Release of Bet v 1 from Birch Pollen 1 from 5 European 2 Countries. Results from the HIALINE Study

Exposure to allergens is pivotal in determining sensitization and allergic symptoms in individuals. Pollen grain counts in ambient air have traditionally been assessed to estimate airborne allergen exposure. However, the exact allergen content of ambient air is unknown. We therefore monitored atmospheric concentrations of birch pollen grain and the matched major birch pollen allergen Bet v 1 simultaneously across Europe within the EU-funded project HIALINE (Health Impacts of Airborne Allergen Information Network). Pollen count was assessed with Hirst type pollen traps at 10 l/min at sites in France, United Kingdom, Germany, Italy and Finland. Allergen concentrations in ambient air were sampled at 800l/min with a Chemvol high-volume cascade impactor equipped with stages PM>10μm, 10 μm>PM>2.5μm, and in Germany also 2.5 μm>PM>0.12μm. The major birch pollen allergen Bet v 1 was determined with an allergen specific ELISA. Bet v 1 isoform patterns were analyzed by 2D-SDS-PAGE blots and mass spectrometric identification. Basophil activation was tested in an FcεR1-humanized rat basophil cell line passively sensitized with serum of a birch pollen lmptomatic patient. Compared to 10 previous years, 2009 was a representative birch pollen season for all stations. About 90% of the allergen was found in the PM>10μm fraction at all stations. Bet v 1 isoforms pattern did not varied substantially neither during ripening of pollen nor between different geographical locations. The average European allergen release from birch pollen was 3.2 pg Bet v 1/pollen and did not vary much between the European countries. However, in all countries a >10-fold difference in daily allergen release per pollen was measured which could be explained by long range transport of pollen with a deviating allergen release. Basophil activation by ambient air extracts correlated better with airborne allergen than with pollen concentration. Although Bet v 1 is a mixture of different isoforms, its fingerprint is constant across Europe. Bet v 1 was also exclusively linked to pollen. Pollen from different days varied >10-fold in allergen release. Thus exposure to allergen is inaccurately monitored by only monitoring birch pollen grains. Indeed, a humanized basophil activation test correlated much better with allergen concentrations in ambient air than with pollen count. Monitoring the allergens themselves together with pollen in ambient air might be an improvement in allergen exposure assessment.

Variation of the Group 5 Grass Pollen Allergen Content of Airborne Pollen in Relation to Geographical Location and Time in Season

Allergies to grass pollen are the number one cause of outdoor hay fever. The human immune system reacts with symptoms to allergens from pollen. Objective: We investigated the natural variability in release of the major group 5 allergen from grass pollen across Europe. Methods: Airborne pollen and allergens were simultaneously collected daily with a volumetric spore trap and a high-volume cascade impactor at 10 sites across Europe for 3 consecutive years. Group 5 allergen was determined with a Phl p 5 specific ELISA in two fractions of ambient air: Particulate Matter (PM) >10μm and 10μm>PM>2.5μm. Mediator release by ambient air was determined in FcεR1-humanized basophils. Origin of pollen was modeled and condensed to pollen potency maps. Results: On average grass pollen released 2.3 pg Phl p 5/pollen. Allergen release per pollen (potency) varied substantially, ranging from 0 to 9 pg Phl p 5/pollen (5 to 95% percentile). The main variation was locally day-to-day. Average potency maps across Europe varied between years. Mediator release from basophilic granulocytes correlated better with allergen/m3 (r2=0.80, p<0.001) than with pollen/m3 (r2=0.61, p<0.001). In addition, pollen released different amounts of allergen in the nonpollen bearing fraction of ambient air depending on humidity. Conclusion: Across Europe, the same amount of pollen released substantially different amounts of group 5 grass pollen allergen. This variation in allergen release is on top of variations in pollen counts. Molecular aerobiology, i.e. determining allergen in ambient air, may be a valuable addition to pollen counting.

Adipose stromal vascular fraction cell sheets as vascular strategies for tissue engineering and regenerative medicine applications

Tese de mestrado em Engenharia Biomédica e Biofísica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015

Activities of an aqueous plant extract against Herpes simplex virus type 2 (HSV 2): role in virus replication and progeny yield

Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015

Characterization of adenosinergic system in Rett syndrome

Tese de mestrado, Neurociências, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2015

The effect of melanocortin peptides on Interleukin 1-beta induced chondrocyte cell death and inflammation

ntroduction: Osteoarthritis (OA) is a degenerative joint disease affecting more than 8.5 million people in the UK. Disruption in the catabolic and anabolic balance, with the catabolic cytokine Interleukin 1 beta (IL-1β) being involved in the initiation and progression of OA (1). Melanocortin peptides (α-MSH and D[Trp8]-γ-MSH) exert their anti-inflammatory effects via activation of melanocortin receptors (MC), with both MC1 and MC3 being identified as promising candidates as novel targets for OA (2). This study aims to assess the chondroprotective and anti-inflammatory effects of the pan melanocortin receptor agonist α-MSH and MC3 agonist D[Trp8]-γ-MSH following IL-1β chondrocyte stimulation. Methods: RT-PCR/ Western Blot: Human C-20/A4 chondrocytic cell-line were cultured in 6 well plates (1x106 cells/well) and harvested to determine MC and IL-1β expression by RT-PCR, and Western Blot. Cell-Culture: Cells were cultured in 96 well plates (1x106 cells/well) and stimulated with H2O2 (0.3%), TNF-α (60 pg/ml) or IL-1β (0-5000pg/ml) for 0-72h and cell viability determined. Drug Treatment: In separate experiments cells were pre-treated with 3 μg/ml α-MSH (Sigma-Aldrich Inc. Poole, UK), or D[Trp8]-γ-MSH (Phoenix Pharmaceuticals, Karlsrhue, Germany) (all dissolved in PBS) for 30 minutes prior to IL-1β (5000pg/ml) stimulation for 6-24h. Analysis: Cell viability was determined by using the three cell viability assays; Alamar Blue, MTT and the Neutral Red (NR) assay. Cell-free supernatants were collected and analysed for Interleukin -6 (IL-6) and IL-8 release by ELISA. Data expressed as Mean ± SD of n=4-8 determination in quadruplicate. *p≤ 0.05 vs. control. Results: Both RT-PCR, and Western Blot showed MC1 and MC3 expression on C-20/A4 cells. Cell viability analysis: IL-1β stimulation led to a maximal cell death of 35% at 6h (Alamar Blue), and 40% and 75% with MTT and Neutral Red respectively at 24h compared to control. The three cell viability assays have different cellular uptake pathways, which accounts for the variations observed in cell viability in response to the concentration of IL-1β, and time. Cytokine analysis by ELISA: IL-1β (5000pg/ml) stimulation for 6 and 24h showed maximal IL-6 production 292.3 ±3.8 and 275.5 ±5.0 respectively, and IL-8 production 353.3 ±2.6 and 598.3 ±8.6 respectively. Pre-treatment of cells with α-MSH and D[Trp8]-γ-MSH caused significant reductions in both IL-6 and IL-8 respectively following IL-1β stimulation at 6h. Conclusion: MC1/3 are expressed on C-20/A4 cells, activation by melanocortin peptides led to an inhibition of IL-1β induced cell death and pro-inflammatory cytokine release.

Accessing Planktothrix species diversity and associated toxins using quantitative real-time PCR in natural waters

Tese de Doutoramento em Biologia apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, 2015.

Celiac disease detection using a transglutaminase electrochemical immunosensor fabricated on nanohybrid screen-printed carbon electrodes

Celiac disease is a gluten-induced autoimmune enteropathy characterized by the presence of tissue tranglutaminase (tTG) autoantibodies. A disposable electrochemical immunosensor (EI) for the detection of IgA and IgG type anti-tTG autoantibodies in real patient’s samples is presented. Screen-printed carbon electrodes (SPCE) nanostructurized with carbon nanotubes and gold nanoparticles were used as the transducer surface. This transducer exhibits the excellent characteristics of carbon–metal nanoparticle hybrid conjugation and led to the amplification of the immunological interaction. The immunosensing strategy consisted of the immobilization of tTG on the nanostructured electrode surface followed by the electrochemical detection of the autoantibodies present in the samples using an alkaline phosphatase (AP) labelled anti-human IgA or IgG antibody. The analytical signal was based on the anodic redissolution of enzymatically generated silver by cyclic voltammetry. The results obtained were corroborated with a commercial ELISA kit indicating that the electrochemical immunosensor is a trustful analytical screening tool.

Os factores influenciadores do consumo de produtos nacionais em Portugal

Dissertação apresentada à Escola Superior de Comunicação Social como parte dos requisitos para obtenção de grau de mestre em Publicidade e Marketing.

Auditoria à gestão de resíduos industriais

A presente dissertação foi realizada em colaboração com o grupo empresarial Monteiro, Ribas, tendo como principal objectivo a realização de uma auditoria à gestão dos resíduos industriais produzidos pelas suas fábricas localizadas na Estrada da Circunvalação, no Porto. Para cumprir este objectivo, inicialmente foi efectuado um levantamento das obrigações legais relativas aos resíduos e foram procuradas práticas aconselhadas para a gestão interna. Para cada uma das fábricas, verificaram-se, quais os resíduos produzidos e analisaram-se os seus percursos, considerando as suas origens, os locais e modos de acondicionamento na origem, os modos de transporte interno, os locais e modos de armazenagem preliminar, e ainda, as quantidades produzidas, os transportadores, os operadores finais e as operações finais de gestão, sendo que estas quatro últimas informações são relativas ao ano 2013. De seguida procedeu-se à realização da auditoria nas diferentes unidades, verificando o cumprimento dos requisitos legais e das boas práticas em matéria de gestão de resíduos. As principais não conformidades detectadas, comuns às várias unidades fabris foram a inexistência de local/recipiente definido para acondicionamento de alguns resíduos, a falta ou insuficiente identificação de recipientes/zonas de acondicionamento, a inexistência de bacias de retenção para resíduos líquidos perigosos, o facto de no transporte interno apenas os resíduos perigosos serem cobertos e, os resíduos líquidos perigosos não serem transportados sobre bacias de retenção móveis nem com o material necessário para absorver derrames. Para cada resíduo e para cada unidade industrial foram propostas medidas correctivas e/ou de melhoria, quando aplicável. Relativamente à armazenagem preliminar, a principal inconformidade detectada foi o facto de todos os parques (quatro) possuírem resíduos perigosos no momento das auditorias, o que não é adequado. Foram propostas medidas correctivas e/ou de melhoria para cada parque. Como proposta global, tendo em conta factores económicos e de segurança, sugeriu-se que apenas o parque de resíduos perigosos possa armazenar este tipo de resíduos, pelo que os procedimentos de transporte interno devem ser melhorados, fazendo com que estes resíduos sejam transportados directamente para o parque de resíduos perigosos. Desta forma dois dos parques devem sofrer algumas remodelações, nomeadamente serem cobertos e fechados, ainda que não totalmente, e o parque de resíduos perigosos deve ser fechado, mantendo aberturas para ventilação, deve ser equipado com kit´s de contenção de derrames, fichas de segurança, procedimentos a realizar em caso de emergência, e ainda, devido ao facto do sistema de contenção de derrames ser pequeno face ao total de armazenamento, aconselha-se o uso de bacias de retenção para alguns dos recipientes de resíduos líquidos perigosos. Ao longo deste processo e em consequência da realização da auditoria, algumas situações consideradas não conformes foram sendo corrigidas. Também foram preparadas instruções de trabalho adequadas que serão posteriormente disponibilizadas. Foi ainda elaborada uma metodologia de avaliação de processos como base de trabalho para redução dos resíduos gerados. A etapa escolhida para a aplicação da mesma foi uma etapa auxiliar do processo produtivo da Monteiro, Ribas - Revestimentos, S.A - a limpeza de cubas com solventes, por forma a tentar minimizar os resíduos de solventes produzidos nesta operação. Uma vez que a fábrica já realiza a operação tendo em consideração medidas de prevenção e reutilização, a reciclagem é neste momento a única forma de tentar minimizar os resíduos de solventes. Foram então estudadas duas opções, nomeadamente a aquisição de um equipamento de regeneração de solventes e a contratação de uma operadora que proceda à regeneração dos resíduos de solventes e faça o retorno do solvente regenerado. A primeira opção poderá permitir uma redução de cerca de 95% na produção de resíduos de solventes e na aquisição de solvente puro, estimando-se uma poupança anual de cerca de **** €, com um período de recuperação do capital de cerca de 16 meses e a segunda pode conduzir a uma redução significativa na aquisição de solvente puro, cerca de 65%, e a uma poupança anual de cerca de **** €.

Análise do polimorfismo HLA/DR-DQ em Angolanos portadores de Diabetes Mellitus tipo I

A diabetes mellitus do tipo 1 (DM1) é o distúrbio endócrino-metabólico mais frequente em crianças. É uma doença autoimune resultado da destruição selectiva das células beta pancreáticas. A velocidade de destruição das células beta pode ser rápida em algumas pessoas e lenta em outras; esta última é típica de adulto é conhecido como diabetes autoimune latente em adulto (LADA). A sua etiologia envolve factores ambientais e genéticos, dos genes envolvidos a maior contribuição vem da região do genoma onde estão localizados os genes do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC). A combinação de diferentes alelos do sistema de antigénio leucocitário humano tipo II (HLAII) esta associada a susceptibilidade da doença e as principais molécula envolvidas são a DQ e DR. O estágio pré-clínico da doença se caracteriza pela presença de auto-anticorpos, sendo o anti-GAD o mais sensível nesta patologia. OBJECTIVO: Analizar a frequência dos polimorfismos HLA-DR/DQ em angolanos portadores de diabetes tipo 1, residentes em Luanda. O tipo de estudo adotado foi casocontrolo num universo de voluntários provenientes da consulta externa de hospitais e clínicas locais no período de outubro de 2012 a outubro 2013. A amostra biológica utilizada foi sangue total, tendo sido processada no laboratório LABGENE, da Faculdade de Medicina (FM) da Universidade Agostinho Neto (UNA). Os auto-anticorpos, anti-GAD, foram doseados pelo método de ELISA. O ADN genómico foi extraído à partir de sangue total periférico e tipagem genética foi realizada mediante PCR-SSP.O alelo DQB1*02 (DQ2/DQ2) (p=0,033, OR= 4, IC (1,2-13,3) foi associado a susceptibilidade da DM1; os alelos DQB1*06 (DQ6/DQ6) (p=0,000, OR=0,30, IC (0,17-0,54); *11 (p=0,011, OR=0,14, IC=0,032-0,62); *13 (p=0,006, OR=0,13, IC=0,049-0,588) e *15 (p=0,001, OR=0,044, IC=0,005-0,39) foram associados a proteção. Foi encontrado 29,2% de positividade para o anti-GAD, não houve associação significativa (p=0,69) entre a resposta positiva do anti-GAD e a idade. Não foi encontrada associação significativa (p=0,39) entre o tempo de diagnóstico e resposta humoral. Observou-se associação significativa entre os alelos de risco DQB1*02 (p=0.000) e resposta positiva para anti-GAD; da mesma maneira houve uma associação significativa para os alelos DQB1*06 (p=0,002), DRB1*11 (p=0,048); *13 (p=0,004) e *15 (p=0,021) e a resposta negativa do anti-GAD.Os dados demostram o forte envolvimentos do gene HLA-II (DQ) com a suceptibilidade a DM1 e sugere que a autoimunidade se desenvolve na presença de susceptibilidade genética, quer dizer, em associação com alelos HLA-II específicos.

Metalearner based on Dynamic Neural Network for Strategic Bidding in electricity Markets

The restructuring of electricity markets, conducted to increase the competition in this sector, and decrease the electricity prices, brought with it an enormous increase in the complexity of the considered mechanisms. The electricity market became a complex and unpredictable environment, involving a large number of different entities, playing in a dynamic scene to obtain the best advantages and profits. Software tools became, therefore, essential to provide simulation and decision support capabilities, in order to potentiate the involved players’ actions. This paper presents the development of a metalearner, applied to the decision support of electricity markets’ negotiation entities. The proposed metalearner executes a dynamic artificial neural network to create its own output, taking advantage on several learning algorithms implemented in ALBidS, an adaptive learning system that provides decision support to electricity markets’ players. The proposed metalearner considers different weights for each strategy, depending on its individual quality of performance. The results of the proposed method are studied and analyzed in scenarios based on real electricity markets’ data, using MASCEM - a multi-agent electricity market simulator that simulates market players’ operation in the market.

PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ANTIGÉNIOS DE Fasciola gigantica E SUA AVALIAÇÃO NO IMUNODIAGNÓSTICO DE FASCIOLOSE

O diagnóstico da fasciolose é feito principalmente por métodos serológicos, devido ao polimorfismo do quadro clínico e à baixa sensibilidade dos métodos parasitológicos. Contudo, estes métodos apresentam algumas limitações, pelo que a melhoria dos testes imunológicos, nomeadamente, a utilização de antigénio homólogo, pode ser um factor relevante para a especificidade do diagnóstico. Este estudo teve como objectivo a produção e avaliação de antigénios total e deslipidizado de F. gigantica no imunodiagnóstico da fasciolose pelos métodos de Micro-ELISA e Western-blot, em comparação com os de F. hepatica. Foram analisados 111 soros de indivíduos cabo-verdianos e 67 de indivíduos residentes em Portugal, de ambos os sexos, com suspeita clínica de fasciolose. Os antigénios, total e deslipidizado, foram produzidos a partir de vermes adultos de F. gigantica recolhidos de bovinos na ilha de Santiago (Cabo Verde). Os antigénios totais das duas espécies de Fasciola apresentaram a mesma sensibilidade (100%), mas a especificidade foi superior para o antigénio total de F. gigantica (95,2%), na detecção de IgG. À semelhança dos antigénios totais, os deslipidizados demonstraram uma sensibilidade de 100%. Contudo, a especificidade foi superior (95,2%) quando se utilizou o antigénio deslipidizado de F. hepatica em relação à obtida com F. gigantica, cujo valor foi de 90,5%. Quanto à detecção de IgM anti-Fasciola, os valores de sensibilidade e especificidade foram de 97% e 90,5%, respectivamente, para os antigénios totais dos dois parasitas. Na pesquisa de IgM anti-parasita, as sensibilidades foram 94% e 83% para os antigénios deslipidizados de F. gigantica e F. hepatica, respectivamente, com uma especificidade de 90,5% para ambos os antigénios deslipidizados. No Immunobloting, a fracção antigénica de 24 kDa foi comum nas quatro preparações antigénicas, quer para IgM quer para IgG anti-Fasciola, pelo que a sua caracterização poderá ser relevante para o desenvolvimento de métodos com maior especificidade e reprodutibilidade, melhorando significativamente o diagnóstico. A banda de 26 kDa, presente apenas no antigénio total de F. gigantica, parece ser específica deste parasita. Este facto leva-nos a concluir que esta banda poderá ser objecto de mais estudos, no sentido de vir a ter-se um diagnóstico diferencial entre as duas espécies de Fasciola.