Produção de plantas e metabólitos de Cleome dendroides Schult. & Schult. f. (Cleomaceae) utilizando diferentes sistemas de cultivo in vitro

Cleome dendroides é uma espécie endêmica da Mata Atlântica dos estados do Rio de Janeiro e Espírito Santo, bioma alterado por intensa atividade antrópica, o que constitui uma ameaça à preservação de suas populações. Não existem estudos dos pontos de vista fisiológico, biotecnológico, fitoquímico ou farmacológico sobre a espécie. Considerando-se o perfil fitoquímico e o potencial medicinal do gênero, torna-se relevante definirem-se protocolos para a produção de plantas e metabólitos de C. dendroides utilizando diferentes sistemas de cultivo in vitro. No presente trabalho, foram realizados estudos sobre a germinação in vivo da espécie, avaliando-se a influência do substrato, temperatura e luz. Não se observou qualquer tipo de dormência, sendo as temperaturas de 20, 25 e 20-30C, em areia ou vermiculita, apropriadas para a germinação in vivo. Definiu-se também uma metodologia eficiente de germinação sob condições in vitro, e as plântulas obtidas foram utilizadas como fonte de explantes para os estudos de propagação in vitro. A resposta morfogênica foi avaliada considerando-se a origem e tipo do explante, tipos e concentrações de reguladores de crescimento e número de subculturas. A metodologia empregada mostrou-se eficiente para a produção de brotos e manutenção de estoques de plantas in vitro que serviram como fonte de explantes. A melhor condição para a propagação in vitro foi definida em meio solidificado contendo BA, independentemente do tipo de explante e da origem. Os brotos obtidos foram alongados, enraizados e aclimatizados. Também foi estabelecida a cultura de raízes e a regeneração de brotos a partir destas culturas. Avaliou-se o efeito da origem do explante, assim como dos tipos e concentrações de fitorreguladores sobre a proliferação de raízes e a regeneração de brotos. O fitorregulador AIB propiciou maior multiplicação das raízes, enquanto BA mostrou-se eficiente na regeneração de brotos a partir das raízes recém-formadas. Foi estabelecido ainda um protocolo de cultura de calos e de suspensões celulares. Avaliou-se o efeito da origem e do tipo de explante, dos tipos e das concentrações de fitorreguladores sobre a calogênese. A combinação de PIC com KIN foi a mais eficiente para a indução de calos em explantes de plântulas obtidas a partir de germinação in vitro, produzindo calos que foram mantidos por pelo menos dois anos. As suspensões celulares também foram estabelecidas em meio contendo PIC + KIN, mantendo uma produção de biomassa de cerca de cinco vezes o peso fresco inicial por três sucessivas subculturas. Análises histoquímicas e fitoquímicas revelaram a presença de alcaloides nos calos e nas suspensões celulares. Foram realizadas análises fitoquímicas de plantas de campo, plantas aclimatizadas, plantas mantidas em estoque in vitro e culturas de raízes, as quais indicaram a presença de derivados de glicosinolatos. Os resultados demonstraram a viabilidade de produção de material vegetal de C. dendroides por meio de métodos biotecnológicos e a produção in vitro de metabólitos de importância medicinal

Avaliação do potencial antimalárico de Norantea brasiliensis Choisy (Marcgraviaceae) cultivada in vitro e in vivo

A malária é uma doença infecciosa causada por protozoários do gênero Plasmodium, transmitidos ao homem, principalmente, através da picada do mosquito infectado. O tratamento é realizado por meio do uso de drogas, como a cloroquina, uma vez que não há vacina eficiente contra a doença. Porém, a resistência dos parasitos aos medicamentos tem levado à busca por novas substâncias com atividade antimalárica, inclusive de origem vegetal. Nesse contexto, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a atividade antimalárica de extratos metanólicos de Norantea brasiliensis cultivada sob condições in vivo e in vitro, espécie nativa ocorrente em restingas, com potencial medicinal já comprovado para várias atividades. Foram desenvolvidos protocolos de calogênese e cultura de raízes da espécie visando à definição de um sistema de produção de metabólitos. Para a cultura in vitro, explantes foram inoculados em meio líquido e sólido contendo diferentes fitorreguladores e concentrações. A partir da cultura de tecidos, foram testados extratos do material produzido biotecnologicamente para comparação com o material botânico cultivado no campo. Os testes sobre o potencial antimalárico foram realizados in vivo, utilizando-se camundongos infectados pelo Plasmodium berghei ANKA, e in vitro utilizando o Plasmodium falciparum. Em seguida foram administrados a cloroquina e os extratos vegetais. A parasitemia foi observada seguindo os protocolos já estabelecidos pelo Laboratório de Imunofarmacologia do Instituto Oswaldo Cruz (IOC). Resultados mostraram que explantes foliares e caulinares de plantas germinadas in vitro, inoculados em meio sólido B5 suplementado com 2,0 mg.mL-1 de ANA, são as melhores fontes para a produção de raízes, apresentando maiores valores de peso fresco e peso seco, mostrando-se um sistema promissor para a produção in vitro de metabólitos da espécie. A avaliação da atividade antimalárica in vivo revelou seu potencial a partir de extrato de raízes de planta cultivada in vivo, na concentração de 50 mg/kg apresentando redução significativa da parasitemia quando comparada com o controle não tratado. Paralelamente, nos testes in vitro a concentração de 100 μg/kg do extrato de raízes de planta cultivada in vivo apresentou diferença significativa quando comparada com as outras concentrações testadas e o controle negativo. Além disso, há uma tendência de aumento do efeito inibitório conforme o aumento da concentração do extrato. Os resultados indicam o potencial de atividade antimalárica em raízes de N. brasiliensis, sendo este estudo o primeiro realizado para a espécie

Avaliação do potencial leishmanicida e antibacteriano de Annona mucosa (Jacq.) - Annonaceae cultivada in vitro e in vivo

A biodiversidade brasileira abrange plantas de importância medicinal que podem ser utilizadas na formulação de novos fármacos. Contudo, tem sido reduzida em velocidade alarmante, em função de diferentes ações antrópicas. A cultura de tecidos vegetais propicia a conservação e uso do germoplasma permitindo a obtenção de substâncias de importância medicinal. As leishmanioses são consideradas um problema de saúde pública mundial sendo a espécie Leishmania braziliensis de maior importância epidemiológica no Brasil. Recentemente tem-se registrado aumento da resistência à linha de tratamento usual. Do mesmo modo, o uso indiscriminado de antibióticos levou ao aumento de bactérias multirresistentes, que representam sério risco de infecção. A espécie Annona mucosa (Jacq.) possui substâncias, como acetogeninas e alcaloides, que apresentam atividades antiparasitária e antimicrobiana. Nesse sentido, o objetivo do trabalho foi avaliar o potencial leishmanicida e antibacteriano de extratos de A. mucosa de material produzido in vitro e in vivo. Foi proposto um protocolo de germinação in vitro, ainda não reportada para a espécie, com vistas à obtenção de plântulas axênicas. Em meio WPM foram cultivados explantes hipocotiledonares e foliares em meio MS, suplementados com PIC e diferentes concentrações de KIN, BAP ou TDZ. Os calos obtidos foram cultivados em meio líquido de mesma composição para a produção de suspensões celulares. Os materiais foram submetidos à extração metanólica e posterior fracionamento em hexano e diclorometano. Para a avaliação da atividade dos extratos sobre L. braziliensis foi usado o modelo in vitro, com a forma promastigota, e in vivo na forma amastigota, a partir do tratamento de macrófagos peritoneais de camundongos infectados com o parasito. Ambas as formas foram tratadas com os extratos por 96 e 48h, respectivamente. A atividade antimicrobiana foi avaliada por macrodiluição do extrato em Mueller-Hinton, sendo avaliado o crescimento das cepas após 16h de incubação a 48C. A germinação in vitro da espécie foi alcançada em substrato vermiculita estéril umedecido com solução de sais do meio MS, com taxa média de 85%. A maior produção de calos friáveis foi obtida em meios contendo KIN, com potencial uso para cultivo em suspensões celulares. Os extratos do material in situ e in vitro apresentaram atividade leishmanicida, apesar da toxicidade para macrófagos. Culturas de células em suspensão apresentaram potencial leishmanicida in vitro e redução da infecção em macrófagos. Os extratos do material avaliado apresentaram atividade antimicrobiana seletiva, com inibição do crescimento de Streptococcus pyogenes e Bacillus thurigiensis em diferentes concentrações avaliadas. Os métodos biotecnológicos empregados permitiram a obtenção de materiais com propriedades medicinais para as atividades leishmanicida e antibacteriana, assim como o material in vivo, constituindo este estudo o primeiro relato para as atividades propostas em A. mucosa.

Estabelecimento de culturas de raízes in vitro e avaliação da produção de metabólitos secundários de Cleome spinosa Jacq. (Cleomaceae)

Cleome spinosa é uma espécie herbácea de uso na medicina popular, especialmente no Nordeste do Brasil. A cultura in vitro de raízes adventícias da espécie foi iniciada com segmentos radiculares (0,5 e 1,0 cm) obtidos a partir de duas fontes de explantes: plantas propagadas in vitro e plantas oriundas do processo de germinação in vitro. Os explantes foram inoculados em meio MS líquido suplementado ou não com as auxinas ANA, AIA e AIB em diferentes concentrações (0,5; 1,0; 1,5; 3,0; 5,0 mg.L-1). As culturas foram mantidas em sala de crescimento, sob agitação (100 rpm) e sob fotoperíodo de 16h ou no escuro, com subculturas a cada 45 dias. Explantes oriundos de plantas propagadas in vitro também foram cultivados em meio contendo a citocinina BAP em associação com auxinas, na presença de sorbitol (isoladamente ou em associação com sacarose), em meio MS contendo redução na concentração total de sais minerais (MS1/2 e MS1/4) e em meio sólido. Os resultados mostraram que a adição de auxinas ao meio de cultura foi essencial à multiplicação das raízes, uma vez que em meio MS0 ocorreu significativo desenvolvimento de brotos. A suplementação com ANA não foi eficiente para a produção de raízes e acarretou no calejamento dos explantes, enquanto que a presença de AIA e AIB resultaram na multiplicação das raízes. Ainda assim, independentemente das manipulações realizadas no meio de cultivo, a capacidade de multiplicação mostrou-se reduzida. Uma expressiva multiplicação de raízes foi observada em culturas iniciadas a partir de explantes oriundos de plantas obtidas por germinação in vitro. A maior produção de biomassa foi alcançada em culturas iniciadas com segmentos radiculares de plantas obtidas por germinação in vitro cultivadas em meio contendo com 3,0 mg.L-1 de AIB e mantidas no escuro. Culturas estabelecidas nas melhores condições para acúmulo de biomassa foram acompanhadas por três subculturas, sendo avaliados períodos de cultura de 45 dias e de 60 dias. Culturas mantidas a intervalos de 45 dias apresentaram maior produção de raízes durante a segunda subcultura, enquanto que para o intervalo de 60 dias, embora tenha sido observada a capacidade de multiplicação das raízes, a maior produção de biomassa ocorreu nos primeiros 60 dias de cultivo. A partir de materiais in vivo e in vitro foram realizadas extrações com solventes de polaridade crescente (hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol) e os extratos foram submetidos a avaliações cromatográficas. As análises por cromatografia em camada delgada mostraram a presença de terpenos nos extratos obtidos com hexano e diclorometano, tanto em material obtido a campo como naqueles produzidos in vitro e de compostos fenólicos nos extratos em acetato de etila obtidos a partir de material de campo. Pelas análises por cromatografia líquida associada à espectrometria de massas foi possível observar a presença de flavonoides nas culturas in vitro, não detectados no material de campo. As análises por cromatografia de fase gasosa associada à espectrometria de massas apontaram a presença de esteroides nos extratos em hexano de raízes coletadas a campo e nas culturas in vitro de raízes. Os resultados obtidos mostraram a viabilidade da produção de culturas de raízes in vitro para a espécie C. spinosa e o potencial deste material para a produção de substâncias bioativas, algumas não encontradas em material coletado a campo

Produção in vitro e criopreservação de raízes de Cleome rosea Vahl (Capparaceae)

Cleome rosea é uma espécie nativa, de porte herbáceo, ocorrente em restingas brasileiras. Estudos recentes têm revelado o potencial medicinal da espécie para importantes propriedades farmacológicas, como por exemplo, as atividades anti-inflamatória, antigenotóxica, antiviral e antibacteriana. Porém, nos últimos anos, C. rosea não tem sido encontrada em várias regiões de seu ambiente natural, devido, principalmente, às ações antrópicas. Dessa forma, torna-se relevante o desenvolvimento de métodos de conservação que permitam o estudo e exploração das propriedades medicinais da espécie. O cultivo in vitro de raízes representa uma forma eficiente para produção de biomassa, devido ao rápido crescimento, produção estável de metabólitos, além de representar uma potencial fonte de explantes para a propagação em massa de diferentes espécies. O presente trabalho teve como objetivo a produção in vitro de culturas de raízes de C. rosea, associada à criopreservação, como forma de manutenção em longo prazo das culturas, monitorada através da análise de estabilidade genética. As culturas estabelecidas a partir de explantes radiculares de plantas propagadas in vitro de C. rosea demonstraram excelente capacidade de multiplicação de raízes em meio de cultura suplementado com o fitorregulador ANA, com manutenção dessa capacidade ao longo de sucessivas subculturas. Associado a esses resultados, o estabelecimento de protocolos de criopreservação pelo método de vitrificação resultou em elevados valores de frequência de recuperação do material após congelamento em nitrogênio líquido com as soluções de vitrificação PVS2 e PVS3. Os estudos de monitoramento da estabilidade genética, pela técnica de marcadores moleculares RAPD, revelaram a presença de polimorfismos significativos em uma das três culturas iniciadas a partir de raízes de C. rosea criopreservadas. Esses resultados demonstram as possibilidades de produção de raízes de C. rosea e conservação em longo prazo através da criopreservação, iniciando estudos inéditos para a espécie.

Atividade in vitro da pterocarpanoquinona LQB-118 sobre o Trypanosoma cruzi

A doença de Chagas é endêmica na América Latina sendo considerada uma doença negligenciada com grande impacto socioeconômico. A infecção é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi que é transmitido pela forma vetorial, entre outros mecanismos. O tratamento consiste basicamente no uso de dois fármacos, o benznidazol e o Nifurtimox que apresentam uma série de efeitos colaterais e atuam muito pouco nas formas amastigotas intracelulares o que faz com que o tratamento atual seja restrito e insatisfatório.Várias atividades farmacológicas foram atribuídas ao lapachol e a pterocarpanos, tais como atividade antitumoral e antiparasitária. Devido a esse potencial foi sintetizado uma molécula híbrida, a pterocarpanoquinona LQB-118, e algumas moléculas derivadas. A LQB-118 mostrou anteriormente atividade antitumoral e anti-Leishmania. O objetivo do presente trabalho foi investigar a atividade in vitro da LQB-118 e suas moléculas derivadas sobre o Trypanosoma cruzi clone Dm28c. Para avaliação inicial do efeito anti-parasitário das moléculas, amastigotas intracelulares, tripomastigotas metacíclicos e epimastigotas foram incubados com 20 M das LQBs 118, 168, 187, 182 e 236. A LQB-118 demonstrou atividade antiparasitária nas três formas evolutivas (90% na forma amastigota, 44% na forma tripomastigota e 70% na forma epimastigota) do parasito, enquanto as moléculas derivadas não mostraram atividade significativa. Sendo assim os estudos foram continuados com a molécula LQB-118. A ação da LQB-118 sobre as amastigotas intracelulares foi dose dependente, com redução do índice de infecção em 81% e 88% nas concentrações de 20 e 30 M respectivamente. Já sobre tripomastigotas, a LQB-118 foi menos ativa reduzindo a mobilidade dessas formas em até 45% a 30 M. Sobre a forma epimastigota a ação foi dose-dependente chegando a inibir 96% o crescimento dos parasitos a 20 M, com alterações da morfologia tais como arrendondamento do corpo celular e perda do flagelo. A dose capaz de inibir 50% foi de 4,2 M para amastigota intracelular e 38,1 M para tripomastigotas. Para macrófagos, a LC50 ficou em 40 M, uma concentração quase dez vezes maior que a IC50 para amastigotas. A capacidade das formas amastigotas intracelulares se diferenciarem em tripomatigotas e lisar os macrófagos foi avaliada após o tratamento com a LQB-118 por 72h. Observou-se um atraso do ciclo intracelular do parasito de modo dose-dependente, onde na concentração de 30 M o surgimento de tripomastigota foi no 9 dia enquanto nos controles foi no 5 dia de cultura. Para delinear o mecanismo de ação, foi avaliado o efeito direto sobre o parasito como a indução da fragmentação de DNA. A análise de indução da fragmentação do DNA feita pela marcação pelo TUNEL mostrou que o tratamento com a LQB-118 induziu seletivamente a fragmentação do núcleo das amastigotas enquanto o núcleo dos macrófagos se mantiveram íntegros. Macrófagos peritoneais pré-tratados com LQB-118 por 24 horas foram capazes de reduzir o número de amastigotas após 72h de cultivo na ausência da molécula, mas sem alteração na produção de óxido nítrico. Esses resultados mostram que a LQB-118 é ativa contra o T. cruzi, principalmente sobre a forma amastigota intracelular, que é a forma presente na fase crônica da infecção. O mecanismo de ação sugere que a LQB-118 é capaz de ser seletivamente tóxica para o parasito e também ativar os mecanismos microbicidas dos macrófagos de modo independente da produção de óxido nítrico.

Influência de um extrato aquoso de Coriandrum sativum na marcação in vitro de constituintes sanguíneos com tecnécio-99m e de sua associação com vibração gerada por plataforma oscilante na biodistribuição do radiofármaco Na99mTcO4 e na concentração de biomarcadores em ratos Wistar

Coriandrum sativum, conhecido popularmente como coentro, é um vegetal usado na alimentação humana. Também é utilizado como planta medicinal para tratamento de diabetes, complicações gastrintestinais, e como um antiedêmico, antisséptico e emenagogo. Em investigações acerca dos efeitos do extrato de plantas, é importante a determinação de alguns parâmetros físico-químicos. Diversos modelos experimentais têm sido usados, inclusive com o emprego de radionuclídeos. Em procedimentos da Medicina Nuclear que auxiliam o diagnóstico de doenças, o tecnécio-99m (99mTc) é o radionuclídeo mais utilizado. Hemácias marcadas com 99mTc estão entre as várias estruturas celulares que podem ser marcadas com este radionuclídeo e usadas como radiofármaco. Para a marcação com 99mTc é necessária a presença de um agente redutor, e o mais utilizado é o cloreto estanoso (SnCl2). As terapias com drogas e condições de dieta além de doenças podem alterar a marcação de constituintes sanguíneos, bem como a biodistribuição de diferentes radiofármacos. A exposição às vibrações geradas por plataforma oscilatória produz exercícios de corpo inteiro. O objetivo deste estudo foi caracterizar a preparação de um extrato do Coriandrum sativum, através de parâmetros físico-químicos, verificar os efeitos desse produto natural na radiomarcação de constituintes sanguíneos e em associação à vibração gerada pela plataforma na biodistribuição de Na99mTcO4 e na concentração de alguns biomarcadores. O extrato de coentro teve a o pico de absorbância em 480 nm. O extrato de coentro foi inversamente correlacionado com a concentração na condutividade elétrica. Foi encontrado o maior valor de pH na menor concentração do extrato (0,5 mg/mL). Não houve uma alteração significativa na marcação de constituintes sanguíneos com 99mTc. E a associação do extrato de coentro e vibração gerada por plataforma com frequência de 12 Hz teve efeito no baço, como observado na fixação do radiofármaco nesse órgão e ação em alguns órgãos alternando a concentração de alguns biomarcadores. Em conclusão, parâmetros físico-químicos podem ser úteis para caracterizar o extrato estudado. Provavelmente, as propriedades redox associadas com substâncias desse extrato podem ser os responsáveis pela ausência do efeito na radiomarcação de constituintes sanguíneos. A determinação da captação do Na99mTcO4 em diferentes órgãos permite verificar que o extrato de coentro sozinho não foi capaz de interferir na biodistribuição do radiofármaco. Contudo o tratamento de animais com vibração gerada pela plataforma alterou significativamente a fixação do pertecnetato de sódio no baço e a concentração do colesterol, triglicerídeo, CK e bilirrubina.

Conservação in vitro de germoplasma de Petiveria alliacea L. utilizando cultura de tecidos e criopreservação

A implementação de estratégias visando à conservação de espécies medicinais apresenta grande importância, tanto do ponto de vista ecológico quanto econômico. Petiveria alliacea L., espécie da família Phytolacaceae, conhecida como guiné, erva-de alho, erva-tipi ou amansa-senhor, pode ser encontrada desde a América Central até a América do Sul. Esta espécie possui ampla utilização medicinal, devido à presença, em sua composição, de vários polissulfetos, como o DTS (dibenziltrissulfeto), com propriedades antifúngica, antineoplásica e imunomodulatória, entre outras. O objetivo deste trabalho foi a conservação in vitro de germoplasma de Petiveria alliacea obtido de diferentes populações ocorrentes no Rio de Janeiro, através de métodos baseados em cultura de tecidos e criopreservação. Plantas obtidas através da germinação in vitro foram utilizadas como matrizes para a micropropagação através da multiplicação de meristemas pré-existentes em meio MS sem reguladores de crescimento, e embriões somáticos foram obtidos de forma direta a partir da cultura de explantes foliares das linhagens estudadas (Magé MG; Marechal Hermes MH; Niterói NT; Vila Isabel VI e Planta envasada AL), em presença de PIC (20μM) e 2,4D (22,6 μM), após 60 dias de cultivo. Os ápices caulinares das plantas micropropagadas e os embriões somáticos obtidos foram submetidos à criopreservação através de técnicas de vitrificação, encapsulamento-vitrificação e encapsulamento-desidratação, com a avaliação da pré-cultura e de soluções crioprotetoras (PVS2 e PVS3), em diferentes concentrações e tempos de exposição. Os resultados mostraram uma taxa de 100% de germinação in vitro. As condições para a pré-cultura de ápices foram padronizadas, entretanto não foram obtidos resultados positivos após o descongelamento. Por outro lado, os embriões da linhagem AL (linhagem embriogênica em cultura há 24 meses) mantiveram sua capacidade multiplicativa (100%) (embriogênese secundária) quando submetidos à desidratação em sacarose (0,5M) e expostos às soluções de vitrificação PVS2 e PVS3 pelos menores tempos (15 e 30 minutos). Os diferentes meios de recuperação apresentaram respostas variáveis em relação à capacidade multiplicativa dos embriões. O encapsulamento/vitrificação foi a técnica que promoveu maior tolerância dos embriões ao congelamento. A recuperação dos embriões através de multiplicação após a criopreservação abre uma perspectiva de conservação de genótipos com alta produção de polissulfetos, de interesse para a indústria farmacêutica

Capacidade de invasão, persistência intracelular e atividade citotóxica de cepas de Aeromonas spp. em modelo celular in vitro e ex vivo

As Aeromonas são consideradas patógenos em potenciais para o homem e animais e estão amplamente distribuídas no ambiente sendo a água e os alimentos importantes veículos de transmissão. Muitos estudos têm demonstrado que a patologia causada pela infecção por Aeromonas é complexa e envolvem inúmeros fatores de virulência, dentre eles a aderência, invasão, enterotoxinas, hemolisinas, exoenzimas, sideróforos, flagelos, formação de biofilme e mecanismos de secreção. No presente estudo, analisamos os mecanismos de patogênese mediados por A. caviae e A. hydrophila, avaliando a participação desses microrganismos nos processos de adesão, invasão, persistência intracelular e citotoxidade celular. Foram utilizados ensaios quantitativos in vitro para testar associação, invasão e persistência intracelular em linhagens celulares HEp-2 e/ou T84. A interação de tecidos intestinais de coelho cultivados in vitro (IVOC) com três cepas de A. caviae originárias de fezes diarréicas também foi avaliada. Observamos que 10 (62,5%) das 16 cepas de Aeromonas spp. de diferentes origens, submetidas aos testes de invasão quantitativos foram capazes de invadir células HEp-2 e T84 em 6 horas de incubação. As cepas positivas nos testes de invasão foram submetidas ao teste quantitativo de persistência em células HEp-2 e sobreviveram no ambiente intracelular por 48 e/ou 72 horas sem multiplicação. A interação de três cepas de A. caviae com a mucosa intestinal de coelho ex vivo resultou em aderência, produção de muco e alterações como, intensa vacuolização e drástica desorganização estrutural que levaram a destruição das microvilosidades intestinais. Este estudo demonstrou que subconjuntos de cepas de A. caviae e A. hydrophila de diversas origens, foram capazes de invadir, persistir ou destruir linhagens celulares in vitro. Nosso estudo também evidenciou que cepas de A. caviae causaram expressivas alterações morfológicas que resultaram na destruição de epitélios intestinais de coelho ex vivo. Finalmente, nossos resultados contribuíram para reforçar o potencial patogênico de cepas de Aeromonas, em especial, as de origem vegetal e clínica.

Produção in vitro, análise fitoquímica e avaliação da atividade antineoplásica de metabólitos de Hovenia dulcis Thunb. (Rhamnaceae) obtidos por diferentes estratégias biotecnológicas

Hovenia dulcis Thunberg, natural da Ásia Oriental, é cultivada no Brasil onde é conhecida como uva-do-japão. A espécie possui várias indicações na medicina popular e alguns estudos apontam o seu potencial antineoplásico, tripanocida e hepatoprotetor. Metabólitos secundários são substâncias não essenciais para a sobrevivência celular, mas que fornecem vantagens adaptativas aos vegetais, sendo atribuído, para algumas delas, atividades biológicas importantes. Substâncias de interesse medicinal têm sido obtidas por técnicas da cultura de tecidos vegetais, como a calogênese e a cultura de células em suspensão, que permitem a síntese de matéria-prima de forma contínua e homogênea, independentemente de fatores ambientais e sazonais. O presente estudo objetivou o estabelecimento de culturas in vitro de H. dulcis, visando à produção de metabólitos de interesse, com vistas à avaliação do seu potencial antineoplásico sobre células K562. Foram testados protocolos para o estabelecimento de diferentes sistemas, como culturas de calos, de células em suspensão (CCS) e compact callus clusters (CCC) e ainda a avaliação do uso de elicitores na otimização de metabólitos produzidos in vitro. Foi verificado que a adição dos fitorreguladores KIN e TDZ, substituindo o BAP, não foi capaz de induzir a formação de calos friáveis, bem como a manutenção das culturas em ausência de luz. O uso do nitrato de prata promoveu a friabilidade de calos em todas as concentrações testadas, considerando-se 2,0 mg.L-1 a melhor concentração. Foram alcançadas taxas de 100% de formação de CCS tanto na presença, quanto em ausência de AgNO3. O maior acúmulo de biomassa foi verificado na concentração mais baixa de PIC (0,625 mg.L-1). A análise dos espectros de RMN indicou a presença de (+)-dihidromiricetina, (+)-galocatequina, hovenitina II, hovenosideo G, hodulosideo III, hodulosideo IV, hodulosideo I e hovenidulciosideo B1 nas culturas de calos friáveis. No estabelecimento de culturas CCC, observou-se a formação de calos compactos verdes em todas as concentrações de ANA testadas. O aumento da velocidade de rotação para 135 rpm aumentou a dispersão das células com consequente formação dos agregados celulares desejados. A seleção de linhagens celulares demonstrou ser um método eficiente na uniformização do tamanho desses agregados e tal uniformidade se manteve estável por mais de cinco subcultivos em 100% das culturas. Uma fração rica em saponinas foi obtida a partir dos agregados celulares, correspondendo a 1,46% da massa seca. A análise por RMN sugeriu a presença das saponinas Hovenosideo G e dos hovenidulciosideos A2 e B2. O uso de elicitores em cultura de calos mostrou-se adequado à produção de metabólitos secundários, sem alterações morfológicas nos mesmos. A elicitação alterou o perfil cromatográfico analisado por HPLC. Na elicitação com 5,0 mg.L-1 de extrato de levedura foi verificado um aumento de quase três vezes (12,280 3,396 equivalentes de quercetina/mg de extrato) na síntese de flavonoides. Finalmente, os estudos de ação antitumoral in vitro demonstraram citotoxicidade dos extratos de calos não elicitados de H. dulcis sobre linhagem de leucemia mieloide crônica (IC50 de 74,05 μg.mL-1.) e inibição do crescimento de tais células (K562), sugerindo o potencial antineoplásico para um produto biotecnológio (calo) desta espécie.

Avaliação dos métodos para análise da microinfiltração marginal em restaurações de resina composta classe V in vitro

O objetivo deste estudo foi comparar os resultados da microinfiltração marginal obtidos por diferentes meios de aquisição de imagens e métodos de mensuração da penetração de prata em restaurações de resina composta classe V, in vitro. Dezoito pré-molares humanos hígidos, recém extraídos, foram divididos em três grupos, de acordo com o tipo de instrumento para preparação cavitária utilizado. Grupo 1: ponta diamantada número 3100, em alta rotação. Grupo 2: broca carbide número 330, em alta rotação. Grupo 3: ponta CVDentus código 82137, em aparelho de ultrassom. Foram realizados preparos cavitários padronizados (3x4x2mm) classe V nas faces vestibular e lingual de todos os dentes, com margens oclusais em esmalte e cervicais em dentina/cemento. As cavidades foram restauradas com o sistema adesivo Solobond M (VOCO) e resina composta Grandio (VOCO), a qual foi inserida e fotoativada em três incrementos. Os corpos de prova ficaram imersos em água destilada por 24h a 37oC; receberam acabamento e polimento com discos SofLex (3M) e foram novamente armazenados em água destilada, por sete dias. Posteriormente, as superfícies dentárias foram coberta com duas camadas de esmalte para unhas vermelho, exceto as áreas adjacentes às restaurações. Os espécimes ficaram imersos em solução aquosa de nitrato de prata a 50% por 24h e em solução fotorreveladora por 2h e foram seccionados no sentido vestíbulo-lingual, passando pelo centro das restaurações, com disco diamantado em baixa rotação. As amostras foram polidas em politriz horizontal e analisadas por diferentes métodos. À extensão da microinfiltração foi atribuído escores de 0 a 3 através de análises por meio de estereomicroscópio tradicional e com leds e microscópio ótico. As imagens obtidas na lupa com leds e no microscópio ótico tiveram as áreas infiltradas medidas através do software AxioVision. O teste χ2 de McNemar-Bowker revelou concordância estatística entre estereomicroscópio tradicional e o com leds (p=0,809) durante análises semiquantitativas. Porém, houve diferenças significantes entre microscópio ótico e estereomicroscópios (p<0,001). Houve boa correlação entre análises semiquantitativas e quantitativas de acordo com o teste de Spearmann (p<0,001). O teste de Kruskall-Wallis não revelou diferenças estatisticamente significantes (p=0,174) entre os grupos experimentais na análise quantitativa por microscópio ótico, em esmalte. Ao contrário do que se observa com a mesma em lupa (p<0,001). Conclui-se que o método de atribuição de escores comumente aplicado com a lupa nos estudos da microinfiltração marginal é uma opção confiável para análise da microinfiltração.

Avaliação in vitro da variação do torque de remoção de parafusos para fixação de pilares protéticos submetidos a ciclos de parafusamento e desparafusamento

O afrouxamento dos parafusos protéticos é descrito na literatura como uma das complicações mais frequentes das próteses sobre implantes. Durante sua confecção, os profissionais sentem necessidade de remover várias vezes as próteses e/ou componentes protéticos, soltando e re-apertando os parafusos repetidamente. O principal objetivo deste trabalho foi avaliar a variação do torque de remoção de parafusos de fixação de pilares protéticos a implantes osteointegráveis após sucessivos ciclos de parafusamento e desparafusamento. Outro objetivo foi avaliar a influência do hexágono da base do pilar no torque de remoção dos parafusos. Para isso, foram utilizados 20 implantes de plataforma regular com hexágono externo e 20 pilares protéticos sextavados, que foram parafusados aos implantes com um parafuso de titânio, aplicando-se a este um torque de 32Ncm, por meio de um torquímetro digital. Os conjuntos implante/pilar/parafuso foram divididos em dois grupos: (1) pilares cujo hexágono da base foram removidos e (2) pilares convencionais, com hexágono na base. Cada conjunto recebeu uma restauração provisória e foi submetido a ciclagem mecânica por 15 minutos. Depois, os parafusos foram removidos, medindo-se o torque de remoção. Esta sequência foi repetida dez vezes e então o parafuso foi trocado por outro sem uso, e mais um ciclo foi realizado. Uma análise de regressão linear demonstrou nos dois grupos uma queda do torque de remoção do parafuso ao longo dos repetidos ciclos de inserção/remoção. A comparação entre os coeficientes da regressão nos dois grupos não revelou diferença entre eles. Também não houve diferença entre as médias das 5 últimas repetições e o 11 ciclo, com o parafuso novo. Concluiu-se que (1) repetidos parafusamentos e desparafusamentos promoveram a diminuição progressiva do torque de remoção dos parafusos, (2) a troca do parafuso por outro sem uso após dez ciclos de inserção/remoção não aumentou sua resistência ao afrouxamento, e (3) a remoção do hexágono da base do pilar protético não exerceu nenhum efeito sobre o torque de remoção do parafuso.

Avaliação do potencial anti-inflamatório agudo e crônico e imunossupressor do extrato etanólico de Pterodon polygalaeflorus através de estudos in vivo e in vitro

O gênero Pterodon pertence à família das Papilonaceas e inclui cinco espécies nativas do Brasil: P. pubescens Benth., P. emarginatus Vog., P. apparicioi Pedersoli e P. abruptus Benth., sendo a espécie objeto deste estudo a P. polygalaeflorus Benth.. Seus frutos são livremente comercializados em mercados da flora medicinal e utilizados pela medicina popular devido a propriedades anti-reumática, analgésica, antiinflamatória, dentre outros efeitos associados a esses frutos. O principal uso popular está relacionado ao efeito antiartrítico que parece se encontrar na fração oleosa do fruto. O objetivo deste trabalho foi avaliar o extrato etanólico de Pterodon polygalaeflorus (EEPpg) quanto ao seu potencial antiinflamatório crônico através do modelo de artrite induzida por colágeno (CIA) e seu efeito sobre os linfócitos in vitro, bem como sobre a expansão de células MAC-1+ induzida por adjuvante completo de Freund (AFC). A caracterização química do EEPpg foi realizada por cromatografia em camada delgada (TLC), cromatografia líquida de alta performance (HPLC) e cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massa (GC-MS), através dos quais uma gama de compostos, incluindo terpenóides de polaridades variadas e flavonóides, foram observados. No modelo de CIA, o EEPpg reduziu significativamente parâmetros associados ao desenvolvimento e progressão da doença e à severidade da doença , inibindo em até 99% o seu desenvolvimento e levando a ausência de sinais clínicos evidentes após tratamento com as menores doses do extrato (0,01 mg/kg e 0,001 mg/kg). O tratamento com EEPpg também reduziu características histopatológicas típicas de articulações de animais com CIA, que também são observadas na artrite reumatóide. O EEPpg reduziu significativamente o peso dos linfonodos dos camundongos, bem como o número absoluto de segmentados, monócitos e linfócitos no sangue. In vitro, O EEPpg mostrou uma atividade anti-proliferativa dos esplenócitos estimulados com concanavalina A (Con A) ou lipopolissacarídeo (LPS) analisada através do ensaio de redução do sal de tetrazólio MTT, corroborada pelo seu efeito sobre o ciclo celular de linfócitos estimulados com Con A, onde o EEPpg nas concentrações de 5, 10 e 20 μg/mL reduziu significativamente, de maneira concentração-dependente, o número de células nas fases S+G2/M e aumentou na fase G0/G1 do ciclo celular. O efeito anti-proliferativo do EEPpg parece também estar associado ao aumento da apoptose dos linfócitos após estimulação com Con A, com aumento estatisticamente significativo no percentual de células mortas por apoptose nas maiores concentrações . O EEPpg inibiu a expansão de células Mac-1+ induzida por AFC no baço, porém não no peritônio. Esse resultado sugere um efeito inibidor do EEPpg sobre a migração celular para as articulações artríticas. Esses resultados contribuem para a validação do uso popular de P. polygalaeflorus contra doenças relacionadas a processos inflamatórios e imunes, sobretudo na artrite reumatóide, antes nunca demonstrado.

Comparação in vitro do desgaste dental em função da dureza de três diferentes tipos de materiais antagonistas

O objetivo deste estudo foi comparar in vitro o desgaste dental de pré-molares (PM) e molares (M) e sua relação com o valor de dureza Vickers dos materiais utilizados como antagonistas em uma máquina de abrasão simulada para provocar o desgaste nos dentes testados. Os materiais antagonistas utilizados foram VeraBond II (liga de Ni-Cr), Solidex (resina composta) e IPS Empress 2 (cerâmica). Para cada ensaio de dureza, foram preparados seis corpos-de-prova de cada material, os quais foram polidos sob refrigeração, com ciclo de 20 min para cada granulação. Num microdurômetro (HMV-2), foram realizadas três mossas por quadrante, cada uma sob carga de 19,614 N por 30 s, totalizando 12 mossas de base quadrada com ângulo de 136 entre os planos. O teste de abrasão foi realizado numa máquina simuladora de abrasão, freqüência de 265 ciclos/min e 4,4 Hz, com um percurso do antagonista de 10 mm à velocidade de 88 mm/s. Cada dente foi testado em oposição a um antagonista (foram 6 pares dente/material para cada grupo), em água deionizada, sob carga de 5 N, por 150 min, num total de 39.750 ciclos. Foram utilizados dezenove dentes 1 pré-molares, dezenove 3 molares e confeccionados doze antagonistas em cada material em forma de pastilha. Cada grupo de seis dentes foi testado em oposição a seis antagonistas do mesmo material. Ademais, um dente 1 pré-molar (PM) e um dente 3 molar (M) foram testados em oposição ao Plexiglass. Com relação ao desgaste do esmalte dentário (PM+M) segundo o material antagonista, o teste de Kruskal-Wallis evidenciou diferença significativa com p-valor < 0,001 e o teste de Mann-Whitney evidenciou diferença significativa nas comparações PM+M/resina X PM+M/metal (p-valor < 0,001), PM+M/resina X PM+M/cerâmica (p-valor < 0,001) e PM+M/metal X PM+M/cerâmica (p-valor = 0,002). A análise isolada, considerando pré-molares e molares separadamente, encontrou diferença significativa em relação ao desgaste do esmalte dentário no teste de Kruskall-Wallis, porém não detectou diferença significativa no teste de comparação múltipla Mann-Whitney quando comparou o desgaste sofrido pelo PM/metal em relação ao PM/cerâmica. Em relação à dureza Vickers detectou-se diferença significativa da dureza dos materiais no teste de Kruskall-Wallis (p-valor < 0,001) e também no teste de Mann-Whitney nas comparações múltiplas com p-valor = 0,002. Comparando-se a dureza com a perfilometria, observou-se uma correlação estatisticamente significativa (p ≤ 0,05) na correlação negativa (ρ= -0,829) entre a dureza do metal como material antagonista e o desgaste do esmalte dentário do dente molar. Os resultados sugeriram que todo material restaurador indireto estudado causou desgaste ao esmalte dentário quando submetido a forças de simulação de abrasão com carga. Embora tenha sido observada correlação entre dureza e resistência à abrasão, essa correlação foi pouco significativa.

Técnica do tratamento restaurador atraumatico em estudantes de escola municipal do Rio de Janeiro: avaliação in vitro da influência da proteção superficial e do tempo de entrada em serviço na resistência a tração diametral do cimento de ionômero de vidro utilizado

Tratamento restaurador atraumático tornou-se uma opção real para o tratamento da cárie dentária em saúde pública no Brasil. O presente estudo teve como objetivo avaliar durabilidade, resistência e eficácia de 70 restaurações em 31 alunos (entre 6 a 12 anos de idade na Escola Municipal Rotary, RJ - Brasil). Depois de CPO-D e ceo-exame de acordo com critérios da OMS, todos os alunos com selecionados receberam TRA com VITRO MOLAR - DFL, juntamente com instruções de saúde bucal. Os critérios de exclusão foram a presença de cavidades muito profundas e exposição pulpar, casos em que os alunos foram encaminhados para o Postos de Saúde Municipal. In vitro avaliou-se a influência do tempo de entrada em serviço e do tipo de cobertura protetora utilizada na resistência coesiva do Cimento de Ionômero de Vidro utilizado, por meio de ensaios de tração diametral. Confeccionou-se para o teste de tração diametral 6 espécimes para cada variante, 72 no total, com dimensões de 4 mm de diâmetro por 8 mm de comprimento, divididos entre os grupos: grupo1 sem protetor (controle); grupo2 vaselina sólida; grupo3 verniz para unhas. Realizou-se ensaios mecânicos em uma máquina universal de ensaios EMIC DL 500 MF, após a confecção e estocagem individual dos espécimes em potes plásticos contendo 5 ml de água deionizada, que formaram os subgrupos descritos a seguir: a - 20 minutos; b - 2 horas; c - 24 horas; d - 7 dias. Os dados obtidos foram tratados por ANOVA e por Student Newman-Keuls (p<0,05). Ao se avaliar a influência dos diferentes protetores de superfície no CIV utilizado no presente trabalho observou-se que, os protetores de superfície tiveram influência no comportamento do material (p=0,000), com o verniz para unhas mostrando um desempenho superior ao da vaselina sólida. Quanto ao tempo, não foi possível verificar ruptura do material no prazo de 20 minutos, pois os corpos de prova sofriam deformação elástica catastrófica não sendo adequado para a finalidade desejada. Os tempos de 24 horas e sete dias foram semelhantes entre si e diferentes do tempo de duas horas. As restaurações foram clinicamente avaliadas depois de 6, 12, e 24 meses após sua alocação. No total 72 restaurações foram realizadas em 31 escolares. Depois de seis meses, 5 restaurações fraturaram e 3 perderam algum material. Após 12 meses, oito restaurações foram perdidas e apenas 1 fraturou. Na avaliação após 24 meses, mais 12 restaurações foram perdidas e 3 perderam material. Não foram registradas lesões cariosas secundarias após esse período, mesmo quando as restaurações foram parcialmente perdidas. Clinicamente conclui-se que quando a técnica do TRA é bem indicada e aplicada corretamente pode haver uma redução significativa no número de dentes perdidos por lesões de cárie nos indivíduos que participaram do nosso estudo.