Estabelecimento de culturas de raízes in vitro e avaliação da produção de metabólitos secundários de Cleome spinosa Jacq. (Cleomaceae)

Cleome spinosa é uma espécie herbácea de uso na medicina popular, especialmente no Nordeste do Brasil. A cultura in vitro de raízes adventícias da espécie foi iniciada com segmentos radiculares (0,5 e 1,0 cm) obtidos a partir de duas fontes de explantes: plantas propagadas in vitro e plantas oriundas do processo de germinação in vitro. Os explantes foram inoculados em meio MS líquido suplementado ou não com as auxinas ANA, AIA e AIB em diferentes concentrações (0,5; 1,0; 1,5; 3,0; 5,0 mg.L-1). As culturas foram mantidas em sala de crescimento, sob agitação (100 rpm) e sob fotoperíodo de 16h ou no escuro, com subculturas a cada 45 dias. Explantes oriundos de plantas propagadas in vitro também foram cultivados em meio contendo a citocinina BAP em associação com auxinas, na presença de sorbitol (isoladamente ou em associação com sacarose), em meio MS contendo redução na concentração total de sais minerais (MS1/2 e MS1/4) e em meio sólido. Os resultados mostraram que a adição de auxinas ao meio de cultura foi essencial à multiplicação das raízes, uma vez que em meio MS0 ocorreu significativo desenvolvimento de brotos. A suplementação com ANA não foi eficiente para a produção de raízes e acarretou no calejamento dos explantes, enquanto que a presença de AIA e AIB resultaram na multiplicação das raízes. Ainda assim, independentemente das manipulações realizadas no meio de cultivo, a capacidade de multiplicação mostrou-se reduzida. Uma expressiva multiplicação de raízes foi observada em culturas iniciadas a partir de explantes oriundos de plantas obtidas por germinação in vitro. A maior produção de biomassa foi alcançada em culturas iniciadas com segmentos radiculares de plantas obtidas por germinação in vitro cultivadas em meio contendo com 3,0 mg.L-1 de AIB e mantidas no escuro. Culturas estabelecidas nas melhores condições para acúmulo de biomassa foram acompanhadas por três subculturas, sendo avaliados períodos de cultura de 45 dias e de 60 dias. Culturas mantidas a intervalos de 45 dias apresentaram maior produção de raízes durante a segunda subcultura, enquanto que para o intervalo de 60 dias, embora tenha sido observada a capacidade de multiplicação das raízes, a maior produção de biomassa ocorreu nos primeiros 60 dias de cultivo. A partir de materiais in vivo e in vitro foram realizadas extrações com solventes de polaridade crescente (hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol) e os extratos foram submetidos a avaliações cromatográficas. As análises por cromatografia em camada delgada mostraram a presença de terpenos nos extratos obtidos com hexano e diclorometano, tanto em material obtido a campo como naqueles produzidos in vitro e de compostos fenólicos nos extratos em acetato de etila obtidos a partir de material de campo. Pelas análises por cromatografia líquida associada à espectrometria de massas foi possível observar a presença de flavonoides nas culturas in vitro, não detectados no material de campo. As análises por cromatografia de fase gasosa associada à espectrometria de massas apontaram a presença de esteroides nos extratos em hexano de raízes coletadas a campo e nas culturas in vitro de raízes. Os resultados obtidos mostraram a viabilidade da produção de culturas de raízes in vitro para a espécie C. spinosa e o potencial deste material para a produção de substâncias bioativas, algumas não encontradas em material coletado a campo

Cleome spinosa is a herbaceous species used in folk medicine, mainly in the Northeast of Brazil. Cultures of adventitious roots were established with root segments (0.5 to 1.0 cm) obtained from two sources of explants: in vitro propagated plants and plants obtained from in vitro germination process. The explants were inoculated in MS liquid medium supplemented with or without the auxin NAA, IAA and IBA in different concentrations (0, 0.5, 1.0, 1.5, 3.0, 5.0 mg.L-1). Cultures were maintained in a growth room under agitation (100 rpm) and photoperiod of 16h light or in the dark, with subcultures every 45 days. Explants from in vitro propagated plants were also cultured in medium containing BAP in combination with auxins, in the presence of sorbitol (alone or in combination with sucrose), in MS medium with a reduction in the total concentration of mineral salts (MS1/2 and MS1/4) and on solidified medium. The results showed that hormonal supplementation was essential for roots multiplication, once cultures maintained in MS0 medium only developed shoots. The medium supplementation with NAA was not efficient for root production and resulted in callus induction. The presence of IAA and IBA was efficient to root multiplication. A significant root proliferation capacity was observed in cultures initiated from explants originating from plants obtained by in vitro germination process. On the other hand, cultures initiated with explants originating from in vitro propagated plants, regardless the different manipulations performed in the culture medium, showed low root multiplication capacity. The highest biomass production was achieved by cultures initiated with explants from in vitro germination plants cultured in medium supplemented with 3.0 mg.L-1 IBA and kept in the dark. Cultures with the highest biomass accumulation were subcultured at each 45 days or 60 days interval to fresh medium with the same composition during three - four subcultures. Cultures maintained at 45 days interval reached the highest biomass accumulation during the second subculture, while cultures maintained at 60 days interval, despite the maintenance of root multiplication along the subcultures, reached the highest production during the first 60 days in culture. Samples from in vivo and in vitro material were extracted with increasingly polar solvents (hexane, dichloromethane, ethyl acetate, methanol) and the extracts were submitted to chromatographic analysis. The analysis by thin layer indicated the presence of terpenes in hexane and dichloromethane extracts obtained with field plants and in vitro materials, and the presence of phenolic componds in ethyl acetate extracts obtained with field plants. Analysis by liquid chromatography coupled to mass spectrometry showed the in vitro production of metabolites not found in field plants, especially flavonoids. The gas chromatography coupled to mass spectrometry indicated the presence of steroids in the extracts obtained with hexane from field plants and root cultures. The results demonstrated the feasibility in the production of in vitro root cultures of C. spinosa and the potential of these biotechnological materials to phytochemical studies, mainly considering the presence under in vitro cultures of metabolites not produced by field plants