文蛤体液抗肿瘤蛋白的分离纯化与作用方式研究

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病，目前的抗肿瘤药物虽然具有一定疗效，但存在选择性差、毒副作用大等缺点，药物治疗期待着新的突破。因此，寻找高效低毒的抗肿瘤药物已经成为当前肿瘤研究的重要内容。传统抗肿瘤天然药物的来源局限在陆地，近年来在海洋来源的具有抗肿瘤活性物质的开发上取得了很多成果，获得了多种高活性、毒副作用小、作用机制新颖的活性化合物，为新型抗肿瘤药物的研发提供了新思路。 本研究采用硫酸铵分级沉淀、弱阳离子交换层析、疏水层析、强阴离子交换层析等分离技术，结合MTT活性追踪方法，从海洋软体动物文蛤体液中纯化得到单一蛋白组份MML，SDS-PAGE检测其分子量约为40kD。该蛋白在体外具有显著的抗人肝癌细胞BEL-7402的活性，其IC50达到52µg/mL。相差显微镜下观察发现，MML起效较快，细胞处理半小时后，形态开始发生改变，细胞膜逐渐与胞内物质分离，最终形成明显的空泡状结构。 为进一步研究MML的作用方式，分别从细胞膜毒性、细胞周期阻滞及诱导肿瘤细胞凋亡的角度开展了相关研究。在细胞膜毒性方面，采用扫描电镜观察、Hoechst33342/ PI双染色和乳酸脱氢酶漏出率检测的方法，初步证明了MML对BEL-7402具有细胞膜毒性。结合流式细胞仪、微管蛋白免疫荧光检测技术，研究了MML作用后的细胞周期及微管蛋白的变化情况，结果发现MML的抗肿瘤作用方式可能是通过改变肿瘤细胞膜通透性，进而破坏微管蛋白聚合、阻滞细胞周期，产生抑制肿瘤细胞增殖的活性。DNA Ladder琼脂糖凝胶电泳分析发现，MML作用后的细胞出现一定程度的凋亡，这种凋亡现象的产生是由于MML的直接诱导，还是间接作用产生，尚有待于深入研究。