Miocardiopatia hipertrófica: novas metodologias aplicadas ao diagnóstico genético

Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Desnaturação de alta resolução aplicada ao diagnóstico genético de miocardiopatia hipertrófica

Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Diagnóstico genético pré-implantacional de embriões equinos

O diagnóstico genético pré-implantacional de embriões equinos já é uma realidade nos Estados Unidos e Argentina. Embora o Brasil seja líder mundial de transferência de embriões equinos, essa tecnlogia ainda está em fase de desenvolvimento, com poucos grupos atuando nessa área no país. O objetivo do presente projeto foi desenvolver a metodologia de micromanipulação e identificação do sexo de embriões equinos a campo. Dessa forma, selecionamos sequências específicas para padronização laboratorial dos ensaios de PCR com amostras de DNA da espécie equina. Os primers que apresentaram maior sensibilidade foram selecionados para a realização da PCR em biópsias embrionárias. Além das análises de biologia molecular, foi desenvolvida a técnica de micromanipulação de embriões equinos. Foram realizadas 105 biópsias de embriões pela técnica de microaspiração, permitindo a identificação do sexo pela técnica de WGA (Whole Genome Amplification) e posteriormente PCR seguido de eletroforese. Os embriões sexados foram transferidos para receptoras sincronizadas, permitindo a avaliação da taxa de concepção dos embriões submetidos à biópsia. Além disso, um embrião foi biopsiado, vitrificado e sexado. Após a identificação do sexo (fêmea) o embrião foi desvitrificado e transferido em receptora criteriosamente selecionada, resultando em prenhez

Diagnóstico Neonatal de Síndrome de Prader-Willi

A síndrome de Prader-Willi tem uma prevalência aproximada de 1:25000 nascimentos. No período neonatal há hipotonia severa, atraso de crescimento e dificuldade alimentar que persistem durante o primeiro ano de vida. O quadro clínico inicial contrasta com a bulimia que se evidencia mais tarde e que, não controlada, pode conduzir à obesidade mórbida. Descrevem-se as características clínicas, o diagnóstico genético e os cuidados específicos a ter na promoção da saúde a propósito de cinco crianças com síndrome de Prader Willi, cujo diagnóstico foi feito no período neonatal.

Tecnologia de iplex massarray aplicado ao diagnóstico de miocardiopatia hipertrófica

A miocardiopatia hipertrófica (MH) é a doença cardíaca genética mais comum, afectando 1:500 indivíduos, apresentando um padrão de transmissão autossómico dominante, com mutações associadas a genes sarcoméricos e não sarcoméricos. A MH apresenta uma variedade de manifestações clínicas, desde indivíduosassintomáticos a indivíduos que manifestam uma progressão da severidade dos sintomas, podendo nalguns casos ocorrer morte súbita. O diagnóstico clínico é realizado por Electrocardiograma e Ecocardiograma. O diagnóstico genético baseia-se na Sequenciação Automática (SA) dos 5 principais genes sarcoméricos MYBPC3, MYH7, TNNT2, TNNI3 e MYL2, sendo considerada uma metodologia bastante dispendiosa e demorada e que não permite a identificação de mutações em cerca de 1/3 dos individuos. A Genotipagem por iPLEX MassARRAY revela-se uma boa alternativa à SA no diagnóstico genético de MH, uma vez que permite a análise de várias amostras em simultâneo, para um elevado número de mutações, num único ensaio, com uma maior rentabilidade de tempo e recursos. Este trabalho teve como objectivo a optimização e a validação desta metodologia, na detecção de 541 mutações em 33 genes, tendo-se verificado que 29 % das reacções multiplex necessitam de ser revistas, quer pelo desenho de novos conjuntos de primers, quer pela sua relocalização no chip.

Genética e mecanismos moleculares na miocardiopatia hipertrófica: papel dos genes CSRP3 e TCAP

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Caracterização do papel dos genes TYMS e MTR no desenvolvimento de Cancro Colo-Rectal

RESUMO: O cancro colo-rectal (CCR) é um dos cancros que possui maior taxa de mortalidade a nível mundial. Em Portugal esta patologia é responsável pela morte de cerca de 3700 pessoas por ano, sendo que estes números aumentam de ano para ano. Ao longo das últimas décadas o papel das alterações genéticas na etiologia das patologias oncológicas tem vindo a ter cada vez mais um maior destaque. O número de estudos que avaliam a importância de polimorfismos, mutações, alterações na regulação génica e interacções entre genes no desenvolvimento destas patologias tem aumentado exponencialmente. Com o aumento do conhecimento da forma como estas alterações influenciam o desenvolvimento do cancro surgiram os primeiros meios de diagnóstico genético, levando assim a uma alteração da forma como são encarados o diagnóstico e a prevenção destas doenças. No CCR as formas hereditárias com alterações genéticas inequivocamente identificadas representam apenas 5% dos casos. Existem cerca de 25% que representam formas hereditárias para as quais ainda não foram estabelecidos os padrões de alterações genéticas subjacentes. Desta forma, estudos que venham contribuir para um maior conhecimento dos mecanismos moleculares responsáveis pelo aumento da susceptibilidade dos indivíduos para o desenvolvimento de CCR são extremamente importantes. O CCR é uma patologia multifactorial, onde factores genéticos interagem com factores ambientais no surgimento e desenvolvimento da doença. Assim, torna-se essencial integrar o estudo das alterações genéticas no contexto ambiental onde os indivíduos em estudo se encontram. No caso desta patologia um dos principais factores ambientais estudado é a nutrição. Vários estudos têm sido realizados ao longo dos últimos anos de forma a compreender como pode a ingestão dos nutrientes influenciar o desenvolvimento de CCR e de que forma interage com as alterações genéticas individuais. O ciclo do folato é um dos processos metabólicos onde o papel da nutrição em interacção com alterações genéticas mais tem sido estudado nos últimos anos. Deste cruzamento entre o estudo das alterações genéticas e ambientais surge a Nutrigenética. O conjunto de estudos da presente tese tem como objectivo aumentar o conhecimento do papel das alterações em genes do ciclo do folato, em interacção com factores nutricionais e de estilo de vida, não só no desenvolvimento de CCR, mas também de outra patologia do tracto gastrointestinal, a Doença de Crohn (DC), uma doença inflamatória muitas vezes associada como factor de risco para o desenvolvimento de CCR. Este estudo debruçou-se essencialmente no estudo dos genes timidilato sintetase (TYMS) e metionina sintetase (MTR) em populações com CCR e DC, bem como no padrão nutricional destas populações com particular incidência nos nutrientes envolvidos no ciclo do folato (folato, metionina, vitamina B6, vitamina B12). Analisando o conjunto de resultados obtidos para os estudos do CCR podemos concluir que quer a TYMS quer a MTR possuem um papel relevante na susceptibilidade para desenvolver esta patologia, assim como têm destaque no funcionamento do ciclo celular durante o processo oncogénico. Os resultados demonstram que os factores que levam a uma menor disponibilidade de grupos metil no ciclo de folato (baixos níveis de folato, alteração da actividade de MTR, elevada expressão de TYMS) constituem factores de risco, muito provavelmente por contribuírem para uma desregulação dos níveis de metionina disponível para a metilação do DNA da célula. Demonstram ainda que em células tumorais ocorrem alterações na regulação do ciclo do folato de forma a favorecer a síntese de DNA em detrimento da metilação do mesmo, alterando para isso a expressão dos genes de forma a que o fluxo de grupos metil provenientes do folato sejam encaminhados para a enzima TYMS. O polimorfismo de deleção 6pb da TYMS surge como um factor de diagnóstico e de prognóstico de CCR para a população portuguesa. Dos factores nutricionais analisados apenas o folato aparenta ter um papel relevante na modelação do risco de desenvolver CCR. Na doença de Crohn (DC) podemos verificar que a homocisteína e o seu metabolismo poderão contribuir para o aparecimento e desenvolvimento da patologia. O aumento da homocisteína poderá ser o responsável por um aumento da resposta auto-imune do organismo, promovendo o aparecimento da DC. O polimorfismo A2756G MTR desempenha um papel preponderante como factor de diagnóstico da DC, tendo sido associado pela primeira vez a esta patologia. Tem também um papel importante no desenvolvimento da doença, uma vez que está associado a uma idade de diagnóstico mais baixa, sugerindo assim que o desenvolvimento da doença ocorre de forma mais precoce. Concluindo, com este estudo pensamos ter contribuído para um melhor entendimento do papel do ciclo do folato no desenvolvimento de CCR e DC, sendo um ponto de partida para futuras investigações que possam revelar cada vez melhor as complexas interacções metabólicas desta via e a sua influência nas patologias estudadas. Do nosso estudo destacamos a importância de uma análise global das várias etapas do ciclo do folato para que se possa compreender a dinâmica que se estabelece no desenvolvimento destas patologias, podendo diversas alterações, quer a nível genético quer a nível nutricional, exercerem efeitos diferentes consoante o estado dos restantes intervenientes do ciclo do folato. Acreditamos que no futuro este estudo permitirá que o conhecimento do ciclo do folato tenha cada vez mais uma relevância fundamental a nível de diagnóstico e terapêutica destas patologias.------------ ABSTRACT: Colorectal Cancer (CRC) is one of the cancers that have a higher rate of mortality worldwide. In Portugal this pathology is responsible for the deaths of about 3700 people per year, and these numbers increase each year. Over the past few decades the role of genetic changes in the etiology of oncological pathologies has had an increasingly greater emphasis. The number of studies that evaluate the importance of polymorphisms, mutations, changes in gene regulation and gene interactions in the development of these diseases has increased exponentially. With the increased knowledge of how these changes influence the development of cancer, appeared the first means for genetic diagnostic, leading to a change in the way diagnosis is seen and in the prevention of these diseases. In CRC the hereditary forms with clearly identified genetic changes represent only 5% of cases. There are about 25% representing hereditary forms for which the patterns of genetic changes haven’t been established. In this way, studies that will contribute to a greater understanding of the molecular mechanisms responsible for increased susceptibility of individuals to the CRC development are extremely important. CRC is a multifactorial pathology, where genetic factors interact with environmental factors in the emergence and development of the disease.Thus, it is essential to integrate the study of genetic changes in the environmental context of the individuals under study. In the case of this pathology one of the main environmental factors studied is nutrition. Several studies have been conducted over the past few years in order to understand how the intake of nutrients can influence the development of CRC and how nutrients interact with the individual genetic changes. The folate cycle is one of the metabolic processes where the role of nutrition in interaction with genetic alterations has been studied in recent years. This cross between the study of genetic and environmental changes developed Nutrigenetics. The set of studies of this thesis aims to increase awareness of the role of changes in genes of the folate cycle, in interaction with nutritional factors and lifestyle, not only in the development of CRC, but also of another pathology of the gastrointestinal tract, Crohn's disease (CD), an inflammatory disease often associated as a risk factor for the development of CRC. This study dealt mainly in the study of genes thymidylate synthase (TYMS) and methionine synthase (MTR) in populations with CRC and CD, as well as in the nutritional pattern of these populations with particular focus on nutrients involved in the folate cycle (folate, methionine, vitamin B6, vitamin B12). Analyzing the results obtained for the CRC studies we conclude that either the MTR TYMS have a relevant role in susceptibility to develop this pathology, and have an important role in the functioning of the cell cycle during oncogenesis. The results show that the factors that lead to a lower availability of methyl groups in folate cycle (low levels of folate, change the activity of MTR, high expression of TYMS) constitute risk factors, most likely by contribute to a dysregulation of methionine levels available for DNA methylation of the cell. Our results also demonstrate that in tumor cells occur changes in the regulation of the folate cycle in order to promote the synthesis of DNA, to the detriment of methylation of the same by changing the expression of genes so that the methyl groups from folate are forwarded to the TYMS enzyme reaction. The deletion polymorphism 6bp of TYMS emerges as a diagnostic and prognostic factor of CCR for the Portuguese population. Nutritional factors analyzed only folate appears to have a major role in modulating the risk of developing CCR.In Crohn’s disease (CD) we can check that homocysteine and its metabolism may contribute to the emergence and development of this pathology. Increased homocysteine may be responsible for an increase in the body's autoimmune response, promoting the emergence of CD. The polymorphism A2756G MTR plays a leading role as a factor of diagnosis of DC, having been associated with this pathology for the first time. It also has an important role in the development of the disease, since it is associated with a lower diagnostic age, suggesting that the development of the disease occurs earlier. In conclusion, our study has contributed to a better understanding of the role of folate cycle in the development of CRC and CD, being a starting point for future research that may prove increasingly complex metabolic interactions in this via and its influence on the pathologies studied. In our study we highlight the importance of a comprehensive analysis of the various steps of the folate cycle in order to understand the dynamics that settles in the development of these pathologies, and a number of amendments, whether at the genetic level or at the nutritional level, exercise different effects depending on the stage of the remaining participants in the folate cycle. We believe that in the future this study will allow the knowledge of folate cycle to have increasingly a fundamental relevance at the level of diagnosis and treatment of these diseases.

Avaliação diagnóstica da cardiomiopatia hipertrófica em fase clínica e pré-clínica

A cardiomiopatia hipertrófica é uma doença de origem genética e caráter familiar, causada por mutações em genes codificantes de proteínas do sarcômero. Determina hipertrofia ventricular esquerda de grau variável, geralmente difusa, com predominante acometimento do septo interventricular. A ocorrência de formas assintomáticas com hipertrofia segmentar, de grau leve ou ausente, dificulta o diagnóstico e o rastreamento de formas familiares. A penetrância elevada costuma ser incompleta, o que faz com que 20% a 30% dos adultos carreadores de mutações gênicas não expressem o fenótipo. A suscetibilidade à morte súbita e a possibilidade de expressão tardia tornam relevante o diagnóstico em fase pré-clínica. A investigação por meio do ecocardiograma Doppler e da ressonância magnética adicionada à análise detalhada do eletrocardiograma pode contribuir nesse processo. O diagnóstico genético-molecular identifica mutações em 60% a 80% dos casos. A complexidade, a demora e o elevado custo, aliados à insuficiente avaliação das relações genótipo/fenótipo restringem sua aplicação de rotina. O aprimoramento dos métodos de imagem e a introdução de técnicas moleculares mais simplificadas devem favorecer o diagnóstico clínico e pré-clínico da cardiomiopatia hipertrófica e possibilitar a futura introdução de medidas terapêuticas que possam impedir ou retardar o desenvolvimento da doença.

Habilidades de cognición social en niños y niñas con el síndrome de Down: resultados de un estudio preliminar

The understanding of false belief is one of the most important milestones in the development of social cognition in children. Many studies have been conducted on this kind of cognition in children with a typical development. Despite being a key point for improving their welfare and quality of life, there are few studies in children with Down's syndrome. The aim of the present work is to carry out an in-depth study of social cognition in children with Down's syndrome. For this purpose, we used 6 tasks, with 3 levels of difficulty, in a group of 9 children aged between 4 and 14 years. Six of these children had a genetic diagnosis of Down's syndrome. The results of our research corroborate previous studies suggesting difficulties in the development of social cognition in children with Down's syndrome, and more specifically in tasks involving false beliefs

Síndrome de Hadju-Cheney: alterações renais em um relato de caso

A síndrome de Hadju-Cheney é uma doença genética caracterizada por dismorfismos craniofaciais e alterações ósseas responsáveis pelo fenótipo da doença. As alterações renais, como cistos renais corticais, refluxo vesico - ureteral e falência renal, são raramente relatadas, mas são incluídas como apresentações menos comuns. O diagnóstico genético ainda não está disponível e a patogênese é relacionada a mutações no gene NOTCH. Os autores relatam um caso de um homem de 26 anos; porém, com características fenotípicas de um paciente pediátrico. Ele se apresentou com síndrome nefrótica, hipertensão arterial, cistos renais corticais e insuficiência renal aguda requerendo hemodiálise. A biopsia renal evidenciou glomeruloesclerose focal e segmentar e o tratamento para esse paciente foi de suporte com terapia hemodialítica. O diagnóstico da síndrome de Hadju-Cheney foi dado durante investigação do quadro renal.

Búsqueda de mutaciones en el gen foxo4 en pacientes con falla ovárica prematura no-sindrómica

FOXO4 constitutes a coherent candidate gene associated with premature ovarian failure (POF) pathogenesis. This study sequenced the coding and exon-flanking regions of this gene in a panel of 116 POF patients and 143 controls of Tunisian origin. In both groups, the IVS2 + 41T > G sequence variant was identified. It is concluded that coding mutations of FOXO4 should not be a common cause of the disease in women from the Tunisian population. However, this study cannot exclude that FOXO4 dysfunctions, originated from open reading frame or promoter sequence variations, might be associated with the pathogenesis of the disease in other ethnical groups.

Análise das mutações C282Y e H63D no gene da proteína HFE em pacientes com hiperferritinemia

Hereditary Hemochromatosis (HH) is a genetic disease caused by high iron absorption and deposition in several organs. This accumulation results in clinical disturbances such as cirrhosis, arthritis, cardiopathies, diabetes, sexual disorders and skin darkening. The H63D and C282Y mutations are well defined in the hemochromatosis etiology. The aim of this paper was that of identifying the H63D and C282Y genetical mutations in the hemochromatosis gene and the frequency assessment of these mutations in the HFE protein gene in patients with hyperferritin which are sent to the DNA Center laboratory in Natal, state of Rio Grande do Norte. This paper also evaluates the HH H63D and C282Y gene mutations genotype correlation with the serum ferritin concentration, glucose, alanine aminotransferasis, aspartato aminotransferasis, gama glutamil transferasis and with the clinical complications and also the interrelation with life habits including alcoholism and iron overload. The biochemical dosages and molecule analyses are done respectively by the enzymatic method and PCR with enzymatic restriction. Out of the 183 patients investigated, 51,4% showed no mutation and 48,6% showed some type of mutation: 5,0% were C282Y heterozygous mutation; 1,1%, C282Y homozygous mutation; 31%, H63D heterozygous mutation; 8,7%, H63D homozygous mutation; and 3,3%, heterozygous for the mutation in both genes. As to gender, we observed a greater percentage of cases with molecular alteration in men in relation to women in the two evaluated mutations. The individuals with negative results showed clinical and lab signs which indicate hemochromatosis that other genes could be involved in the iron metabolism. Due to the high prevalence of hemochromatosis and taking into account that hemochromatosis is considered a public health matter, its gravity being preventable and the loss treatment toxicity, the early genetic diagnosis is indicated, especially in patients with high ferritin, and this way it avoids serious clinical manifestations and increases patients' life expectation. Our findings show the importance of doing such genetic studies in individuals suspected of hereditary hemochromatosis due to the high incidence of such a hereditary disease in our region

Perfil de habilidades de comunicação de dois irmãos com a Síndrome Alcoólica Fetal

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Características clínicas, comportamentais, cognitivas e comunicativa na síndrome Smith-Magenis

TEMA: o objetivo deste estudo foi descrever os aspectos clínico, comportamental, cognitivo e comunicativo de indivíduos com o diagnóstico genético da Síndrome Smith-Magenis. PROCEDIMENTOS: participaram dois indivíduos do sexo masculino, de nove e 19 anos. Realizou-se a avaliação genética clínica e laboratorial (teste FISH, utilizando sonda para região 17p11.2). A avaliação psicológica constou da observação comportamental e aplicação da Escala Wechsler de Inteligência. A avaliação Fonoaudiológica foi realizada por meio de procedimentos formais e informais e avaliação auditiva periférica. RESULTADOS: a análise genética clínica evidenciou as características fenotípicas da síndrome Smith-Magenis, confirmada pela avaliação laboratorial. A avaliação psicológica evidenciou o fenótipo comportamental peculiar da síndrome Smith-Magenis e comprovou a deficiência intelectual de grau moderado nos dois indivíduos. A avaliação fonoaudiológica mostrou alterações no desempenho linguístico, com alterações nos níveis fonológico, semântico, sintático e pragmático e nas habilidades psicolinguísticas, interferindo nas habilidades comunicativas e de aprendizagem. A avaliação auditiva indicou audição periférica dentro de parâmetros de normalidade. CONCLUSÃO: a avaliação multidisciplinar favoreceu a descrição dos aspectos clínicos, comportamentais, cognitivos que pertencem ao fenótipo comportamental da síndrome Smith-Magenis e permitiu verificar que estes apresentam graves alterações da linguagem oral, das habilidades psicolinguísticas e do processamento das informações visuais e auditivas com reflexos marcantes no desenvolvimento das habilidades comunicativas e processos de aprendizagem.

Análise quantitativa do tempo de trânsito oral e faríngeo em síndromes genéticas

Pós-graduação em Fonoaudiologia - FFC