Combinatorial Synthesis and Biological Evaluation of Inhibitors of D-Ala-D-Ala-Ligase

Report for the scientific sojourn carried out at the Max Planck Institut of Molecular Phisiology, Germany, from 2006 to 2008.The work carried out during this postdoctoral stage was focused on two different projects. Firstly, identification of D-Ala D-Ala Inhibitors and the development of new synthethic approaches to obtain lipidated peptides and proteins and the use of these lipidated proteins in biological and biophysical studies. In the first project, new D-Ala D-Ala inhibitors were identified by using structural alignments of the ATP binding sites of the bacterial ligase DDl and protein and lipid kinases in complex with ATP analogs. We tested a series of commercially available kinase inhibitors and found LFM-A13 and Tyrphostine derivatives to inhibit DDl enzyme activity. Based on the initial screening results we synthesized a series of malononitrilamide and salicylamide derivatives and were able to confirm the validity of these scaffolds as inhibitors of DDl. From this investigation we gained a better understanding of the structural requirements and limitations necessary for the preparation of ATP competitive DDl inhibitors. The compounds in this study may serve as starting points for the development of bi-substrate inhibitors that incorporate both, an ATP competitive and a substrate competitive moiety. Bisubstrate inhibitors that block the ATP and D-Ala binding sites should exhibit enhanced selectivity and potency profiles by preferentially inhibiting DDl over kinases. In the second project, an optimized synthesis for tha alkylation of cysteins using the thiol ene reaction was establisehd. This new protocol allowed us to obtain large amounts of hexadecylated cysteine that was required for the synthesis of differently lipidated peptides. Afterwards the synthesis of various N-ras peptides bearing different lipid anchors was performed and the peptides were ligated to a truncated N-ras protein. The influence of this differently lipidated N-ras proteins on the partioning and association of N-Ras in model membrane subdomains was studied using Atomic Force Microscopy.

Energy dispersive X-Ray fluorescence : measuring elements in solid and liquid matrices

The subject of this project is about “Energy Dispersive X-Ray Fluorescence ” (EDXRF).This technique can be used for a tremendous variety of elemental analysis applications.It provides one of the simplest, most accurate and most economic analytical methods for thedetermination of the chemical composition of many types of materials.The purposes of this project are:- To give some basic information about Energy Dispersive X-ray Fluorescence.- To perform qualitative and quantitative analysis of different samples (water-dissolutions,powders, oils,..) in order to define the sensitivity and detection limits of the equipment.- To make a comprehensive and easy-to-use manual of the ‘ARL QUANT’X EnergyDispersive X-Ray Fluorescence’ apparatus

Aplicación de la técnica de espectrometría de fluorescencia de rayos-X en el estudio de la dispersión de metales en áreas mineras

One critical factor for success in characterizing metals polluting mining environments so as to be able to eliminate them and subsequently recover these areas depends upon a speedy and correct response in the analysis of samples. Rapid, simultaneous, multi-element analysis can be undertaken using X-ray fluorescence spectrometry, a versatile, non-destructive analytical technique commonly employed to identify both major and minor elements in samples related to environmental studies. An additional advantage of this technique is the possibility of conducting the analysis directly on solid samples, which is extremely convenient when dealing with environmental samples that are difficult to dissolve, such as soils, sediments and mining wastes. Moreover, in recent years the development of spectrometers equipped with digital-signal processors combined with enlarged X-ray production, using better designs for excitation-detection, has contributed to an improvement in instrumental sensitivity, thus allowing us to detect important polluting elements such as Cd and Pb at trace levels. In this paper the authors describe, on the basis of their own experience, some interesting applications of XRF spectrometry for the analysis of several types of environmental samples related to the study of the dispersion of metals within mining environments: (A) analysis of mining wastes, soils and sediments; (B) analysis of samples of vegetation used as bioindicators or related to phytoremediation studies; and (C) analysis of water samples related to mining operations

Validated spectrofluorometric method for determination of gemfibrozil in self nanoemulsifying drug delivery systems (SNEDDS)

A spectrofluorometric method has been developed and validated for the determination of gemfibrozil. The method is based on the excitation and emission capacities of gemfibrozil with excitation and emission wavelengths of 276 and 304 nm respectively. This method allows de determination of the drug in a self-nanoemulsifying drug delivery system (SNEDDS) for improve its intestinal absorption. Results obtained showed linear relationships with good correlation coefficients (r(2)>0.999) and low limits of detection and quantification (LOD of 0.075 μg mL(-1) and LOQ of 0.226 μg mL(-1)) in the range of 0.2-5 μg mL(-1), equally this method showed a good robustness and stability. Thus the amounts of gemfibrozil released from SNEDDS contained in gastro resistant hard gelatine capsules were analysed, and release studies could be performed satisfactorily.

Estabilitat conformacional de variants de la ribonucleasa A: pressió i temperatura com a inductors dels desplegament proteic

A fi d'analitzar la contribució de la regió C-terminal proposada com a iniciadora del plegament (CFIS 106-118) a l'estabilitat de l'RNasa A, els residus alifàtics d'aquesta regió es van substituir, mitjançant mutagènesi dirigida, per altres residus en els quals la cadena lateral alifàtica era rogressivament escurçada. La major part de les substitucions projectades suposaven delecions no disruptives de grups metil(è). A més, es va reemplaçar la Tyr115 per un Trp, de manera que, potencialment, s'introduïa una única sonda fluorescent, no desestabilitzant, per tal de seguir els canvis conformacionals que es poguessin generar en la regió durant el procés de legament/desplegament de la proteïna. Tant els paràmetres cinètics, com els espectres d'FTIR i CD, determinats per cadascuna de les ribonucleases variants, indiquen que els reemplaçaments aminoacídics efectuats presenten, en general, poc o cap efecte en l'estructura nativa i en l'activitat de l'enzim. Es va emprar l'espectroscòpia d'absorció a l'ultraviolat de quarta derivada, la fluorescència (per la variant amb Trp) i l'espectroscòpia d'infraroig per transformada de Fourier, per tal de seguir i caracteritzar, en condicions d'equilibri, les transicions conformacionals de cada variant en funció de la pressió i de la temperatura. Els resultats es van comparar amb els que es van obtenir per la proteïna salvatge. Per determinar més a fons les característiques del procés de desplegament de la variant Y115W, les transicions de desnaturalització induïdes per urea d'aquesta variant i de la proteïna salvatge, van ésser examinades per mitjà d'electroforesi en gradient d'urea i espectroscòpia de fluorescència. Curiosament, els canvis conformacionals que resulten de la desnaturalització per pressió són molt semblants als que s'obtenen per temperatura. Enfront d'un augment gradual tant de pressió com de temperatura, l'estructura terciària i els elements d'estructura secundària de les proteïnes estudiades es perden de manera conjunta i reversible. Aquestes variacions estructurals que es promouen descriuen un procés de desplegament molt cooperatiu i en dos estats. Atès que ambdues tècniques (UV i FTIR) utilitzen cadascuna un règim de concentració proteica molt diferent, els resultats indiquen que el procés de desplegament per pressió i per temperatura és intramolecular. Els resultats obtinguts suggereixen que la hidrofobicitat i el volum de les cadenes laterals del CFIS, juntament amb les interaccions de van der Waals entre elements d'estructura secundària intervenen de manera molt notable en l'estabilització de la proteïna. Entre els diferents aminoàcids alifàtics que pertanyen al CFIS C-terminal, la Val108 és el residu més important per tal de preservar la integritat estructural de l'estat natiu. Els reemplaçaments en aquesta posició causen petites alteracions conformacionals i una gran desestabilització de la proteïna (per exemple, el punt mig de la transició de desnaturalització per pressió i per temperatura de la variant V108G disminueix uns 592 MPa i 25ºC, respectivament, respecte a la proteïna salvatge). D'acord amb els resultats obtinguts, la variant Y115W ofereix una sonda útil per tal de seguir la cinètica de plegament/desplegament de l'RNasa A.

Um novo método para quantificar mercúrio orgânico (Hg orgânico) empregando a espectrometria de fluorescência atômica do vapor frio

In this work a simple and sensitive procedure to extract organic mercury from water and sediment samples, using methylene chloride in acidic media followed by CVAFS quantification has been developed. The method was evaluated for possible interferents, using different inorganic mercury species and humic acid, no effects being observed. The detection limit for organic mercury was 160 pg and 396 pg for water and sediment samples respectively. The accuracy of the method was evaluated using a certified reference material of methylmercury (BCR-580, estuarine sediment). Recovery tests using methylmercury as surrogate spiked with 1.0 up to 30.0 ng L-1 ranged from 90 up to 109% for water samples, whereas for sediments, recoveries ranged from 57 up to 97%.

Emprego da fluorescência de raios X por dispersão de energia para o mapeamento de troncos de árvores em Campinas, São Paulo

Dendrochemistry is based on the determination of elements retained in tree rings, which can be useful to characterize environmental occurrences. This work shows elemental mappings obtained by EDXRF of the cross section of a tree stem. The tree is originated from a polluted area in Campinas, São Paulo. Some profiles, as the sulfur one, show variations that can be attributed to external contributions, whereas the silicon one can be inferred to a protection defense natural mechanism. Besides being simultaneous and multielementar, the main advantages here are its performance through a non-destructive sample treatment and the ease of operation of XRF equipments.

Quantificação de antimônio em garrafas de politereftalato de etileno (PET) brasileiras por fluorescência de raios-X e avaliação quimiométrica para verificar a presença de pet reciclado através do teor de ferro

Antimony is a common catalyst in the synthesis of polyethylene terephthalate used for food-grade bottles manufacturing. However, antimony residues in final products are transferred to juices, soft drinks or water. The literature reports mentions of toxicity associated to antimony. In this work, a green, fast and direct method to quantify antimony, sulfur, iron and copper, in PET bottles by X-ray fluorescence spectrometry is presented. 2.4 to 11 mg Sb kg-1 were found in 20 samples analyzed. The coupling of the multielemental technique to chemometric treatment provided also the possibility to classify PET samples between bottle-grade PET/recycled PET blends by Fe content.

Contribuição da fluorescência de Raios–X na avaliação e modelação de georrecursos

O presente estudo diz respeito a um trabalho de pesquisa no âmbito de uma Tese de Mestrado compreendida no segundo ciclo de estudos do curso de Engenharia Geotécnica e Geoambiente, realizado sobre a contribuição da Fluorescência de Raios – X (FRX) no Zonamento de Georrecursos, com particular ênfase para a utilização do instrumento portátil e de ferramentas tecnológicas de vanguarda, indispensáveis à prospecção e exploração dos recursos minerais, designadamente na interpretação e integração de dados de natureza geológica e na modelação de métodos de exploração e processamento /tratamento de depósitos minerais, assim como do respectivo controlo. Esta dissertação discute os aspectos fundamentais da utilização da técnica de Fluorescência de Raios-X (portátil, FRXP), quanto à sua possibilidade de aplicação e metodologia exigida, com vista à definição de zonas com características químicas análogas do georrecurso e que preencham as exigências especificadas para a utilização da matéria-prima, nas indústrias consumidoras. Foi elaborada uma campanha de recolha de amostras de calcário proveniente da pedreira do Sangardão, em Condeixa–a–Nova, que numa primeira fase teve como objectivo principal a identificação da composição química da área em estudo e o grau de precisão do aparelho portátil de FRX. Para além desta análise foram, também, realizadas análises granulométricas por peneiração e sedimentação por Raios-X a amostras provenientes das bacias de sedimentação e do material passado no filtro prensa. Validado o método de análise por FRXP, realizou-se uma segunda fase deste trabalho, que consistiu na elaboração de uma amostragem bastante significativa de pontos, onde se realizaram análises por FRXP, de forma a obter uma maior cobertura química da área em estudo e localizar os locais chave de exploração da matéria-prima. Para uma correcta leitura dos dados analisados recorreu-se a ferramentas aliadas às novas tecnologias, as quais se mostraram um importante contributo para uma boa gestão do georrecurso em avaliação, nomeadamente o “XLSTAT” e o “Surfer” para tratamento estatístico dos dados e modelação, respectivamente.

Desenvolvimento de um método de análise quantitativa de concentração celular e PHB por microscopia de fluorescência e análise de imagem

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química e Bioquímica

Avaliação da eficiência de microscópios de fluorescência confocais

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Biomédica. A presente dissertação foi desenvolvida em colaboração com o Instituto Gulbenkian de Ciência

Estudo imunocitológico do fígado, baço e gânglio linfático de pacientes na forma hepatoesplênica da esquistossomose mansônica, utilizando a microscopia de fluorescência

Os autores estudaram amostras de fígado, baço e linfonodos de 45 pacientes portadores da forma hépatoesplênica da esqúistossomose mansônica, utilizando a técnica de imunofluorescência para detecção de antígenos em tecidos. Os casos que dispunham de dados clínicos e laboratoriais mais completos foram divididos em 3 grupos, de acôrdo com a idade, tendo sido tentada uma correlação entre a gravidade da doença e os achados imunológicos no baço e fígado. A correlação se mostrou positiva quanto ao baço e, sobretudo, nos grupos de crianças e adultos jovens. O estudo imunocitológico dos fígados à luz U.V. demonstrou a presença de células fagocitárías fluorescentes nos espaços porta, faixas de fibrose e, mais raramente nos sinusoides. A distribuição e freqüência das células fluorescentes, excetuados os granulomas, mostrou-se irregular e incaracterística. Estudo semelhante no baço demonstrou uniformidade de distribuição das células fluorescentes, predominantemente nos cordões de Billroth e nos sinusoides; menos freqüentemente nas trabéculas. Os folículos linfóides aparecem desprovidos de células fluorescentes. Do exame de numerosos granulomas em fígado e linfonodos, foi realizado um estudo evolutivo desta lesão. Os diversos aspectos imunocitológicos permitiram estabelecer cinco fases neste processo. As células fluorescentes são fagocitárias e reconhecíveis como polimorfonucleares neutrófilos e histiócitos; células redondas pequenas e algumas células alongadas não puderam ser identificadas. O material fluorescente dentro do ôvo ou no interior do citoplasma dos fagócitos aparece na forma de grumos e de finos grânulos com fluorescência verde-maçã brilhante. Os principais aspectos defendidos pelos autores podem ser sumariados como segue: o baço é mais uniformemente representativo do estado imunológico vigente nesta doença; as lesões fibroplásticas do fígado guardam relação direta com reações imunológicas; o infiltrado inflamatório dos espaços porta e das Jaixas de fibrose é especifico, pelo menos em parte; o granuloma esquistossoviótico é um processo reacional específico frente ao material antigênico contido no ôvo; o material antigênico demonstrado pelo método usado na esquistosomose mansônica é particulado (o método não permite demonstrar antígenos solúveis).

Otimização da técnica de micro Fluorescência de Raios- X para o estudo de ossos

Nos países desenvolvidos, as doenças reumáticas são o grupo de doenças mais fre-quentes da espécie humana, sendo por isso o primeiro motivo de consulta nos cuidados de saúde primários e a principal causa de incapacidade temporária para o trabalho e de reformas antecipadas por doença/invalidez (Canhão & Branco, 2013). O estudo destas doenças torna-se cada vez mais urgente visto que estas têm tendência crescente, tendo em conta os atuais esti-los de vida e o aumento da longevidade da população. Nesta dissertação foi estudada e otimi-zada a técnica de Micro Fluorescência de Raios-X (μ-XRF) de forma a permitir um estudo de elementos maioritários e elementos traço em ossos com doenças reumáticas, tendo em espe-cial atenção a razão Ca/P, já que, por estudos até agora efetuados, esta razão é considerada um biomarcador adequado para a avaliação da saúde dos ossos. Foram então verificados os erros aleatórios e sistemáticos existentes nesta técnica e concluiu-se quais os tipos de parâme-tros que devem ser tidos em conta para este estudo, tais como corrente, tensão do tubo, filtros, entre outros. As amostras foram ainda analisadas com a técnica de PIGE (Particle Induced Gamma-ray Emission) e comparados os resultados com os de μ-XRF de forma a avaliar a in-fluência da topologia da amostra. Pretende-se que este estudo seja o início do desenvolvimen-to de um método alternativo de diagnóstico precoce de doenças reumáticas, conduzindo a um tratamento mais eficaz e melhorando assim a qualidade de vida da população.

Fluorescência de raios-X aplicada ao estudo de ossadas humanas

O trabalho desenvolvido nesta dissertação visa o estudo da composição elementar de restos humanos (séculos XVIII-XIX) por fluorescência de raios-X dispersiva em energia (EDXRF). Os tecidos analisados, ossos, dentes, cabelos e massa encefálica, pertenciam a um conjunto de corpos exumadosda Ermida do Espírito Santo, em Almada (Portugal). Os resultados foram obtidos pela análise complementar de duas montagens experimentais: EDXRF com geometria triaxial e -EDXRF com geometria convencional. A primeira técnica permite obter melhores limites de deteção para matrizes de baixo Z. A configuração com um micro feixe e a análise em condições de vácuo permite melhorar os limites de deteção para os elementos mais leves. Os resultados obtidos para os indivíduos analisados puderam ser correlacionados, em alguns casos, com os hábitos alimentares e com o habitat, nomeadamente a exposição a elementos tóxicos. Adicionalmente, foi também avaliada a possibilidade de contaminação post-mortem dos corpos, a partir do local de inumação. Os elementos detetados em ambas as técnicas foram Ca, Fe, Cu, Zn, Br, Sr e Pb. Observaram-se níveis elevados de Zn e Sr para os ossos, que são indicativos de uma dieta rica em carne e peixe, respetivamente. Alguns indivíduos revelaram concentrações elevadas de Pb e Zn na polpa do dente. Estes elementos poder~ao ter sido resultado de uma da acumulação o ante-mortem e indicar o hábito do tabaco. Os resultados mostram um indivíduo que apresenta concentrações bastante elevadas de Pb, especialmente na massa encefálica, polpa do dente e ossos esponjosos. A contaminação poderá ter sido resultado da exposição ante-mortem de Pb, eventualmente devida ao trabalho efetuado numa fundição. Ademais, outro indivíduo apresentou uma concentração elevadíssima de Hg no cabelo. Neste caso, a hipótese proposta mais provável é a aplicação de um composto à base de Hg, para fins medicinais, possivelmente para a desinfestação de piolhos.

Análise dos transientes da fluorescência da clorofila a de plantas jovens de Carapa guianensis e de Dipteryx odorata submetidas a dois ambientes de luz

Espécies arbóreas tropicais estão quase sempre sob alta irradiância na Amazônia. O elevado fluxo energético pode ser decisivo para o sucesso ou fracasso no estabelecimento inicial das plantas no campo. O objetivo deste trabalho foi investigar as respostas de plantas jovens de andiroba (Carapa guianensis Aubl) e cumaru (Dipteryx odorata (Aublet) Willd) expostas a dois ambientes de luz (sombra e sol). O experimento foi conduzido em Manaus-AM, Brasil (3º8'S, 59º52'W). As análises dos transientes da fluorescência da clorofila a e os parâmetros relacionados foram obtidos em folhas intactas e saudáveis no período entre 10:00 e 12:00h. A curva OJIP indicou que ambas as espécies expostas à alta irradiância apresentaram fotoinibição após 45 dias de experimento. Plantas de andiroba e cumaru expostas ao sol exibiram menores valores de TRo/ABS (7,17 e 20,4%, respectivamente), ETo/TRo (14,5 e 27,2%, respectivamente) e ETo/ABS (20,6 e 42,2%, respectivamente) e maiores valores de DIo/ABS (26,9 e 43,0%, respectivamente), comparadas com plantas exposta à sombra. Quanto ao fluxo fenomenológico, para a maioria dos parâmetros, menores valores foram observados para ambas as espécies expostas ao sol. Plantas de andiroba e cumaru expostas ao sol exibiram valores menores de PI ABS (63,3 e 78,7%, respectivamente) comparadas com plantas expostas à sombra no final do experimento. Apesar de ambas as espécies terem sofrido com o estresse por alta irradiância, plantas de andiroba apresentaram melhores desempenhos do que plantas de cumaru, sendo, portanto, melhor indicadas para uso em plantio de produção ou de recuperação de áreas degradadas.