变异类型。

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为了有效地利用从国内其他地区引进的低蛋白弱筋种质材料,采用SDS-PAGE技术对63份材料进行了高分子量谷蛋白亚基组成的分析.结果表明,参试材料中共有14种HMW-GS类型,Glu-A1位点上有Null、1和2~*三种类型,以Null为主(52.4%);Glu-B1位点上有13+16、17+18、7、7+8、7+8+9和7+9六种类型,以7+8为主(55.6%);Glu-D1位点上有10、12、2+12、5+10、5+12五种类型,以2+12为主(61.9%),而5+10为27%.亚基组合类型共有22种,以"1,7+8,2+12"为主(22.2%).品质评分频率最高的是8分,为38.1%,其次为6分,为14.3%,5分的为9.5%,但品质评分为10分的也有5个材料,频率为7.9%.优质亚基含量等同或高于其他同类研究,品质评分也相对较高,这说明我国弱筋小麦的选择,需要加强对HMW-GS组成的分析.

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The x- and y-type high molecular weight (HMW) glutenin subunits are conserved seed storage proteins in wheat and related species. Here we describe investigations on the HMW glutenin subunits from several Pseudoroegneria accessions. The electrophoretic mobilities of the HMW glutenin subunits from Pd. stipifolia, Pd tauri and Pd strigosa were much faster than those of orthologous wheat subunits, indicating that their protein size may be smaller than that of wheat subunits. The coding sequence of the Glu-1St1 subunit (encoded by the Pseudoroegneria stipifolia accession PI325181) was isolated, and found to represent the native open reading frame (ORF) by in vitro expression. The deduced amino acid sequence of Glu-1St1 matched with that determined from the native subunit by mass spectrometric analysis. The domain organization in Glu-1St1 showed high similarity with that of typical HMW glutenin subunits. However, Glu-1St1 exhibited several distinct characteristics. First, the length of its repetitive domain was substantially smaller than that of conventional subunits, which explains its much faster electrophoretic mobility in SDS-PAGE. Second, although the N-terminal domain of Glu-1St1 resembled that of y-type subunit, its C-terminal domain was more similar to that of x-type subunit. Third, the N- and C-terminat domains of Glu-1St1 shared conserved features with those of barley D-hordein, but the repeat motifs and the organization of its repetitive domain were more similar to those of HMW glutenin subunits than to D-hordein. We conclude that Glu-1St1 is a novel variant of HMW glutenin subunits. The analysis of Glu-1St1 may provide new insight into the evolution of HMW glutenin subunits in Triticeae species. (C) 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved.

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Mature human interleukin-11 (HuIL-11) is a cytokine consisting of 178 amino acid residues that results from scission of the N-terminal signal peptide, consisting of 21 amino acid residaues, from the corresponding nascent polypeptide. A DNA fragment encoding a truncated HuIL-11 (trHuIL-11), with an additional 5 amino acid residues removed from the N-terminus, was cloned into vector pGEX-2T between the BamHI site and the EcoRI site. Upon transformation with Escherichia coli BL21, the construct over-produced a glutathione S-transferase (GST)-fused protein in a soluble form after IPTG induction. The fusion protein was initially fractionated with butyl-Sepharose 4 fast flow column and by affinity chromatography using a GSH-Sepharose 4B column. On-site enzymatic release with thrombin gave the target protein at 96% purity as judged by SDS-PAGE and HPLC. Expression of the interleukin as a GST-fused protein thus greatly improved downstream processing. Subsequent biological activity assay suggested that trHuIL-11 had similar activity profile to the naturally produced sample and may be a promising candidate for further development as biopharmaceutical.

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经sephadex G-75凝胶过滤、QAE-Sephadex A-50和CM-Sephadex C-25离子交换步骤,从湖南产尖吻蝮(Deinagkistrodon acutus)蛇毒中纯化出两个出血毒素,被命名为HaHT-1和HaHT-2。用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定呈单一的蛋白染色带。两个出血毒素的分子量相同,均为 23.5kDa。等电聚焦电泳测定它们的等电点分别为5.6和5.2。HaHT-1和HaHT-2均具有较强的出血活性(MHD分别为0.5和0.8μg),都有酪蛋白水解活力,无精氨酸酯酶、胆碱酯酶和磷脂酶A_2活力。用CD谱测定HaHT-l和HaHT-2的溶液构象,HaHT-1的α-螺旋、β-折叠和无规卷曲分别为36.9%、35.5%和27.6%,而HaHT-2的α-螺旋、β-折叠和无规卷曲分别为23.4%、31.3%和45.3%。pH的变化对它们构象有影响,在pH2-11范围内,酸性比碱性大。随着酸性或碱性的增加其α-螺旋含量减少,无规卷曲增加,β-折叠结构变化不大。