Characterization of adenosinergic system in Rett syndrome

Tese de mestrado, Neurociências, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2015

A Síndrome de Rett (RTT) é uma doença rara do neurodesenvolvimento e de causa genética que afeta cerca de 1:10000 raparigas em todo o mundo. Esta doença caracteriza-se por um aparente normal desenvolvimento até aos 6 a 18 meses de idade, seguido de uma fase de regressão, na qual ocorre a perda das capacidades já adquiridas. Entre outros sintomas, destacam-se: severa disfunção cognitiva e motora, epilepsia e aparecimento de movimentos estereotipados e repetitivos das mãos com progressiva perda da sua funcionalidade. Estudos genéticos mostraram que esta síndrome se deve, maioritariamente, a mutações no gene methyl CpG binding protein 2 (MECP2) localizado no cromossoma X. Este gene codifica a proteína MeCP2, um modulador epigenético e regulador da estrutura da cromatina, com funções primordiais no desenvolvimento e maturação do Sistema Nervoso Central (central nervous system - CNS). Uma das proteínas cuja expressão é controlada pela MeCP2 é o fator neurotrófico derivado do cérebro (brain-derived neurotrophic factor - BDNF), conhecido pelas suas importantes funções na maturação e diferenciação celular, plasticidade sináptica e sobrevivência neuronal. Consequentemente, alterações na MeCP2 podem comprometer os níveis de expressão e função do BDNF. Estudos em modelos animais, que reproduzem a maioria dos sintomas característicos da RTT, demonstraram que o aumento da expressão do BDNF consegue reverter parcialmente algumas das disfunções e sintomas desta síndrome. Contudo, o uso terapêutico de BDNF não é ainda exequível uma vez que a barreira hematoencefálica (blood-brain barrier - BBB) é impermeável a este fator neurotrófico, impedindo-o de chegar ao cérebro e desempenhar adequadamente as suas funções. Na tentativa de facilitar os efeitos do BDNF, têm-se desenvolvido novas estratégias envolvendo, por exemplo, a utilização de fármacos que atravessando a BBB potenciem a ação neuroprotetora do BDNF. Um dos fármacos que tem merecido particular atenção é a adenosina. A adenosina é um neuromodulador do CNS que exerce as suas funções através da ativação de quatro recetores, A1, A2A, A3 e A2B. Em particular, a ativação dos recetores A2A é fulcral para a manutenção dos níveis de BDNF e do seu recetor, TrkB-FL, assim como para os seus efeitos sinápticos. É de realçar que, o sistema adenosinérgico, para além de ser crucial na sinalização mediada pelo BDNF, também tem um papel de destaque no controlo da excitabilidade sináptica através da ativação dos recetores inibitórios do tipo A1, reconhecidos como potenciais alvos terapêuticos no controlo da epilepsia. Estas ações da adenosina sugerem a possibilidade de este neuromodulador também estar afetado na RTT. De facto, estudos preliminares, realizados no nosso laboratório, apontam para a existência de uma disfunção do sistema adenosinérgico em associação à desregulação já conhecida da sinalização mediada pelo BDNF na RTT. Assim, este projeto teve como principal objetivo fazer a caracterização detalhada do sistema adenosinérgico e da sinalização mediada pelo BDNF, através da utilização de: 1) modelo animal, ratinho mutante Mecp2 knockout (KO); 2) modelo humano, neurónios derivados de células pluripotentes induzidas humanas (human induced pluripotent stem cells - hIPSCs) de pacientes com RTT e 3) tecido cerebral humano recolhido durante autópsia realizada a paciente com RTT. Ensaios de ligação anteriormente realizados já tinham mostrado um aumento dos níveis proteicos dos recetores A1 em amostras de córtex cerebral de ratinhos Mecp2 KO quando comparado com amostras de ratinhos WT, não havendo alterações na expressão do seu mRNA. No presente trabalho, ensaios de Western-Blot revelaram uma diminuição significativa dos recetores do tipo A2A no córtex cerebral dos ratinhos Mecp2 KO, não tendo sido contudo, detetadas alterações nos níveis de expressão do mRNA avaliados por polimerase chain reaction (PCR) quantitativo. Curiosamente, registos eletrofisiológicos realizados no hipocampo destes animais sugerem uma diminuição dos níveis de adenosina endógena, que não é atribuível a variações nos níveis proteicos de um dos enzimas responsáveis pela degradação da adenosina, adenosina cinase (Adenosine Kinase - ADK). No modelo animal, os resultados, obtidos por ELISA, confirmaram que os níveis proteicos de BDNF estão bastante diminuídos. Semelhante resultado foi obtido para os níveis dos seus recetores TrkB-FL quando avaliados pela técnica de Western Blot, não havendo, contudo, alterações significativas nos recetores truncados deste fator neurotrófico (TrkB-Tc). No entanto, os níveis de expressão de mRNA para as duas isoformas do recetor TrkB (TrkB-FL e TrkB-T1 – isoforma truncada) não mostraram alterações significativas. Em neurónios derivados de hIPSCs, a avaliação dos recetores adenosinérgicos (A1 e A2A), do BDNF e dos recetores TrkB, efetuada através de PCR quantitativo, demonstrou uma considerável variabilidade, não sendo por isso possível fazer uma comparação com os resultados obtidos no modelo animal. Relativamente ao estudo dos níveis proteicos de BDNF, neste modelo, observou-se uma tendência para aumento e, pelo contrário, registou-se uma tendência para diminuição dos níveis de expressão dos seus recetores. Os resultados obtidos a partir da amostra de córtex temporal de uma paciente com RTT mostraram um aumento da expressão de mRNA dos recetores A1 e uma diminuição da expressão de mRNA dos recetores A2A. No que respeita aos recetores TrkB, observou-se um aumento da expressão do mRNA que codifica para o recetor TrkB-FL. Não se observou contudo alteração no mRNA para o recetor TrkB-T1. Em associação, não foi observada alteração na expressão de mRNA que codifica para o BDNF. Neste trabalho, o maior problema encontrado foi a variabilidade observada, não só entre as linhas celulares provenientes de indivíduos do mesmo género, como também entre as rondas independentes de diferenciação da mesma linha parental. Parte dessa variabilidade pode estar relacionado com as múltiplas alterações genéticas e epigenéticas que ocorrem durante os procedimentos de reprogramação e de diferenciação, tais como a fixação de mutações aleatórias esporádicas e a inativação aleatória do cromossoma X em linhas femininas. Uma outra importante fonte de variabilidade é a eficiência da produção de neurónios corticais, que é propensa a flutuar comprometendo os resultados. Ainda que alguns resultados mostrem tendências concordantes entre os modelos estudados, é difícil retirar conclusões a partir destes, o que é ainda mais agravado pelo reduzido tamanho da amostra. Globalmente, os resultados apontam para uma disfunção na sinalização mediada quer pelo BDNF quer pelo sistema adenosinérgico, sugerindo um possível envolvimento de ambos na fisiopatologia da doença. Estas evidências abrem novas perspetivas para a intervenção farmacológica nesta patologia.

Rett Syndrome (RTT) is a genetic neurodevelopmental disorder, with an incidence of 1:10,000 female live births. This disorder is the main genetic cause of intellectual disability in females and it is mainly caused by mutations in the methyl-CpG binding protein 2 (MECP2) gene. The MeCP2 protein, codified by the MECP2 gene, is an epigenetic modulator that controls chromatin structure. This protein is known to modulate the expression of brain-derived neurotrophic factor (BDNF), a neurotrophin with essential functions in cell differentiation, synaptic plasticity and survival. Furthermore, BDNF overexpression can partially ameliorate some RTT associated symptoms. Thus, therapeutic strategies designed at delivering BDNF to the brain could be a breakthrough for RTT. However, this strategy has been hampered by the inability of BDNF to cross the blood-brain barrier (BBB). The development of new therapeutic strategies is, therefore, of the outmost importance. The adenosine is a neuromodulator that acts through the activation of four different receptors: A1R, A2AR, A2BR and A3R. The two most well characterized receptors in the brain are the A1R and A2AR and their manipulation has been suggested for the treatment of several neurological pathologies. Given that, the activation of A2AR is known to potentiate BDNF synaptic actions in healthy animals, one could anticipate that the activation of these adenosine receptors could be a potential therapeutic strategy. On the other hand, most of RTT patients have epilepsy, a pathology where adenosine system might be affected. However, until recently, there was no available information about the contribution of the adenosinergic system to the pathophysiology of RTT. To overcome this gap in knowledge, our lab has developed a new line of research on this topic. The main goal of this project was to further characterize both the adenosinergic system and the BDNF signalling in RTT. This goal was achieved by using: i) a well-established animal model, Mecp2 KO mice; ii) human RTT model, neurons-derived from RTT patients induced pluripotent stem cells (IPSCs) and iii) post-mortem human brain samples from a RTT patient. Even though we found some concordant tendencies between the human and the mouse models, given the high variability observed in the human material, no clear conclusions can be drawn. This is certainly aggravated by the small sample size that, in the future, could be solved by increasing not only the number of patient-derived hIPSCs lines but also by increasing the amount of independent rounds of differentiation. The availability of more post-mortem samples would also be an important asset. Overall, the here presented results clearly show a dysfunction in BDNF signalling and in the adenosinergic system, suggesting that both systems are involved in the pathophysiology logy of the disorder. These evidences open new pharmacological avenues for the treatment of RTT.