Activities of an aqueous plant extract against Herpes simplex virus type 2 (HSV 2): role in virus replication and progeny yield

Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015

Herpes simplex virus type 2 (HSV-2) is widely distributed through the human population, infecting more than 500 million people globally. Although causing generally mild infections this virus may cause severe symptoms occasionally, mainly in immunocompromised patients. Presently, there are a number of systemic antiviral agents against herpesvirus, the most commonly used being acyclovir (ACV) and its prodrugs. However, long term treatments with these drugs may result in the development of resistance, especially in immunocompromised patients, which leads to a continuous search for new and better therapeutic alternatives. According to the World Health Organization (WHO) plants would be the best sources for obtaining a wide variety of drugs. In fact, in the last decades many pharmacological and chemical studies have focused on medicinal plants and the discovery of new natural therapeutic compounds. In this study the anti-herpetic action of an aqueous extract was evaluated. The product was obtained by decoction of stem and leaves from Solidago virgaurea, a perennial herb member of the Asteraceae family. The study of the aqueous extract activity included a preliminary evaluation of its cytotoxicity in Vero cells – by the MTT assay - in the same conditions that are applied for viral production. Extract direct effect on viral particles – virucidal effect – was also assessed, having proved null. Anti-herpetic activity was investigated through two kinds of experiments: treatment of infected cells during virus production that revealed a mean yield reduction of 94 % in treated relatively to non-treated cells and an IC50 of 35.1 μg/mL; and treatment of infected cells during virus titration, which revealed slighter inhibition but significant size differences between virus plaques formed in treated and control conditions (smaller in treatment conditions). To further evaluate the mechanisms that mediate the aqueous extract inhibitory effect, infected cells – treated and non-treated - and virus particles – produced in treated and non-treated cells - were visualized through Transmission Electron Microscopy (TEM), revealing less damage due to infection in treated cells and a reduced amount of viral particles in HSV-2 suspensions produced in treated cells, relatively to controls. A kinetic of the first hours of the infection was performed with and without treatment, to assess possible differences in DNA production. Extracted samples were subjected to qPCR and results showed that the amount of viral DNA raises significantly slower in treated versus non-treated infected cells, throughout the infection. This is consistent with the effective reduction of the extract when added at later infection times - 4-6 h p.i. - when DNA replication is already in an advanced stage. Our results suggest that the aqueous extract inhibits HSV-2 replication, when present at the beginning of the infection, possibly by interfering with the viral DNA synthesis.

O vírus Herpes simples tipo 2 (HSV-2) é um vírus de simetria icosaédrica e grandes dimensões, pertencente à família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae da ordem Herpesvirales. Infecta mais de 500 milhões de pessoas em todo o mundo, surgindo, em cada ano, mais de 20 milhões de casos. A sua prevalência é geralmente mais elevada entre mulheres do que homens e varia substancialmente entre diferentes regiões do globo, alcançando os mínimos na Europa Ocidental - 18 % para mulheres e 13 % para homens – e percentagens máximas na África Subsaariana – 70 % para mulheres e 55 % para homens. O HSV infecta as células da mucosa oral ou genital e tem a capacidade de infetar as dendrites e os gânglios sensoriais que enervam estes tecidos onde estabelece latência. Estas infeções causam normalmente patologias ligeiras – gengivite, herpes labialis ou herpes genitalis – podendo até ser assintomáticas. Porém, infeções com HSV-2 podem causar complicações sérias a nível ocular - sendo a primeira causa de cegueira devida a infeção no mundo Ocidental -, neurológico - causando meningites e encefalites, especialmente comuns em neonatos – e dermatológico. Estas patologias mais severas, associadas à infeção com HSV, ocorrem com maior frequência em pacientes imuno-comprometidas, nomeadamente em indivíduos HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana) positivos. Aliás, a infeção com HSV-2 aumenta 3 a 4 vezes a probabilidade de adquirir HIV e a sua disseminação, sendo esta relação recíproca, uma vez que pacientes HIV positivos têm maior probabilidade de adquirir HSV-2 e sofrem mais reativações da infeção. Atualmente, existem vários agentes com atividade antiviral contra HSV, como o Aciclovir (ACV) e as suas pró-drogas, no entanto, tratamentos prolongados com estes compostos podem resultar no desenvolvimento de resistência. De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS) as plantas são a melhor fonte para a obtenção de novas drogas e, nas últimas décadas, as plantas medicinais têm sido alvo de vários estudos químicos e farmacológicos. Neste estudo foi avaliado o efeito anti-herpético do extrato aquoso de Solidago virgaurea, uma planta perianal, membro da família Asteraceae. O extrato utilizado foi obtido por decocções de caules e folhas de S. virgaurea e a solução stock foi preparada a 100 mg/mL em DMSO. Antes de ser sujeito a testes de actividade anti-herpética foi ensaiado o efeito do extracto aquoso na viabiliade de células hospedeiras não infectadas, através do método do MTT – um ensaio colorimétrico que se baseia na capacidade de reduzir metabolicamente o sal de tetrazolio das células viáveis. Para isso culivaram-se células Vero em placas de 96 poços – em meio de cultura com FBS (Soro Fetal Bovino) a 10 % – até à sub-confluência. O meio de cultura foi depois substituido por meio com FBS a 2 % e diferentes concentrações de extracto (25 - 250 μg/mL), ou meio com FBS a 2 % sem adição de extrato no caso dos testemunhos, e as placas foram incubadas 24 ou 48 horas a 37 °C. No final do período de tratamento fez-se o teste do MTT para determinação da viabilidade das culturas tratadas, por comparação com as culturas não tratadas. Os conteúdos de cada poço da P96 foi analisado espectofotometricamente num leitor de placas Elisa. Para caracterizar a actividade citotóxica do extracto foram comparadas as absorvâncias obtidas em poços com células tratadas e relação a células não tratadas e determinaram-se os parametros CMNC (Concentração Máxima Não Citotóxica) - 150 μg/mL - e CC50 (Concentração que inviabiliza 50 % das células) – 177,3 μg/mL. O efeito directo do extracto nas partículas de HSV-2 foi testado através da comparação dos títulos de suspensões virais previamente tratadas com 100 μg/mL de extrato em meio com FBS a 2 % com os títulos de suspensões não tratadas. O extrato não demonstrou efeito virucida sobre partículas virais em suspensão, uma vez que os títulos das suspensões tratadas foram muito semelhantes aos títulos dos testemunhos. Para testar o efeito do extrato na formação de placas virais infetaram-se células, em placas de 24 poços, com diluições seriadas de HSV-2. Depois da entrada do vírus – 30 minutos pós infeção – os inóculos foram removidos e foi adicionado meio de cultura com FBS a 2 % com ou sem 100 μg/mL de extrato, às culturas tratadas e testemunho, respetivamente. No final do período de tratamento – 3 a 4 horas pós infeção (h p.i.) – foi adicionado meio com FBS e Sephadex a 2 %. A redução de título em culturas tratadas foi 71,6 ± 26,8 %, em relação às não tratadas. Foi ainda evidente uma redução no diâmetro das placas produzidas nas culturas tratadas. Foram também levadas a cabo várias experiências envolvendo a produção de vírus em condições de tratamento, em que culturas celulares sub-confluentes foram infetadas com cerca de 3 pfu/célula e tratadas com extrato em diferentes concentrações e durante diferentes períodos da infeção. Os títulos das suspensões produzidas em condições de tratamento foram comparados com os títulos dos testemunhos para o cálculo das percentagens de inibição. A redução média de título – com concentrações de extrato não citotóxicas – foi de 93,65 ± 8 %, relativamente a vírus produzido na ausência do extrato. Para determinar os parâmetros IC50 e IC90 (concentrações que reduzem o rendimento viral em 50 e 90 %, respetivamente) foram produzidas suspensões de HSV-2 em meio com FBS a 2 % e diferentes concentrações de extrato (10-175 μg/mL) que foram posteriormente tituladas. Os IC50 e IC90 foram calculados através de regressão linear da curva dose-resposta e foram 35,1 e 128,1 μg/mL, respetivamente. Para investigar a etapa da infeção afetada pelo extrato produziram-se suspensões de HSV-2 sob tratamento - com 100 μg/mL de extrato – iniciado em diferentes horas pós infeção. Foi observável uma redução da percentagem de inibição do extrato para cerca de 50 % em tratamentos começados entre as 3 e as 6 h p.i. e para 0 % a partir das 15 h p.i. Células infetadas tratadas e não tratadas, e partículas virais produzidas em ambas as condições, foram observadas por Microscopia Eletrónica de Transmissão (TEM), revelando a existência de menos danos, devidos à infeção, em células infetadas tratadas do que em não tratadas e uma quantidade significativamente menor de partículas de HSV-2 em suspensões virais produzidas em células tratadas, apesar dos viriões produzidos sob tratamento não apresentarem defeitos morfológicos. Por fim foi executada uma cinética da infeção em condições de tratamento (e uma cinética testemunho, em condições normais de produção viral), para tal, células infetadas – tratadas e não tratadas - foram raspadas para o meio de cultura a diferentes horas pós infeção – 2 a 7. O DNA de cada cultura infetada recolhida foi extraído, quantificado e submetido a PCR para a deteção de DNA viral. O resultado não permitiu visualizar diferenças significativas na quantidade de DNA de HSV-2 em células tratadas e não tratadas, mas mostrou um aumento considerável na quantidade de DNA a partir das 5 horas pós infeção. As mesmas amostras foram depois utilizadas para PCR em tempo real (qPCR) para avaliar possíveis diferenças na quantidade de DNA viral. O resultado mostrou que, embora nas horas iniciais – 3-4 h p.i. – as diferenças na quantidade de DNA sejam mínimas, entre amostras de DNA extraído de células tratadas e não tratadas, é visível um aumento muito mais lento no número de cópias de DNA viral ao longo da infeção em culturas tratadas do que em não tratadas, indicando que a replicação de DNA é afetada durante o tratamento com extrato aquoso de S. virgaurea.