Desnaturação de alta resolução aplicada ao diagnóstico genético de miocardiopatia hipertrófica

Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

A Miocardiopatia Hipertrófica (MH) é uma doença genética complexa do miocárdio com um padrão de transmissão autossómico dominante e uma prevalência de 1:500, sendo a principal causa de morte súbita em jovens e atletas. É histologicamente caracterizada por uma hipertrofia e desarranjo da arquitectura tecidular a nível dos cardiomiócitos acompanhada por fibrose intersticial. Mais de 30 genes foram já associados ao desenvolvimento de MH, incluindo os genes sarcoméricos ACTC1, MYBPC3, MYH6, MYH7, MYL2, MYL3, TNNC1, TNNI3, TNNT2, TPM1 e TTN. Actualmente, o diagnóstico genético desta patologia é efectuado por sequenciação automática (SA), estando limitado à análise de apenas cinco genes, dado os consideráveis custos associados e o elevado número de genes e mutações envolvidas na MH. Neste contexto surge a plataforma de aplicação em larga escala, Desnaturação de Alta Resolução (HRM). Esta plataforma permite a detecção de qualquer tipo de alteração em sequências de DNA em cadeia dupla, de modo eficiente e mais económico, tendo já resultados comprovados noutras patologias. Neste trabalho, pretendeu-se validar a aplicação da técnica de HRM ao diagnóstico genético de MH, e estudando um pequeno grupo de pacientes de MH. Para tal, foram construídos e testados no termociclador LightCycler 480® 195 pares de primers para a amplificação por PCR das regiões codificantes de 24 genes associados a MH, tendo sido atingidas as condições reaccionais óptimas para aproximadamente 75% destes. Estas condições foram seguidamente aplicadas para o estudo genético de 22 indivíduos com fenótipo, suspeita clínica ou história familiar de MH. Foram analisadas por HRM 62 regiões genómicas em 12 genes associados a MH, tendo sido detectadas 41 alterações. Destas, foram confirmadas por SA três novas mutações missense nos genes TNNT2 (c.722 A>T (p.Lys241Met)), MYH7 (c.671 A>T (p.Asn224Ile)) e MYBPC3 (c.817 C>T (p.Arg273Cys)); seis variantes silenciosas nos genes MYBPC3, MYH7 e CSRP3; um SNP raro anteriormente descrito e de significado desconhecido no gene MYBPC3 e uma alteração intrónica no gene TNNI3. Aguardam-se ainda vários resultados de SA. Até à data com uma taxa de falsos positivos de 0%, a técnica de HRM diminuiu drasticamente a necessidade de SA, diminuindo os custos para o paciente e tempo de espera dos resultados. Esta técnica pode assim ser considerada uma excelente estratégia de diagnóstico de patologias complexas como é exemplo a MH.