Avaliação da eficiência de microscópios de fluorescência confocais

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Biomédica. A presente dissertação foi desenvolvida em colaboração com o Instituto Gulbenkian de Ciência

De entre os vários métodos de microscopia actualmente utilizados em biologia celular o que tem sido mais desenvolvido é a microscopia de fluorescência confocal, pois permite detectar de forma específica e obter visualizações tridimensionais de proteínas e organelos celulares. Nesta técnica, a eficiência de captação da luz do microscópio é de importância capital, isto porque as amostras fluorescentes observadas geralmente são de fraca emissão e a exposição a demasiada luz de excitação pode danificá-las. Este trabalho tem como objectivo o desenvolvimento de uma aplicação informática que, a partir da análise de imagens obtidas e de uma caracterização prévia da amostra utilizada,atribua uma determinada eficiência para uma gama de comprimentos de onda, permitindo assim a medição e monitorização do desempenho de microscópios. Consequentemente, construiu-se um sistema auto emissor simples e calibrado para ser utilizado como amostra e desenvolveu-se procedimentos de análise de imagem que quantificassem a luz detectada. Os valores de eficiência obtidos encontram-se dentro do esperado, tendo em conta as limitações inerentes dos componentes ópticos e do fotomultiplicador. Testes efectuados no microscópio de fluorescência confocal Leica SP5, utilizando a fonte de luz e os procedimentos concebidos, demonstram que a eficiência de detecção fotónica permanece constante para diferentes ampliações e para diferentes ganhos do detector. É ainda demonstrado como este sistema pode ser utilizado para verificar a resposta espectral de microscópios de fluorescência confocais.