Desenvolvimento de um método de análise quantitativa de concentração celular e PHB por microscopia de fluorescência e análise de imagem

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química e Bioquímica

O objectivo principal deste trabalho é o desenvolvimento de uma técnica de análise de imagem que permita a determinação da concentração celular e da concentração de PHB em amostras retiradas de fermentações experimentais para produção de PHB com culturas puras de E.coli recombinante. Foram estudados vários métodos de conservação das células e, também, a sua influência na qualidade das imagens obtidas. O método de conservação que apresentou melhores resultados foi a fixação das amostras com 5% final de formaldeído. Determinou-se ainda que uma concentração de DAPI de 10 μg/ml era adequada para obter imagens com boa qualidade e desenvolveu-se com sucesso um método de double-staining com DAPI e Azul de Nilo para determinar a concentração de biopolímero através de análise de imagem sem ser necessário recorrer a pares de amostras. Foi desenvolvido um método de análise de imagem baseado na aplicação CellC, escrita em linguagem MatLab, para determinar a concentração celular e a concentração volumétrica de biopolímero através de análise de imagem, sendo monitorizadas cinco fermentações para desenvolver e testar o método. Determinou-se ainda que não existe uma relação linear entre o número de diluições prévias a fazer às amostras, de forma a obter um número razoável de células por campo, e os valores de densidade óptica a 600nm e de peso seco, sendo que, no entanto, para determinadas gamas destes valores se observou uma relação logarítmica. A relação observada foi utilizada em experiências posteriores e permitiu uma diluição adequada das amostras. Verificou-se que para a determinação da concentração celular através de análise de imagem, a evolução da concentração celular ao longo do tempo foi semelhante aos resultados obtidos através de medidas de densidade óptica a 600nm e pesos secos. Os resultados obtidos para a concentração de PHB após análise de imagem comportaram-se de forma semelhante aos obtidos através de cromatografia gasosa, demonstrando que o método desenvolvido pode ser utilizado para quantificação volumétrica do biopolímero. Em suma, neste trabalho desenvolveu-se com sucesso uma técnica de análise de imagem que permite determinar as concentrações celular e volumétrica de biopolímero, tendo em vista os propósitos inicialmente estabelecidos.